不同温度下TMV侵染枯斑三生烟的LncRNA差异表达

【目的】 筛选不同温度下烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）侵染后枯斑三生烟（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）差异表达的长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）,研究lncRNA在枯斑三生烟抗性反应中的作用。【方法】 N基因的温度敏感性使枯斑三生烟在25℃时具备对TMV的抗性、在31℃抗性丧失,在这两个温度条件下对枯斑三生烟接种TMV和磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline,PBS）,48 h后提取系统叶总RNA,构建链特异性文库后进行深度测序。对测序结果进行过滤后利用HTSeq将有效数据与近缘品种TN90（N. tabacum var. TN90）基因组比对,筛选得到lncRNA后利用FPKM法估计lncRNA的表达水平。通过edgeR筛选差异表达lncRNA（differentially expressed lncRNA,DElncRNA）,并利用qRT-PCR技术对这一结果进行验证。通过共定位及共表达分析预测DElncRNA的靶基因,通过参考基因组注释、GO和KEGG富集分析研究靶基因的功能。【结果】 4个处理共12个样本经lncRNA-seq各测得约8 000万条clean reads,共获得4 737条已知lncRNA、40 169条新lncRNA。其中64个lncRNA在不同温度条件下TMV侵染后存在差异表达,qRT-PCR测定结果显示这些lncRNA的测序正确率在80%左右,表明本研究所得测序数据具备较高的可信度。对DElncRNA进行靶基因预测,发现一些基因同时被25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶向。靶基因注释功能丰富,主要参与植物抗病、激素和代谢等生理过程。部分可能与激素通路相关的lncRNA,在25℃下TMV侵染时呈现下调趋势,而在31℃下TMV侵染则呈现上调趋势。GO富集分析显示靶基因主要参与构成膜、囊泡等组分,具备钙、钾离子通道抑制剂活性等分子功能,使相应离子得以转运引发随后的反应,同时也参与发病、抗原加工和呈现、细胞分裂素代谢等生理过程。KEGG分析发现靶基因显著富集在植物激素信号转导通路,25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶基因同时富集在激素信号传导、ABC运输蛋白、苯丙烷类生物合成等通路。【结论】 不同温度（25℃和31℃）条件下TMV侵染枯斑三生烟后,长链非编码RNA差异表达,DElncRNA通过作用于激素信号传导、物质转运等过程参与寄主系统获得性抗性反应。研究结果可为揭示植物系统获得性抗性中lncRNA的调控功能以及新型抗病毒技术开发提供依据。     

蒙氏假单胞菌3A菌株对烟草漂浮育苗中TMV的钝化效果

选用对烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus(TMV)具有显著拮抗活性的蒙氏假单胞菌Pseudomonas monteilii3A菌株对烟草漂浮育苗过程中被TMV污染的育苗棚、育苗盘、基质及剪叶机械等进行生物钝化,并利用real-time RT-PCR对污染基质中TMV的含量进行了定量检测。结果显示,200、400倍及600倍P.monteilii 3A菌悬液稀释液均可显著钝化病苗残留干叶及干根中的TMV;剪叶机械经不同稀释倍数的P.monteilii 3A菌悬液处理后,在一定程度上抑制了TMV的发生,相对防效达51.42%~100%;基质经不同稀释倍数的P.monteilii 3A菌悬液处理后,其中TMV的含量也下降了72.73%~88.46%,对TMV的相对防效达61.56%~87.46%。其中,200倍P.monteilii 3A稀释液处理育苗棚、育苗盘20min以上,浸泡剪叶机械1min以上对TMV钝化效果最好。     

热量资源配置对甘肃烤烟生育期及品质的影响

为探索甘肃烤烟的适宜移栽时期,以当地烤烟主栽品种秦烟96为供试材料,采用田间随机区组小区试验研究不同移栽期对烤烟生育期和品质的影响。结果表明,与正常移栽相比较,正宁县和徽县植烟区提前烤烟移栽期处理明显缩短了烤烟大田生育期;2个植烟县提前20 d移栽期处理都显著提高了上等烟比例;与正常移栽相比,正宁县植烟区提前10、20 d移栽处理显著降低了中部烟叶烟碱含量,而徽县植烟区差异不显著;2个植烟区提前移栽期处理烤烟中部烟叶感官质量差异不显著,但都好于正常移栽处理。以上研究结果推论,秦烟96在正宁县植烟区最佳烤烟移栽期为4月23日,在徽县植烟区最佳烤烟移栽期为4月25日,适宜移栽期具有更加合理的气候资源配置,进而提高烟叶产量和品质。     

高效靶向降解烟草花叶病毒核酸的dsRNA筛选与大量制备

【目的】筛选高效靶向降解烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）的dsRNA,实现其大量制备,并探究其作用机制。【方法】以TMV编码的CP、MP、RdRP功能基因为靶序列,体外转录合成相应的dsRNA,浸润本氏烟（Nicotiana benthamiana）,24 h后接种TMV,于接毒后2、3 d取样提取总RNA和蛋白质,以CP基因mRNA水平和蛋白水平为指标,结合TMV病毒生物学症状,综合评价各dsRNA对TMV的抑制效果。同时结合侵染性克隆TMV-30B在本氏烟烟株上的荧光表达现象和TMV在三生烟（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）上的过敏性坏死反应（hypersensitive necrosis reaction）,通过比较TMV基因组上6个靶序列相对应的dsRNA,筛选出高效抑制TMV的dsRNA片段。为了获取大量的dsRNA,将dsRNA对应的基因片段插入到原核表达载体L4440的双T7启动子之间,转化至RNase III缺陷型大肠杆菌（Escherichia coli）HT115（DE3）中,并对原核表达制备的dsRNA喷施烟草后生成的siRNA进行深度测序,比较外源施用dsRNA后,对TMV侵染的small RNA表达特征和富集带的影响。【结果】筛选出高效影响TMV CP基因表达的dsRNA RdRP1461-1774,并构建了可诱导形成目的dsRNA的原核表达载体L4440-dsRdRP1461-1774,可在DE3中大量制备RdRP1461-1774的dsRNA,菌液中提取的dsRNA喷施于烟草上对TMV的防治效果显著。TMV-30B侵染本氏烟时荧光数量减少,并能够延长叶片萎蔫时间,在三生烟上施用时叶片枯斑数量明显减少。小RNA测序结果显示TMV侵染引起的RNAi过程中正义链和反义链以大致相等的频率产生siRNA,而外源性dsRNA的浸润会引起靶向区域siRNA的富集,siRNA反义链累积量骤增,对应的正义链累积量骤减,外源dsRNA的施用能够引起siRNA表达丰度的变化。【结论】通过比较dsRNA介导植物靶向抗TMV侵染的效果来筛选抗烟草花叶病毒的dsRNA序列,最终选定TMV RdRP基因上一段长313 bp的高效作用片段,该片段dsRNA能够高效与靶基因结合,降低染病植株烟草花叶病毒的表达量。同时构建了RdRP1461-1774基因的dsRNA原核表达系统,实现其低成本的高效量产,为后续dsRNA在植物病毒方面的防治应用打下了基础。