CP基因3'端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性

【目的】探明马铃薯Y病毒脉坏死株系（PVYN）CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生RNA介导抗性的有效性。【方法】以PVYN的CP基因cDNA 3′端202 bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。【结果】攻毒试验表明前者没有一例转基因植株表现为抗病，而转化反向重复结构的转基因植株82.8%表现近似免疫的高度抗病型，Southern印迹杂交证明目的基因已整合到烟草基因组，Northern印迹杂交结果显示反向重复结构转基因植物的抗病性与RNA的表达量呈现负相关。【结论】抗病性是RNA介导的病毒抗性。3′端短片段诱导产生的转基因抗病株比例比5′端短片段诱导产生的高。     

hrpZPsg12转基因烟草及其抗性评价

【目的】将来源于大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)Psg12菌株的hrpZPsg12基因导入烟草"云烟87",对转化植株进行烟草普通花叶病毒(TMV)、烟草马铃薯Y病毒(PVY)和烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)的抗病性鉴定,为培育多抗烟草新品系奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法,将hrpZPsg12基因转入烟草"云烟87"中,对T0和T1代转基因植株进行PCR检测、Southern杂交,并对T1代转基因植株的抗病性进行评价。【结果】hrpZPsg12基因成功转入"云烟87"中,PCR检测表明共获得7株T0代阳性植株、35株T1代阳性植株。对T1代PCR阳性植株进行Southern检测,表明外源目的基因hrpZPsg12已经整合进烟草基因组中,并可在转基因后代植株中稳定遗传。抗病性测定表明,T1代转基因烟草对TMV和PVY表现高抗,对烟草野火病表现中抗。【结论】获得了高抗TMV和PVY及中抗烟草野火病菌的转hrpZPsg12基因植株20和15株。     

抗TMV、CMV转基因烟草的初步选育

将烟草花叶病毒复制酶54 KD蛋白基因构建到质粒pSSZ32.54K,导入根癌农杆菌EHA105株系,用农杆菌介导的叶盘法转化含CMV CP基因的纯合系烟草,获得了含CMV CP基因和TMV RepE基因的转基因烟草,以及只含TMV RepE基因的转基因烟草.以繁殖于新鲜普通烟叶片上的TMV为毒源,机械摩擦接种含双基因的烟草和只含CMV CP基因的烟草.接种15 d后,观察植株发病情况,发现转双基因的烟草无花叶症状出现,而对照植株(只含CMV CP基因)出现花叶症状.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测病毒含量,发现转基因植株体内无病毒积累,而对照植株体内有病毒积累.因此,含RepE基因的烟草对TMV有一定抗性.     

CP基因3''''端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性

目的探明马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVYN)CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生RNA介导抗性的有效性。方法以PVYN的CP基因cDNA3′端202bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。结果攻毒试验表明前者没有一例转基因植株表现为抗病,而转化反向重复结构的转基因植株82.8%表现近似免疫的高度抗病型,Southern印迹杂交证明目的基因已整合到烟草基因组,Northern印迹杂交结果显示反向重复结构转基因植物的抗病性与RNA的表达量呈现负相关。结论抗病性是RNA介导的病毒抗性。3′端短片段诱导产生的转基因抗病株比例比5′端短片段诱导产生的高。     

转病毒移动蛋白及复制酶基因烟草的协生和重组风险分析

 对转化番茄花叶病毒 (ToMV)、烟草花叶病毒 (TMV)移动蛋白 (MP)基因和黄瓜花叶病毒P1株系(CMV P1)部分复制酶基因的 3种转基因烟草 ,分别接种马铃薯X病毒 (PVX)、马铃薯Y病毒 (PVY)、CMVRB株系 (CMV RB)和TMV。症状观察和ELISA测定发现 ,各病毒在转基因烟草和非转基因烟草上的症状及病毒浓度没有显著差异 ,表明这些病毒在转基因烟草上没有协生作用发生。对转化ToMVMP基因和转化CMV P1部分复制酶基因的转基因烟草 ,分别接种TMV和CMV RB ,定期进行生物学、ELISA和免疫捕获反转录PCR(IC RT PCR)检测 ,在 16个月的连续测定中未发现病毒重组现象。     

苋色藜NDR1基因抗病毒特性初步研究

以抗病毒植物苋色藜为材料,克隆拟南芥NDR1的同源基因,确定其亚细胞定位及该基因表达和抗病毒特性分析,为转基因抗病育种奠定技术基础。根据苋色藜转录组测序分析结果,采用RT\|PCR克隆获得两个与拟南芥同源的NDR1基因,分别命名为CaNDR1a和CaNDR1b,并通过实时定量PCR分析病毒侵染后基因的表达情况;构建植物瞬时表达载体,发现CaNDR1a和CaNDR1b定位于细胞膜;构建CaNDR1a和CaNDR1b植物表达载体,遗传转化获得转基因烟草,经酶联免疫吸附测定（ELISA）分析T1代植株对烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）的抗性。生物信息学分析揭示CaNDR1a和CaNDR1b是NDR1的同源基因。CaNDR1a和CaNDR1b在苋色藜接种TMV和CMV后显著上调表达。CaNDR1a和CaNDR1b定位于细胞膜上,并且病毒对CaNDR1a和CaNDR1b的胞内定位没有影响。ELISA结果显示部分转基因株系对TMV和CMV的抗性增加。初步表明CaNDR1a和CaNDR1b是拟南芥NDR1的功能性同源基因,参与植物对病毒的内源免疫反应。     

转烟草花叶病毒复制酶基因烟草的病毒抗性研究

对用根瘤农杆菌双质粒法导入烟草花叶病毒复制酶基因的转基因烟草后代的研究表明：转基因烟草抗烟草花叶病毒和马铃薯Ｘ病毒,但感染马铃薯Ｙ病毒,抗病毒的转基因烟草存在某种机制限制着病毒在植株内的转移,转烟草花叶病毒复制酶基因烟草植株内不产生该复制酶,其抗病毒的确切机制有等进一步研究。     

不同方法脱除菊花体内3种病毒效果的研究

【目的】探讨脱除菊花体内菊花B病毒(CVB)、黄瓜花叶病毒(CMV)及烟草花叶病毒(TMV)3种病毒的最佳方法。【方法】以菊花品种"墨菊"为材料,采用茎尖培养法、病毒唑结合茎尖培养法及热处理结合茎尖培养法对脱除CMV、CVB、TMV的效果进行研究,其中病毒唑结合茎尖培养法采用L9(34)正交试验,对茎尖长度、病毒唑质量浓度及处理时间进行筛选,热处理结合茎尖培养法中热处理采用昼夜变温并逐步升温的方式。【结果】茎尖培养法中以长度为0.4～0.5mm茎尖的脱毒效果最佳,茎尖成活率为66.7%,CMV、CVB、TMV 3种病毒的脱毒率分别为61.9%,63.2%,55.0%;病毒唑结合茎尖培养法中以茎尖长度为0.4～0.5mm、病毒唑质量浓度为10mg/L、处理时间为42d组合的脱毒效果最佳,茎尖成活率为53.3%,CMV、CVB、TMV 3种病毒的脱毒率分别为88.2%,86.7%,81.3%;热处理结合茎尖培养法中以试管苗热处理60d后,剥取长度为0.4～0.5mm的茎尖进行培养的脱毒效果最佳,茎尖成活率为56.7%,CMV、CVB、TMV 3种病毒的脱毒率分别为100.0%,100.0%,94.1%。【结论】3种脱除菊花体内病毒的方法中,热处理结合茎尖培养法的脱毒效果最佳。     

3种大白菜病毒多重RT-PCR检测技术的建立

【目的】建立3种大白菜病毒病多重RT-PCR检测技术,为病毒病快速检测、白菜病毒病防治与抗病育种提供参考。【方法】针对我国大白菜芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)3种病毒的外壳蛋白(CP)基因保守区序列,设计特异性检测引物,从多重RT-PCR(mRT-PCR)扩增引物、Mg~(2+)浓度、Taq DNA聚合酶及dNTPs浓度、退火温度、延伸时间和循环次数等方面对RT-PCR检测技术进行优化。【结果】在dNTPs浓度为0.24 mmol/L,Mg2+浓度为2.8mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度为0.12U/μL,退火温度为52℃,延伸时间为30s,循环30次,即可成功地在一个体系中对TuMV、TMV和CMV 3种病毒复合侵染的大白菜病样进行多重RT-PCR扩增,扩增得到228,305和460bp3条特异性条带,其大小与试验设计相符合。灵敏度接近单重RT-PCR(sRT-PCR),体现了多重RT-PCR的优越性。【结论】建立了能同时检测大白菜样品中TuMV、TMV和CMV的多重RT-PCR检测体系,该多重RT-PCR方法能对田间大白菜样品进行3种病毒的准确、快速、高效检测。     

ChIFN-α基因在烟草中的表达及转基因烟草对TMV的抗性

动物α干扰素具有高效广谱的抗病毒作用,通过农杆菌介导法将35S驱动的干扰素基因ChIFN-α转化烟草,Southern杂交和Western杂交进行目的基因的转化、表达检测,重组蛋白的数量通过ELISA测定,对获得的转基因烟草植株进行TMV接种实验,结果表明ChIFN-α基因的转化赋予了转基因烟草对TMV的抗性,进一步的荧光定量PCR差异表达检测结果表明,该抗性可能与转基因烟草体内防卫基因PR-la、抗病N基因和信号转导MAPK基因受到上调表达有关。     

番茄双抗TMV和CMV基因工程的研究

在ＴＭＶ外壳蛋白（ＣＰ）基因的５′和３′端分别合成寡聚核苷酸引物Ｐ１和Ｐ２，并分别引入ＣｌａＩ和ＢａｍＨＩ位点，采用ＰＣＲ技术扩增ＴＭＶＣＰ基因，用ＣｌａＩＢａｍＨＩ消化后重组到ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＫＳ＋中，并将该基因与ＣＭＶＣＰ基因重组在同一个表达载体ｐＥ３上获得双价ＣＰ基因表达载体ｐＥＴＣ２，转化番茄，获得再生植株。通过点杂交、ＰＣＲ检测和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，证实２、１２和１３号为转ＴＭＶ和ＣＭＶＣＰ基因的工程植株。工程植株在温室中表现正常，比对照植株表现出明显的抗性。     

Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene

A chimeric gene containing a cloned cDNA of the coat protein (CP) gene of tobacco mosaic virus (TMV) was introduced into tobacco cells on a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens from which tumor inducing genes had been removed. Plants regenerated from transformed cells expressed TMV mRNA and CP as a nuclear trait. Seedlings from self-fertilized transgenic plants were inoculated with TMV and observed for development of disease symptoms. The seedlings that expressed the CP gene were delayed in symptom development and 10 to 60 percent of the transgenic plants failed to develop symptoms for the duration of the experiments. Increasing the concentration of TMV in the inoculum shortened the delay in appearance of symptoms. The results of these experiments indicate that plants can be genetically transformed for resistance to virus disease development.     

高效靶向降解烟草花叶病毒核酸的dsRNA筛选与大量制备

【目的】筛选高效靶向降解烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）的dsRNA,实现其大量制备,并探究其作用机制。【方法】以TMV编码的CP、MP、RdRP功能基因为靶序列,体外转录合成相应的dsRNA,浸润本氏烟（Nicotiana benthamiana）,24 h后接种TMV,于接毒后2、3 d取样提取总RNA和蛋白质,以CP基因mRNA水平和蛋白水平为指标,结合TMV病毒生物学症状,综合评价各dsRNA对TMV的抑制效果。同时结合侵染性克隆TMV-30B在本氏烟烟株上的荧光表达现象和TMV在三生烟（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）上的过敏性坏死反应（hypersensitive necrosis reaction）,通过比较TMV基因组上6个靶序列相对应的dsRNA,筛选出高效抑制TMV的dsRNA片段。为了获取大量的dsRNA,将dsRNA对应的基因片段插入到原核表达载体L4440的双T7启动子之间,转化至RNase III缺陷型大肠杆菌（Escherichia coli）HT115（DE3）中,并对原核表达制备的dsRNA喷施烟草后生成的siRNA进行深度测序,比较外源施用dsRNA后,对TMV侵染的small RNA表达特征和富集带的影响。【结果】筛选出高效影响TMV CP基因表达的dsRNA RdRP1461-1774,并构建了可诱导形成目的dsRNA的原核表达载体L4440-dsRdRP1461-1774,可在DE3中大量制备RdRP1461-1774的dsRNA,菌液中提取的dsRNA喷施于烟草上对TMV的防治效果显著。TMV-30B侵染本氏烟时荧光数量减少,并能够延长叶片萎蔫时间,在三生烟上施用时叶片枯斑数量明显减少。小RNA测序结果显示TMV侵染引起的RNAi过程中正义链和反义链以大致相等的频率产生siRNA,而外源性dsRNA的浸润会引起靶向区域siRNA的富集,siRNA反义链累积量骤增,对应的正义链累积量骤减,外源dsRNA的施用能够引起siRNA表达丰度的变化。【结论】通过比较dsRNA介导植物靶向抗TMV侵染的效果来筛选抗烟草花叶病毒的dsRNA序列,最终选定TMV RdRP基因上一段长313 bp的高效作用片段,该片段dsRNA能够高效与靶基因结合,降低染病植株烟草花叶病毒的表达量。同时构建了RdRP1461-1774基因的dsRNA原核表达系统,实现其低成本的高效量产,为后续dsRNA在植物病毒方面的防治应用打下了基础。     

烟草骨干亲本主要病毒病抗性鉴定及遗传多样性分析

【目的】评价烟草骨干亲本主要病毒病抗性,分析抗病骨干亲本间的遗传多样性,明确不同抗源间的亲缘关系,为烟草病毒病抗性改良的亲本选择提供理论依据。【方法】在温室条件下采用苗期人工接种方法,对中国烟草育种过程中73份骨干亲本进行CMV、TMV和PVY 3种病毒病抗性鉴定,以CMV高抗、或TMV免疫、或PVY免疫为筛选标准,筛选抗病骨干亲本;并利用条带单一清晰、多态性稳定且分布在烟草24条连锁群上的103对SSR引物,对筛选出的抗病骨干亲本和烟草育种常用的4个主体优质亲本进行遗传多样性、聚类和主坐标分析。【结果】（1）不同供试材料间3种病毒病抗性存在显著性差异。在筛选出的29份病毒病高抗或免疫的烟草种质中,有23份种质对CMV表现为高抗,6份种质对TMV表现为免疫,5份种质对PVY表现为免疫。同时,在29份筛选出的烟草病毒病抗病种质中,龙烟1号和FC8对TMV和PVY都表现为免疫,CV87、T.T.11、抗88、CV91、胎里富1060、革新5号和T.I.245等7份种质对3种病毒病都表现为高抗。（2）对鉴定出的29份抗病骨干亲本以及K326、NC89、Speight G-28和净叶黄等4个烟草育种最常用主体亲本进行基因型分析,共筛选出322个等位位点,每对引物的等位变异为2-6个,平均为3.106个;基因型多样性变化范围是0.059-0.716,平均为0.387;引物多态性信息（PIC）含量为0.057-0.661,平均为0.343。当遗传相似系在0.672取值作切割线时,系统聚类分析将33份供试材料分为7个类群;当遗传相似系数在0.714取值作切割线时,第1类群又被分为4个亚群,其中第1亚群包括了全部供试外引抗病亲本种质和育种最常用外引亲本K326、NC89和Speight G-28,而国内抗病亲本种质分类相对较多。主坐标分析可将33份材料分为6个类群,外引抗病种质被分在第1类群和第2类群中,其中第1类群包括了8份引进抗病亲本种质和3份育种最常用外引亲本K326、NC89和Speight G-28,第2类群有3份外引种质和11份国内种质;而国内抗病亲本种质分类较多。聚类分析结果和主坐标分析结果基本一致,与种质亲缘关系吻合度较高。【结论】苗期人工接种方法对烟草骨干亲本的病毒病抗性鉴定准确,筛选出29份烟草病毒病抗病骨干亲本;外引抗病骨干亲本种质与K326、NC89和Speight G-28的亲缘关系较近,遗传背景狭窄;中国抗病种质地理来源广泛,遗传背景复杂,遗传基础较为丰富。     

云南省烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析

以从云南省主要烟区烟草上分离到的烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）的RNA为模板,采用RT-PCR技术,对TMV云南分离物（TMV-YN）的外壳蛋白（Coat protein,CP）基因及3’端非编码区和CMV云南分离物（CMV-YNa）的CP基因进行了cDNA克隆和序列测定。结果表明,TMV-YN的cDNA全长684个碱基（EMBL登录号为AJ239099）,通过GenBank进行同源性比较发现：其5'端的480个碱基为CP基因,编码159个氨基酸;3'端的204个氨基酸为非编码区;此CP基因与TMV-U1株系和TMV韩国普通株系核苷酸同源性均为100%。CMV-YNa的CP基因全长657个碱基（EMBL登录号为AJ239098）,编码218个氨基酸;此CP基因与CMV亚组 I 的CMV-RB株系、CMV-117F株系和CMV-Y株系的核苷酸同源性分别为96%、93%和92%。     

受PVY诱导的烟草天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp的克隆与分析

【目的】通过筛选并克隆烟草抗马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)相关基因,分析其在不同诱导时间的相对表达量,揭示烟草抗病毒诱导的分子机理,以期为烟草抗病毒病育种奠定基础。【方法】通过抑制差减杂交和cDNA芯片从PVY诱导的抑制差减杂交文库中筛选上调表达(Ratio2)的基因中间片段,用RACE技术克隆其cDNA全长,并利用实时荧光定量PCR分析其在不同诱导时期的相对表达量。【结果】从受PVY诱导的烟草叶片中筛选一条595bp的基因中间片段并克隆得到一个全长为1770bp的天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp(GenBank登录号为GU144571),该基因编码506个氨基酸。多序列比对结果显示,该基因的编码产物与其它植物天冬氨酸蛋白酶家族成员具有高度的同源性,具有植物天冬氨酸蛋白酶典型的结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,Ntasp在PVY接种早期上调表达。【结论】克隆得到一个烟草天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp,其表达受PVY侵染诱导。