CP基因3''''端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性

目的探明马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVYN)CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生RNA介导抗性的有效性。方法以PVYN的CP基因cDNA3′端202bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。结果攻毒试验表明前者没有一例转基因植株表现为抗病,而转化反向重复结构的转基因植株82.8%表现近似免疫的高度抗病型,Southern印迹杂交证明目的基因已整合到烟草基因组,Northern印迹杂交结果显示反向重复结构转基因植物的抗病性与RNA的表达量呈现负相关。结论抗病性是RNA介导的病毒抗性。3′端短片段诱导产生的转基因抗病株比例比5′端短片段诱导产生的高。     

多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育

 【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒（PVY）、烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）全长衣壳蛋白（CP）基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3′端长度100 bp、TMV CP 3′端长度100 bp和CMV CP 3′端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因,并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89,然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得276株转基因烟草。Southern和Northern blot分析表明,外源基因以不同拷贝数整合于烟草基因组中;不同转基因植株中病毒RNA的积累量存在显著差异。抗病性检测显示：23%左右的转基因植株表现出对3种病毒侵染的抗性。对转基因植株扩繁后代和T1代的抗性分析表明：多病毒抗性表现稳定。【结论】利用RNA介导的抗病毒基因工程可获得同时抗多种病毒的转基因烟草,其抗病性在T0代扩繁植株和T1代植株中得到稳定遗传。     

海岛棉GbNPR1基因全长cDNA的克隆及其在烟草中的表达

【目的】为棉花抗黄萎病基因工程育种提供新的基因源。【方法】以海岛棉为材料，利用同源序列法和RACE技术克隆海岛棉中SAR途径的主要抗病信号元件NPR1(none expresser of PR gene)的全长cDNA序列。【结果】推导的氨基酸序列与已知NPR1的同源性较低（39%～57%），但在功能区的同源性较高（79.2%），GbNPR1蛋白中含有BTB和锚蛋白重复序列结构域，且在起始密码子上游存在2个W框。在拟南芥中，A.tNPR1起始密码子上游有3个W框，对诱导NPR1的表达和激活NPR1介导的植物防卫反应至关重要，锚蛋白重复序列则是NPR1实现其功能必不可少的。构建了组成型植物表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，转基因植株经PCR和Southern杂交检测，表明目的基因已整合到烟草基因组中。离体叶片接种法对转基因烟草进行抗病性鉴定，表明对烟草赤星病菌（Alternaria alternata）的抗性有明显提高。转基因烟草经T1代遗传分析发现，基因以单拷贝插入。【结论】本研究得到的基因为海岛棉中NPR1的同源基因。     

大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1的克隆及功能分析

【目的】获得大豆疫霉根腐病抗性相关基因,为培育大豆抗病品种提供理论依据。【方法】在以大豆抗病品种绥农10构建的受疫霉菌诱导后差异表达的cDNA消减文库的基础上,选取文库中一条与其它植物的DR1基因具有较高同源性且上调表达的EST序列。通过RT-PCR方法从绥农10中克隆该基因,并构建到植物表达载体pCAMBIA3301上,以感病品种东农50的子叶节为外植体通过根癌农杆菌介导的方法进行大豆遗传转化。【结果】该基因全长805 bp,开放读码框为471 bp,编码156个氨基酸,在此命名为SDR1。遗传转化获得转基因PCR鉴定阳性植株5株,Real-time PCR检测T1转基因植株较非转基因植株SDR1表达量提高20倍以上的有3株,经Southern杂交分析表明,出现杂交信号的有3株。经离体叶片接种大豆疫霉菌,转基因大豆的抗性较非转基因大豆明显提高。【结论】成功克隆了大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1,并通过对过量表达的大豆转基因植株的抗病性鉴定初步确定了SDR1的抗病功能。     

基于花粉介导法转化的玉米自交系抗病植株的获得

【研究目的】将几丁质酶基因导入玉米自交系,获得抗玉米丝黑穗病的转基因植株。【方法】采用花粉介导法进行转化,获得的种子及后代植株检测方法包括：潮霉素抗性筛选、PCR扩增、Southern blot杂交分析以及田间抗病鉴定。【结果】通过转化获得种子43粒,对种子进行潮霉素抗性筛选得到9株抗潮霉素植株;经PCR检测,Southern blot杂交分析得到5株转基因植株。田间抗病鉴定结果显示,转基因植株或株系的丝黑穗病抗性提高1～2级。【结论】花粉介导法转化玉米自交系是获得抗病育种材料的一条快捷、有效的途径。     

羽衣甘蓝的BoRACK1基因抗病性分析

【目的】RACK1可与多种信号分子相互作用并影响不同的信号转导途径,可能参与了植物在生物和非生物逆境胁迫中的多种应答。【方法】为研究羽衣甘蓝RACK1对抗病性中的功能,通过农杆菌介导的遗传转化方法获得转化植株,并对3个独立转基因株系进行抗逆性分析。【结果】接种后转基因植株表现明显的抗病表型,抗病防御相关基因和表达量显著高于野生型。【结论】RACK1基因在羽衣甘蓝抗病过程中具有正调控作用,通过上调逆性相关基因的表达量增强抗逆性。     

转harpinXooc蛋白编码基因hrf2对油菜抗菌核病的影响

【目的】尝试利用转基因方法提高油菜抗病性。【方法】将来自水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola）编码harpinXooc蛋白的hrf2基因插入植物表达载体pCAMBIA1301中,构建了植物重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2。由根癌农杆菌LBA4404介导,将重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2转化甘蓝型油菜杨油4号子叶节。【结果】获得了抗潮霉素的再生转基因油菜植株,经PCR,RT-PCR和GUS染色检测证明hrf2基因已整合到油菜基因组中。抗病性鉴定结果表明,转基因油菜对油菜菌核病有较好的抗性,在转基因植株叶片上油菜菌核病菌菌丝的生长受到明显抑制。【结论】利用农杆菌转化法可将hrf2基因导入油菜基因组中,并使转基因油菜对菌核病的抗性提高。     

苦豆子凝集素基因植物表达载体的构建及其对烟草的转化

[目的]了解苦豆子凝集素基因(SAL)的功能,将该基因构建到植物表达载体并转化烟草,获得转基因植株.[方法]利用RT-PCR技术,提取苦豆子总RNA进行反转录得到cDNA,通过PCR扩增得到苦豆子凝集素基因SAL,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301上,产生重组质粒pCAMBIA1301-SAL.采用农杆菌介导法将重组质粒转化烟草,并进行分析鉴定.[结果]构建了植物表达载体pCAMBIA1301-SAL,转化烟草后经筛选获得76株转基因植株,经抗性筛选及PCR和RT-PCR鉴定,其中27株显示为阳性植株.[结论]苦豆子凝集素基因已经在烟草中成功表达,为进一步研究验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础.     

植物转基因抗性策略研究进展

通过转基因技术使植物获得抗病性是控制植物病毒感染的一种重要技术途径。RNA干扰技术的出现为植物转基因抗性策略的研究提供了新思路。植物转基因抗性产生方法主要是通过表达不同的病毒蛋白(外壳蛋白、复制蛋白、运动蛋白及其他病毒蛋白)、RNAs(反义RNA、卫星RNA、缺陷干扰RNA、发夹RNA及人工微小RNA)、非病毒基因(核酸酶、抗病毒蛋白抑制子及植物体)、宿主来源的抗性基因(显性抗性基因和隐性抗性基因)及各种宿主防御反应因子等。介绍了以上几种抗性策略并分析了目前尚存在的问题,以期为植物转基因抗性策略研究的学者提供参考。     

RNAi介导抗水稻条纹病毒转基因水稻的培育

本研究根据RNA干扰的机制原理,利用已构建的包含SP基因部分片段反向重复序列和生物安全性更高的标记基因bar基因的RNAi双元表达载体pDTRSV-IRSP-Bar,通过采用农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织获得抗条纹叶枯病和抗除草剂的转基因水稻植株,通过Basta抗性筛选、PCR检测及Northernblot分析,获得了稳定高抗RSV和抗Basta的株系KRSV1和KRSV9,并对其田间抗性及农艺性状表现进行了调查研究。     

hrpZPsg12转基因烟草及其抗性评价

【目的】将来源于大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)Psg12菌株的hrpZPsg12基因导入烟草"云烟87",对转化植株进行烟草普通花叶病毒(TMV)、烟草马铃薯Y病毒(PVY)和烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)的抗病性鉴定,为培育多抗烟草新品系奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法,将hrpZPsg12基因转入烟草"云烟87"中,对T0和T1代转基因植株进行PCR检测、Southern杂交,并对T1代转基因植株的抗病性进行评价。【结果】hrpZPsg12基因成功转入"云烟87"中,PCR检测表明共获得7株T0代阳性植株、35株T1代阳性植株。对T1代PCR阳性植株进行Southern检测,表明外源目的基因hrpZPsg12已经整合进烟草基因组中,并可在转基因后代植株中稳定遗传。抗病性测定表明,T1代转基因烟草对TMV和PVY表现高抗,对烟草野火病表现中抗。【结论】获得了高抗TMV和PVY及中抗烟草野火病菌的转hrpZPsg12基因植株20和15株。     

不同启动子在转基因烟草中抗番茄黄化曲叶病毒的研究

为了提高植物对番茄黄化曲叶病毒的抗性,利用CaMV35S启动子、棉花韧皮部特异启动子PGHNBS、拟南芥韧皮部特异启动子SUC2分别构建了含有不同启动子控制下的烟粉虱内GroEL基因的植物表达载体P-Gro-EL、P-PGHNBS-GroEL、P-SUC2-GroEL。通过农杆菌介导转化法,获得了一批抗卡那霉素的转化再生烟草植株。RT-PCR结果表明,3个启动子皆驱动GroEL基因在转基因烟草中表达。对转化再生烟草的一次病毒注射侵染结果显示,共有19株抗性烟草植株,其中,转P-GroEL载体的有7株,转P-PGHNBS-GroEL和P-SUC2-GroEL载体的各有6株;2次病毒注射侵染的结果显示,获得7株抗性烟草植株,它们是转P-GroEL载体的1株、转P-PGHNBS-GroEL和P-SUC2-GroEL载体的各3株。2次接种的试验结果表明,PGHNBS和SUC2转基因烟草植株的抗病效果均比CaMV35S转基因植株明显。证明利用韧皮部特异表达GroEL基因可以获得抗番茄黄化曲叶病毒的转基因植物。     

马铃薯Y病毒6kD和NIa基因转化的烟草介导抗病性

将马铃薯Ｙ病毒中国分离株（ＰＶＹ－Ｃ）的６ｋＤ和ＮＩａ基因拼接和改造，分别构建了其正向表述和反向转录的植物表达载体。借助土壤农杆菌ＬＢＡ４４０４将在此双元载体上的６ｋＤ和ＮＩａ基因及新霉素磷酸转移酶基因（ＮＰＴⅡ）转入到烟草品种ＮＣ８９的染色体上，从而获得了抗卡那霉素的转化再生烟草植株。用ＰＶＹ－Ｃ对这些转化烟草进行抗性接种试验，结果表明部分转基因植株能够抵制ＰＶＹ－Ｃ的侵染，对抗病植株的子一代（Ｒ１）进行进一步的抗性分析发现，其Ｒ１代通过遗传也获得了这种抗病性。     

双链RNA激发的植物基因沉默及其在植物育种上的应用

在生物体内,存在大量的非编码RNA(ncRNA),小干扰RNA(siRNA)是其中一种,由双链RNA切割形成,能干扰基因表达,激发转录后的基因沉默。尽管双链RNA干扰是把基因"敲低"而不是"敲除",但它的高效和易操作性使之成为研究植物基因功能的有用工具,并通过转基因途径用于植物改良。与反义RNA技术和共抑制技术相比,RNA干扰对基因的沉默效率高,效果稳定。单基因RNA干扰就可调控多基因家族控制的农艺性状,而不必累积单基因突变。把病毒基因构建成反向重复结构转入植物体内,其转录出的RNA会通过分子内序列互补形成双链结构,激发转基因植物的RNA干扰机制,将入侵病毒的同源序列降解,使转基因植株获得对病毒的抗性。RNA干扰型抗病毒转基因植株中,转病毒基因的mRNA不存在或存在量很少,也不会翻译成有功能的病毒蛋白质,因此不存在病毒RNA重组、异源包装及协生作用的潜在生物风险,具有较高的生物安全性。     

超表达水稻MGD基因(OsMGD)烟草植株的耐低磷胁迫能力

【目的】研究超表达OsMGD基因烟草植株在低磷条件下的生长情况,为明确OsMGD基因对植物耐低磷胁迫的影响机理奠定基础。【方法】通过构建表达载体pGWB2-OsMGD和农杆菌介导的转化方法,获得超表达OsMGD基因烟草植株,用磷浓度为5μmol/L的HS营养液对转基因烟草植株进行低磷处理后,研究转基因烟草植株MGD活性、脂质和脂肪酸含量、叶绿素含量、根系鲜质量、根冠比和磷含量的变化情况。【结果】超表达OsMGD基因烟草植株中MGD活性增加了1~3.5倍;在转基因烟草植株中,半乳糖脂(MGDG和DGDG)、磷脂和总脂肪酸含量均显著高于野生型植株,但是转基因烟草植株中的脂肪酸组分与野生型相比无显著差异。低磷处理后,转基因烟草植株的生长情况明显优于野生型植株,转基因烟草植株中叶绿素含量、根系鲜质量和根冠比均显著高于野生型;在正常和低磷条件下,转基因烟草植株中的磷含量与野生型相比无显著差异。【结论】超表达OsMGD基因能增加烟草植株的细胞膜脂含量,使植物体内累积大量半乳糖脂和磷脂,从而提高了烟草植株耐低磷胁迫的能力。     

小麦WZY2基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化

【目的】利用基因枪将WZY2基因RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri导入"郑引1号"小麦,获得WZY2基因表达缺失型小麦,为深入分析WZY2基因功能奠定基础。【方法】以植物表达载体pAHC25为基础,构建含有反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri,利用基因枪将其转入"郑引1号"小麦幼胚愈伤组织中,经过筛选、PCR检测得到阳性植株。【结果】从转化的1 500个愈伤组织中获得27株再生植株。利用PCR对再生植株进行检测,获得阳性植株3株,转化率为0.2%。【结论】构建了WZY2基因的RNA干扰表达载体,成功地将WZY2基因RNA干扰表达载体导入"郑引1号"小麦,获得阳性植株。     

拟南芥AtSEC14基因反义RNA植株的获得及抗病性检测

为确定拟南芥抗灰霉病相关基因AtSEC14的功能,本试验构建了AtSEC14基因的反义RNA载体;通过农杆菌介导的遗传转化方法,将其转化拟南芥野生型Col-0中;利用潮霉素抗性筛选和PCR检测,获得了阳性转基因植株。利用半定量RT-PCR技术,在转基因株系中未检测到AtSEC14基因的表达,说明该基因反义RNA载体的转入能特异影响AtSEC14基因的表达,表明试验所获得的转基因植株是AtSEC14基因的反义RNA转基因植株。对所获得的反义RNA转基因植株进行抗病性鉴定,发现反义RNA转基因植株对灰葡萄孢的敏感性增强,表明AtSEC14基因在拟南芥抗灰葡萄孢过程中起正调控的作用。     

芪合酶基因的遗传转化及其转基因烟草抗根黑腐病的研究

【目的】利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,GV3101)介导法获得转芪合酶基因烟草,改良烟草对根黑腐病的抗性。【方法】以普通烟草品种“97204”叶片为受体,采用根癌农杆菌介导法,将芪合酶基因导入烟草基因组并进行分子检测,利用灌根法对4株转芪合酶基因烟草植株接种烟草根黑腐病菌,观察烟草地上部分和根部的变化,并测定苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）活性。【结果】通过根癌农杆菌介导、抗性选择和分子检测,获得32株转芪合酶基因烟草。从中选取长势一致的4株转基因烟草用于抗病性鉴定,结果表明,2株在灌根接种后生长正常,另外2株在接种第7天时出现轻微黄化,3株根部无发病症状,另外1株在接种16 d后根部出现发黑症状,而对照植株接种后第3天叶片就出现黄化及萎蔫症状,随着接种时间的延长,叶片黄化加剧,到第7天时已出现明显的发病症状,15 d植株几乎死亡;转基因烟草PAL及PPO活性本底均显著高于对照,PAL活性在接种后4～10 d保持在一个较高的水平,10 d后又迅速下降,PPO活性在接种2 d后迅速升高,在接种6 d达到峰值,之后开始缓慢下降,而非转基因烟草PAL、PPO活性与转基因烟草相似,但变化幅度较小。【结论】用于抗性鉴定的4株转芪合酶基因烟草中,有3株对烟草根黑腐病的抗性较好。     

玉米抗病毒基因工程研究进展

病毒病是导致玉米产量降低和品质下降的主要原因之一.在我国,玉米矮花叶病和粗缩病发生范围最广、危害最严重.基因工程技术可人为将抗性基因或部分片段定向导入植物获得转基因抗病毒植株,具有速度快、效率高等优点,在玉米抗病毒育种中具有重要的应用价值.文章在总结我国主要玉米病毒病及其病原种类的基础上,论述采用不同策略培育抗病毒玉米植株的研究进展,其中,利用植物病毒基因序列的策略有病毒编码蛋白基因介导的抗病性、RNA干扰(RNAi)介导的抗病性、人工小RNA(amiRNA)介导的抗病性3种,还可利用非植物病毒基因,包括寄主的抗性基因及来自其他植物、动物和微生物的抗病毒基因如核糖体失活蛋白、核酸酶、2-5A体系的基因等;最后分析各种策略的优缺点及抗病毒转基因玉米的安全性问题,为科研工作者优化玉米抗病毒育种工程、培育生产上可推广的抗病毒品种提供参考.     

利用Cre/lox定位重组系统获得无选择标记GFP转基因烟草

【目的】利用Cre/lox系统具有的特异重组特性,以绿色荧光蛋白GFP为目的基因,获得无选择标记的GFP转基因烟草。【方法】将Bar基因表达盒置于两个同向lox位点之间并与GFP基因表达盒融合后获得相应植物表达载体,转化烟草后获得抗除草剂Basta的GFP转基因植株。GFP转基因植株叶盘二次转化导入重组酶Cre基因后,实现与GFP基因连锁的Bar基因表达盒剔除,剔除Bar基因的植株开花后自交使重组酶Cre基因分离,获得无选择标记的GFP转基因烟草。【结果】将含Bar基因表达盒以及GFP基因表达盒的植物表达载体转化烟草Wisconsin 38后获得了抗除草剂Basta以及GFP荧光表达的转基因植株。随机抽取5株转基因植株二次转化导入Cre基因,所获得的再生植株叶盘进行Basta的抗性检测,绝大多数单株对应叶盘在含8 mg•L-1 PPT（phosphinothricin）的筛选培养基上无法再生死亡,删除效率在76%～100%。对Bar基因删除后区域片段进行克隆测序分析显示,Bar基因表达盒已经被精确删除。Bar基因删除植株开花后自交,获得的自交后代进行NPTⅡ抗性检测,NPTⅡ敏感植株分子检测显示均只含有GFP基因。【结论】利用Cre/lox系统获得烟草无选择标记的转基因植物是稳定可行的,可广泛应用于其它无选择标记转基因植物的培育。