棉花热激转录因子GhHsf基因的表达及其烟草转化

[目的]了解棉花GhHsf基因的功能,分析该基因的表达模式,构建其植物表达载体并转化烟草获得转基因植株.[方法]利用半定量RT-PCR对棉花热激转录因子基因GhHsf的表达模式进行分析.构建pCAMBIA1301-GhHsf植物表达载体,采用农杆菌介导法转化烟草,并进行鉴定.[结果]棉花GhHsf基因在棉花各组织中为组成型表达;构建GhHsf基因植物表达载体pCAMBIA1301-GhHsf,转化烟草获得了转基因植株.[结论l棉花Gf基因在棉花的不同组织中是组成型表达,获得了转GhHsf基因烟草株,为进一步开展功能研究奠定基础.     

双价抗虫转基因水稻的育成及初步鉴定

[目的]构建双价抗虫基因表达载体并转化水稻,为选育广谱、高抗转基因抗虫水稻提供技术参考.[方法]构建半夏凝集素基因(pta)和苏云金杆芽孢菌基因(Bf)两个抗虫基因的双价表达载体pCAMBIA 1301-Bt-pta,利用大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌LBA4404转化水稻恢复系辐恢838,同时对转化植株进行GUS染色及PCR鉴定.[结果]以构建的双价植物表达载体pCAMBIA 1301-Bt-pta为模板,PCR扩增到pta基因的部分片段,大小为807 bp,且该载体经Hind Ⅲ酶切后,能得到15854 bp的中间载体pCAMBIA 1301-Bt片段和2046 bp的pta基因片段.对转化植株进行GUS染色,得到3株转基因阳性植株,经PCR鉴定结果显示外源基因已成功导入水稻.[结论]通过构建双价抗虫基因表达载体并转化水稻,成功获得的转基因植株可用于水稻抗虫转基因恢复系及组合的研究,以提高其抗病虫害能力.     

转harpinXooc蛋白编码基因hrf2对油菜抗菌核病的影响

【目的】尝试利用转基因方法提高油菜抗病性。【方法】将来自水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola）编码harpinXooc蛋白的hrf2基因插入植物表达载体pCAMBIA1301中,构建了植物重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2。由根癌农杆菌LBA4404介导,将重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2转化甘蓝型油菜杨油4号子叶节。【结果】获得了抗潮霉素的再生转基因油菜植株,经PCR,RT-PCR和GUS染色检测证明hrf2基因已整合到油菜基因组中。抗病性鉴定结果表明,转基因油菜对油菜菌核病有较好的抗性,在转基因植株叶片上油菜菌核病菌菌丝的生长受到明显抑制。【结论】利用农杆菌转化法可将hrf2基因导入油菜基因组中,并使转基因油菜对菌核病的抗性提高。     

大叶补血草Na~+/H~+逆向转运蛋白基因NHX1的克隆及番茄的遗传转化

根据NCBI公布的大叶补血草NHX1基因序列设计特异性引物,经RT-PCR方法克隆得到大叶补血草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX1,构建植物融合表达载体pCAMBIA1301-NHX1,重组质粒通过农杆菌介导转化番茄,经PCR和RT-PCR鉴定,获得转基因番茄植株.本研究为大叶补血草耐盐基因NHX1的进一步功能分析和应用奠定了一定的理论基础.     

拟南芥bZIP23基因过量表达载体的构建及过表达植株的筛选

[目的]以拟南芥为材料克隆bZIP23基因,构建bZIP23基因的过量表达载体和筛选过表达植株,为验证其功能奠定基础.[方法]提取拟南芥总RNA和RT-PCR克隆bZIP23基因,用限制性内切酶切割和T4 DNA连接酶连接,使bZIP23基因连接到35S强启动子的pART27载体上;将连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞中,筛选阳性单克隆进行菌落PCR鉴定并测序验证,获得重组质粒.将该重组质粒电激转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,浸花法转化拟南芥野生型植株.[结果]通过单菌落PCR鉴定和DNA测序结果显示,bZIP23基因与35S过量表达载体已连接,获得了重组载体;抗性筛选与遗传鉴定获得相应的转基因过量表达阳性植株.[结论]构建的过量表达载体及筛选得到的过量表达植株为验证bZIP23基因功能奠定了基础.     

半夏凝集素基因在水稻中的转化及筛选

为了获得转基因抗虫水稻,将半夏凝集素基因pta导入水稻,并进行鉴定和筛选。在抗虫基因pta的5'端加2×35S启动子,两端分别添加HindⅢ和Spe I酶切位点,并进行人工合成。将pta与植物表达载体p1301连接,经双酶切和测序鉴定。结果表明:重组表达载体p1301-pta构建成功;载体p1301-pta转化农杆菌LBA4404后用浸染法将pta基因导入水稻恢复系辐恢838中,对转化再生植株进行GUS染色以及GUS和pta基因的PCR鉴定后,共得到16株转基因阳性植株。     

大豆胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶基因双价RNAi表达载体的改造及转化

【目的】应用RNA干扰技术同时抑制大豆脂肪氧化酶(Lox)和胰蛋白酶抑制剂(KTi)基因的表达,改良大豆品质,培育缺失Lox和KTi的大豆新材料。【方法】应用RNAi原理,以双价RNAi植物表达载体pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi为基础,以植物表达载体pCAMBIA3301的质粒DNA为模板,利用CaMV35S启动子的上游引物和CaMV35S终止子的下游引物,PCR扩增含有除草剂抗性基因bar的整个表达原件,然后将其插入到pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi中,构建以除草剂为筛选标记的双价RNAi表达载体,并通过花粉管通道法转化至大豆吉农18、吉农28和吉农27 3个品种中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交、RT-PCR分子水平检测和除草剂抗性检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定以及测序结果表明,双价RNAi植物表达载体pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar构建成功。将其转入到大豆中,分别获得吉农18、吉农28、吉农27T1代籽粒47,25和86粒,以及T2代转基因植株50株。RT-PCR结果表明,转基因株系中脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂mRNA积累受到明显抑制。【结论】获得了转pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar的T2代转基因大豆。     

大豆RACK1基因RNAi载体构建及植株转化

[目的]筛选大豆RACK1基因的RNAi突变体,为研究RACK1基因在大豆生长发育过程的调控作用提供依据.[方法]采用RT-PCR克隆大豆叶片RACK1基因核心保守序列片段,以植物表达载体pCAMBIA 1301为基本载体,构建抑制大豆RACK基因表达的RNAi载体.通过农杆菌介导转入大豆子叶节,经潮霉素筛选转基因植株,利用PCR、Southern blot及RT-qPCR进行转基因植株检测.[结果]克隆获得大豆RACK1基因核心保守序列片段432 bp;将该基因片段连接到pCAMBIA1301表达载体内含子两侧,通过酶切分析,RNAi载体构建正确.通过农杆菌介导,将该载体转入大豆中黄13号,获得23个转基因大豆株系;经PCR和Southern blot检测,确定大豆RACK1基因RNAi片段已融合到大豆基因组中.经定量RT-qPCR分析,不同转基因大豆株系RACK1基因mRNA的表达量具有明显差异,其在株系5的表达量最高,为对照的68.5%;株系7最低,降至对照的19.9%.[结论]成功构建了大豆RACK1 RNAi表达载体并导入大豆基因组中,获得23个农杆菌介导的RACK1 RNA干扰表达的大豆转基因植株,为研究RACK1基因在大豆生长发育过程中的功能和作用奠定了基础.     

矮牵牛PhDFR基因和抗除草剂Bar基因植物表达载体的构建及对烟草的遗传转化研究

[目的]构建矮牵牛PhDFR基因的植物表达载体,并对烟草进行遗传转化。[方法]从不同花色的矮牵牛中克隆了2个PhDFR基因,通过目的基因序列克隆、多步载体酶切、连接、转化等技术手段,将其连入通用植物表达载体pCAMBIA2300及pCAMBIA3301。利用冻融法将重组质粒导入农杆菌GV3101继而转化烟草。[结果]构建了含卡那霉素抗性筛选标记基因NPT11和除草剂抗性筛选标记基因Bar的GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA2300-PhDFR-GFP和pCAMBIA3301-PhDFR-GFP。转基因植株的GUS染色结果进一步验证了所构建表达裁体的正确性和实用性。[结论]所构建的表达载体为进一步研究PhDFR基因在植物花色调控效应的功能及开展植物花色改良基因工程研究奠定了基础,为植物基因工程科研工作提供了优良的备选植物表达我体。     

抗Ⅰ型糖尿病融合基因HSP65-6×P277在烟草中的表达

为了研究抗Ⅰ型糖尿病融合蛋白质基因HSP65-6×P277在植物中的表达,构建了含有融合基因HSP65-6×P277的植物表达载体pCAMBIA2301-HSP65-6×P277,通过农杆菌介导法将重组载体转入烟草,利用卡那霉素作为植物筛选标记,获得含有抗Ⅰ型糖尿病基因的16株转基因烟草植株。通过PCR、半定量RT-PCR及SDS-PAGE蛋白质电泳等方法检测,初步验证在抗性烟草植株中融合基因HSP65-6×P277在mRNA和蛋白质水平上进行了表达。     

双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的构建及转化

【目的】构建双元植物表达载体,通过遗传转化提高植物的抗逆能力。【方法】将从超旱生、耐盐植物梭梭(Haloxylon ammodendron)中克隆得到的HaBADH基因,定向导入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS中,以HaCMO替换pCAMBIA2300-HaBADH中的抗性基因NPT Ⅱ,构建双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并通过农杆菌介导法将其转入粳稻品种“优引三号”,对所获得的转基因植株进行PCR检验。【结果】成功构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并获得了携带有pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的水稻阳性植株5株,经PCR检测,转入成功。【结论】将梭梭抗逆基因HaBADH和HaCMO构建到一个表达载体中,并成功转化水稻,为转入基因后水稻植株内甜菜碱合成和积累过程的深入分析提供了条件。     

拟南芥CBF3基因克隆和植物表达载体的构建

[目的]克隆拟南芥CBF3基因并构建植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3。[方法]从模式植物拟南芥中克隆分离出转录因子CBF3与逆境诱导型启动子Rd29A的DNA序列,构建植物表达载体。[结果]克隆得到的CBF3与GenBank数据库所公布序列比对发现,同源性达到100%,全长为750bp;克隆克隆得到的Rd29A与GenBank数据库公布序列比对发现,同源性达到100%,全长为1425bp。[结论]以双元载体pCAMBIA1301为基础,植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3被成功构建,对提高植物耐盐、耐旱和耐寒性有很大帮助。     

拟南芥AtCOR15a转化烟草及后代抗寒性研究

【目的】研究拟南芥AtCOR15a基因的抗寒功能。【方法】构建pCAMBIA1301-COR15a的植物表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,通过抗生素筛选和PCR检测获得转基因烟草。低温胁迫后,利用蒽酮法和酸式茚三酮法测定转基因烟草后代与野生型烟草的可溶性糖和脯氨酸含量,同时观察其抗寒能力。【结果】转基因烟草后代可溶性糖含量和脯氨酸含量均比野生型烟草有所提高,并在第5 d达到峰值。低温处理后转基因烟草后代能正常生长,而野生型烟草则全部死亡。【结论】生理生化指标的测定发现,可溶性糖含量与脯氨酸含量的变化趋势与烟草的抗寒性呈正相关,AtCOR15a基因导入烟草中可以明显提高烟草对低温胁迫的抵抗力。     

大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1的克隆及功能分析

【目的】获得大豆疫霉根腐病抗性相关基因,为培育大豆抗病品种提供理论依据。【方法】在以大豆抗病品种绥农10构建的受疫霉菌诱导后差异表达的cDNA消减文库的基础上,选取文库中一条与其它植物的DR1基因具有较高同源性且上调表达的EST序列。通过RT-PCR方法从绥农10中克隆该基因,并构建到植物表达载体pCAMBIA3301上,以感病品种东农50的子叶节为外植体通过根癌农杆菌介导的方法进行大豆遗传转化。【结果】该基因全长805 bp,开放读码框为471 bp,编码156个氨基酸,在此命名为SDR1。遗传转化获得转基因PCR鉴定阳性植株5株,Real-time PCR检测T1转基因植株较非转基因植株SDR1表达量提高20倍以上的有3株,经Southern杂交分析表明,出现杂交信号的有3株。经离体叶片接种大豆疫霉菌,转基因大豆的抗性较非转基因大豆明显提高。【结论】成功克隆了大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1,并通过对过量表达的大豆转基因植株的抗病性鉴定初步确定了SDR1的抗病功能。     

蜡梅凝集素基因克隆及其对蚜虫、蛞蝓抗性分析

 【目的】克隆蜡梅凝集素基因并研究其抗蚜虫和抗蛞蝓活性,为植物抗虫基因工程提供理论依据和试验材料。【方法】通过随机挑选克隆测序的方法,从蜡梅花cDNA文库中克隆蜡梅凝集素基因,并构建植物表达载体,用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,并对转基因植株进行抗蚜和抗蛞蝓试验。【结果】从蜡梅花cDNA文库中克隆到了一个凝集素基因CpLEC(GenBank登录号：DQ352145),该基因全长871 bp, ORF框长558 bp, 编码185个氨基酸。该基因DNA分析表明其不含内含子。具有单子叶植物甘露糖凝集素基因家族的特征,有2个典型的甘露糖结合位点(QXDXNXVXY),和1个变异的可能结合位点(HXGXNXVXY)。Southern杂交表明,该基因在蜡梅基因组中为多拷贝。构建了35S启动子控制下的CpLEC基因的植物表达载体pBI121-CpLEC,利用根癌农杆菌介导法转化烟草获得抗卡那霉素的植株。PCR和半定量RT-PCR分析表明,CpLEC基因已经整合到植物基因组中并在转录水平上得到了有效表达。抗蚜虫鉴定表明,转基因植株及其离体叶片有效地抑制了蚜虫的群体增长率,平均抑制率分别为60%和68%。抗蛞蝓试验结果表明转基因植株有明显的抗蛞蝓活性,转基因烟草虫害指数为0.17,远低于非转基因烟草的虫害指数0.96。【结论】克隆获得了蜡梅凝集素基因CpLEC,通过转基因手段分析其抗蚜和抗蛞蝓活性,结果表明该基因对抗虫基因工程有重要的应用价值。     

棉花GbRvd的亚细胞定位及其超表达烟草抗病性分析

【目的】研究棉花NB-LRR家族基因GbRvd的亚细胞定位及超表达烟草的黄萎病抗性,为解析GbRvd介导的植物抗黄萎病机制提供依据。【方法】对真核表达载体pJCV52进行改造,在SpeⅠ酶切位点插入gfp,使其兼具亚细胞定位的功能,命名为GPJCV52。应用Gateway技术构建GbRvd的亚细胞定位和超表达载体,并分别转化农杆菌GV3101。利用生物信息学和农杆菌介导的烟草瞬时表达技术对GbRvd分别进行亚细胞定位预测与观察。采用农杆菌介导法转化烟草,并通过组织培养技术获得转基因植株。运用PCR对超表达GbRvd的烟草进行阳性植株筛选,且利用半定量RT-PCR对阳性转基因植株进行表达检测。制备棉花黄萎病菌孢子悬浮液,通过灌根法对T_3代转基因烟草株系进行接种,利用5级标准统计发病情况并计算病情指数。【结果】利用在线分析软件ProtComp预测GbRvd为一种胞外(分泌)蛋白;GbRvd的跨膜预测结果显示其包含3个跨膜域;在线分析软件Wo LF PSORT预测结果显示GbRvd在细胞膜、内质网及叶绿体的预测分值分别为7、3和1,表明GbRvd主要存在于植物细胞膜上。利用农杆菌介导的烟草瞬时表达技术进一步对GbRvd的亚细胞定位进行观察,结果显示在单独表达GFP蛋白的烟草细胞中,荧光信号在细胞核、细胞质和细胞膜均有分布;而GbRvd与GFP融合表达后的荧光信号主要分布于烟草表皮细胞质和细胞膜。综合生物信息学分析和亚细胞定位观察结果,表明细胞膜和细胞质是GbRvd的主要分布位置。利用农杆菌介导和组织培养获得了转基因烟草植株,通过对转基因烟草植株的PCR检测显示,阳性转基因烟草植株能够通过PCR扩增出与预期大小一致的目的条带,而野生型植株未出现相应条带;阳性转基因烟草植株半定量RT-PCR同样能够检测出与预期大小一致的目的条带,由此表明GbRvd成功整合于烟草基因组并能够进行正常转录。对3个T_3代超表达烟草株系的黄萎病抗性进行分析,结果显示超表达GbRvd的烟草植株病情指数显著低于野生型对照植株,表明过表达GbRvd可有效提高植株对黄萎病的抗性。【结论】GbRvd主要存在于植物细胞质和细胞膜,其超表达可显著提高烟草对黄萎病的抗性。     

受MeJA诱导的烟草GTs基因启动子的克隆及转化

利用已克隆的1个受甲基茉莉酸(MeJA)诱导的糖基转移酶(GTs)基因,以PCR扩增得到该基因启动子序列,长度约为1.4kb,用改造后的双元载体pCAMBIA1301与GTs基因启动子连接,构建了含目的启动子与GUS基因的融合基因质粒pCAP-GUS.通过根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化烟草W38,经PCR检测验证得到了含有融合基因的转基因烟草植株,为进一步研究GTs基因的功能奠定了基础.     

多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育

 【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒（PVY）、烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）全长衣壳蛋白（CP）基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3′端长度100 bp、TMV CP 3′端长度100 bp和CMV CP 3′端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因,并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89,然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得276株转基因烟草。Southern和Northern blot分析表明,外源基因以不同拷贝数整合于烟草基因组中;不同转基因植株中病毒RNA的积累量存在显著差异。抗病性检测显示：23%左右的转基因植株表现出对3种病毒侵染的抗性。对转基因植株扩繁后代和T1代的抗性分析表明：多病毒抗性表现稳定。【结论】利用RNA介导的抗病毒基因工程可获得同时抗多种病毒的转基因烟草,其抗病性在T0代扩繁植株和T1代植株中得到稳定遗传。     

利用转基因番茄表达血管内皮生长因子的研究

【目的】应用基因工程技术,获得表达血管内皮生长因子（VEGF）的转基因番茄植株,为以番茄作为生物反应器生产药用蛋白奠定基础。【方法】利用植物偏好的密码子改造合成VEGF基因全长,构建植物表达载体p1390RVEGF,通过农杆菌菌株EHA105介导将其T-DNA区转入到番茄细胞中,再生后获得转基因番茄植株,对其进行分子和蛋白水平检测。【结果】成功构建了植物整株表达载体p1390R-VEGF,建立了高频的番茄再生培养体系;PCR检测、Southern blot和Western blot检测结果表明,VEGF基因已经转入番茄中,并成功得到了表达。【结论】得到了转基因番茄植株和果实,且VEGF蛋白有良好的抗原性。