太子参芜菁花叶病毒时空动态定性初步检测

为明确柘荣县太子参携带芜菁花叶病毒情况,采用RT-PCR法对不同太子参植株进行芜菁花叶病毒检测。结果表明:同株太子参有无病斑的叶片、根部、茎部都可检测到病毒;未表现病毒症状与表现病毒症状太子参植株的9个部位均可检测到病毒,未表现病毒症状的太子参植株中叶脉及茎下部病毒含量相对较高;不同海拔地区种植的太子参植株10个部位均可检测到病毒,花部位的病毒含量相对较少;对不同生长期太子参定株叶片进行病毒检测发现生长末期部分植株未检测到病毒,除此之外所取样品均携带芜菁花叶病毒。     

太子参BBWV2和TuMV的巢式RT-PCR检测

为探求快速、灵敏的太子参脱毒检测技术,建立太子参蚕豆萎蔫病毒2(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)和芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)的巢式RT-PCR快速检测方法,根据GenBank数据库中这2种病毒外壳蛋白(coat protein,cp)基因核苷酸序列的保守区域分别设计2对简并引物,建立和优化巢式RT-PCR扩增体系,继而进行常规RT-PCR和巢式RT-PCR灵敏度的比较,并应用巢式RT-PCR对7份田间栽培太子参病样和4份脱毒苗样品进行检测。结果显示:BBWV2、TuMV的巢式引物最佳退火温度分别为60、62℃;采用巢式RT-PCR,这两种病毒样品cDNA原液在稀释10~5倍后仍能扩增出特异性条带,比常规RT-PCR的灵敏度至少高10倍。本研究建立的巢式RT-PCR检测方法可快速、稳定、准确地检测BBWV2和TuMV,且具有更高的灵敏度,更能满足太子参脱毒检测的需要。     

同时检测豇豆花叶病毒属与蚕豆病毒属病毒的通用RT-PCR检测方法

【目的】建立一个可同时检测豇豆花叶病毒属（Comovirus）和蚕豆病毒属（Fabavirus）病毒的通用RT-PCR检测方法。【方法】通过基因组序列的多重比对分析,在其保守区域设计简并引物,用于这2个病毒属病毒的通用RT-PCR检测,并进行灵敏性、特异性试验。为便于PCR产物直接测序,在简并引物中引入通用测序引物（RV-M和M13-47）,并通过序列分析对病毒种类鉴定。利用该方法对来自福建柘荣的太子参病毒进行检测验证。【结果】设计一对简并引物,建立了一个用于扩增豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒部分依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp）基因的通用RT-PCR方法。该方法成功用于检测安第斯马铃薯斑驳病毒（ApMoV）、蚕豆染色病毒（BBSV）、蚕豆真花叶病毒（BBTMV）、菜豆荚斑驳病毒（BPMV）、豇豆花叶病毒（CPMV）、豇豆重花叶病毒（CPSMV）、南瓜花叶病毒（SqMV）、红三叶草斑驳病毒（RCMV）和萝卜花叶病毒（RaMV）9种豇豆花叶病毒属病毒;蚕豆萎蔫病毒1号（BBWV1）、蚕豆萎蔫病毒2号（BBWV2）2种蚕豆病毒属病毒共计17个分离物,而不能与同亚科的线虫传多面体病毒属病毒及健康寄主植物反应,显示出良好的广谱性和特异性。在简并引物的5′端分别加入一段非互补的通用测序引物序列（RV-M和M13-47）,不仅可以利用该通用测序引物进行PCR产物直接测序,而且检测灵敏度可以提高10-100倍。序列及系统发育分析表明,所扩增的序列可以把豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒区分到种的水平。利用该方法测定了BBSV的部分RdRp基因序列,显示出与RCMV具有最近的亲缘关系。利用该方法在太子参中检出BBWV2。【结论】建立的通用RT-PCR方法可用于豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒的广谱性检测,结合序列可进行病毒种类的快速鉴定,并且可能用于新病毒种类的检测鉴定。     

烟草芜菁花叶病毒的ELISA和RT-PCR快速检测技术研究

采用间接ELISA和RT-PCR，建立了烟草芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）快速检测的技术体系。间接ELISA测定结果表明，TuMV多抗按1：3000浓度稀释后，具有较高的检测灵敏度，其检测极限浓度为1：3215；通过改进RNA提取技术，从少量的烟草病叶中提取出高质量总RNA，进行cDNA合成及PCR扩增，得到一条长度约986bp的特异PCR扩增产物，与理论设计的大小一致，可有效地对田间烟株进行快速检测。     

烟草花叶病毒属条形码鉴定方法的建立

烟草花叶病毒属病毒可侵染多种植物,给农业生产带来严重危害。为建立该病毒属的条形码鉴定技术,以该属22个确定种的标准序列为凭证标本序列,分析其保守区域,设计6对候选条形码引物(Tobamo1-Tobamo6),其扩增片段长度为200~1 240 bp。以田间样本对引物进行筛选,通过比较各引物的扩增效率、测序成功率、获得序列的亲缘关系对引物的通用性和物种分辨率进行评价。结果表明,Tobamo6的通用性最高,扩增率和测序成功率均为100%;物种分辨率良好,获得序列的种内种间变异可有效鉴定实际样本中的辣椒轻斑驳病毒、烟草花叶病毒、番茄花叶病毒和黄瓜绿斑驳花叶病毒;可作为烟草花叶病毒属的首选条形码引物。     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

本文报道采用反转录酶—聚合酶链式反应，体外扩增芜菁花叶病毒（ＴｕＭＶ）外壳蛋白基因及其克隆，并在大肠杆菌中获得表达的结果；从抗州市郊区感病的油菜上分离到一株致病力极强的芜菁花叶病毒分离物，提纯后，经５０ｎｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ和０．５％ＳＤＳ处理，苯酚／氯仿和氯仿抽提两次，酒精沉淀，获得了纯化的病毒ＲＮＡ，该ＲＮＡ与ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）＿（１５）退火后，在ＡＭＶ反转录酶的作用下合成了单链ｃＤＮＡ，然后加入用以扩增ＴｕＭＶ－ＣＰ基因的上下游引物，３５个循环后，得到了一条长约０．８５ｋｂ的片段，将该片段克隆到ｐＵＣ１８质粒的ＳａｌⅠ限制性酶切位点，分析了限制性酶切图谱，分析表明该片段含有ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ以及引物设计时带人的ＭｃｏⅠ三个酶切位点，该片段克隆到大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）原核表达载体ｐＫＫ２３３－２质粒的ＮｃｏⅠ和ＨｉｎｄⅡ位点后，经ＩＰＴＧ诱导，以该病毒的抗血清为第一抗体，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测该基因的表达产物，结果表明该基因的表达产物为ＴｕＭＶ－ＣＰ蛋白，因而认为所获得的扩增片段确为芜菁花叶病毒外壳蛋白基因。     

不同病毒侵染种根对太子参生长及产量和品质的影响

【目的】探明不同病毒对太子参生长、产量及品质的影响。【方法】以柘参2号为试验材料，采用RTPCR分子鉴定方法筛选出只携带一种常见病毒、携带两种常见病毒和不带病毒的太子参个体，经扩繁后，在田间使用随机区组的方法种植，探讨不同种类病毒对太子参的生长、产量和品质的影响。【结果】与未带病毒的植株相比，同时感染芜菁花叶病毒和蚕豆萎蔫病毒的植株总叶绿素含量、净光合速率和地上部株高分别降低了24%、33%和26%，单位面积的块根产量、浸出物含量和多糖含量分别降低了77.5%、76.2%和87.3%；而仅感染蚕豆萎蔫病毒的植株与未带病毒的植株相比，总叶绿素含量、净光合速率、地上部株高、块根产量、浸出物含量和多糖含量均无显著性差异。【结论】芜菁花叶病毒显著抑制太子参的生长，降低了太子参产量和品质，而蚕豆萎蔫病毒的影响不显著，在太子参脱病毒培养和脱毒苗的生产应用中应优先去除芜菁花叶病毒。     

江苏省葫芦科作物6种病毒的多重RT-PCR方法及应用

江苏省葫芦科作物上的病毒主要有小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)、西瓜花叶病毒(WMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)、烟草花叶病毒(TMV)和番木瓜环斑病毒(PRSV),通常发生复合侵染。基于Gen Bank中这6种病毒的核苷酸序列保守区设计特异性引物,在单重RT-PCR技术的基础上,通过对影响2种多重RT-PCR扩增的DNA聚合酶浓度、d NTPs及镁离子浓度、退火温度、延伸时间、循环次数等因素进行优化,对检测灵敏度进行测定,建立了2种PCR反应同时检测葫芦科作物上6种病毒的多重RT-PCR方法。结果显示:2种多重RT-PCR体系均能同时扩增出各自特异性片段,测序分析结果表明序列同源性在97%以上;优化的2种多重RTPC体系检测灵敏度为总RNA稀释102~103倍,应用于江苏省210份样品的检测结果与单重RT-PCR一致,体现了检测的可靠性;检测结果表明近年来江苏省葫芦科作物以种子传播的ZYMV和CGMMV侵染为主,病毒的复合侵染率达75.24%。     

利用CODEHOP设计简并引物克隆镰刀菌果胶酶基因片段

利用CODEHOP(Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers)设计真菌果胶酶基因片段的简并引物,并对设计的多对引物进行筛选,比较了普通PCR和Touchdown-PCR(TD-PCR)程序的扩增效果,并对产物进行了测序、比对和分析。结果表明:利用CODEHOP设计简并引物可信性强,阳性率高,能够从供试菌株中获得与目的片段大小相近的产物。利用TD-PCR程序扩增比普通PCR扩增效果好。扩增产物序列BLASTX比对和分析结果表明,产物片段编码的氨基酸序列与镰刀菌属来源的果胶酶氨基酸片段相似性均超过90%,说明所扩增的序列即为镰刀菌果胶酶基因片段。     

福建太子参常见病害与绿色防控技术

通过实地调查、试验研究和查阅文献,总结了近年来福建太子参发生的主要病害,包括病毒病(芜菁花叶病毒、蚕豆萎蔫病毒、烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒)、根部病害(猝倒病、立枯病、紫纹羽病、根腐病和白绢病)以及叶斑病类(斑点病、叶斑病、黑斑病)三大类,分别阐述其症状与病原、传播途径和发病条件以及绿色防控措施,以期为太子参主要病害的综合防治提供参考,为高品质安全生产提供科学指导.     

芜菁花叶病毒山东分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

 从山东省3地市感病的白菜和萝卜上分离到芜菁花叶病毒6个分离物，将其分别命名为TuMV-SD1、TuMV-SD2、TuMV-SD3 、TuMV-SD4、 TuMV-SD5和TuMV-SD6。利用RT-PCR克隆了这6个分离物的外壳蛋白基因，测定了它们的核苷酸序列，并进行了序列分析。结果表明，6个分离物的CP基因均为867个碱基，核苷酸序列同源性较高, 达97.0%～99.4%；它们与World-B组分离物的同源性最高，达91.8%～100%；与Brassica- Raphanus (BR) 致病型分离物的同源性次之，在89.1%～91.0%之间；与basal-B组分离物的同源性最低，仅86.0%～90.3%。基于TuMV的CP基因核苷酸序列的分子进化树显示，TuMV分离物可分为4组，本研究所分离到的6个TuMV山东分离物属于第四组，即world-B组。用分离到的6个TuMV分离物对已获得的转TuMV CP基因的抗病毒大白菜进行攻毒试验。结果表明，尽管作为转基因的CP基因与这6个分离物的CP基因只有88.2%～88.9%的同源性，但转基因大白菜对这6个分离物均具有明显抗性。     

芜菁花叶病毒两分离物的CP基因及HC-Pro基因的比较

芜菁花叶病毒杭州分离物(HZWT)和昆明分离物(YNQC)在7种寄主上的致病性相似.利用IC-RT-PCR对两分离物的CP和HC-Pro基因进行PCR扩增,扩增产物克隆后进行序列测定,CP基因序列长度均为864个核苷酸,编码288个氨基酸;HC-Pro基因序列长度均为1374个核苷酸,编码458个氨基酸.两分离物的CP和HC-Pro基因的核苷酸同源率分别为99.3%和94.5%,氨基酸同源率分别为100%和98.7%.HZWT和YNQC的CP基因与已报道的TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率为89.2%～99.3%,氨基酸同源率分别为88.5%～99.7%;HC-Pro基因与TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率分别为80.6%～97.0%,氨基酸同源率分别为95.0%～99.6%.     

外壳蛋白基因片段介导的高抗TuMV研究

为了获得对芜菁花叶病毒（TuMV）高度稳定的抗性,选取TuMV的外壳蛋白（CP）基因近3′端保守区共377 bp的核苷酸序列,构建了抗TuMV的发卡结构RNAi载体,并转化了TuMV的天然宿主拟南芥。转基因植株用北京地区TuMV主要流行的强致病株系BJ-C4人工接种。鉴定的8个转基因株系中有3个株系表现出对TuMV的高度抗性。定量PCR结果显示,高抗转基因株系体内几乎检测不到病毒的积累。     

马铃薯X病毒黑龙江分离物外壳蛋白基因克隆与序列分析

马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)是重要的马铃薯病毒之一,几乎分布于全国所有马铃薯种植区域,严重影响马铃薯的产量和品质。对其建立RT-PCR分子检测体系以及对其外壳蛋白(CP)基因进行序列分析尤为重要。根据已报道的PVX的核苷酸序列设计合成1对引物,以带毒植株总RNA为模板,应用RT-PCR方法,克隆了PVX黑龙江分离物(P2)全长CP基因序列。序列分析表明:P2CP基因全长711 bp,编码237个氨基酸残基,与GenBank中17个不同分离物的CP核苷酸序列同源性为75.5%~96.3%,氨基酸序列同源性为89.4%~99.2%。依据PVXCP氨基酸序列建立系统进化树,将PVX不同分离物划分为两大类群,P2与PVX中国分离物亲缘关系较近,同属于类型Ⅱ,表现一定的地域相关性。同时,应用该RT-PCR分子检测体系进行马铃薯样品检测。     

不结球白菜抗芜菁花叶病毒基因的遗传分析及SSR标记

为了找到与不结球白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)基因连锁的分子标记,采用群体分离分析法(BSA法)和SSR标记进行了与抗病基因连锁标记的筛选。通过对亲本、F1、BC1和F2群体进行病毒接种,研究了试验材料对TuMV的抗性遗传模型,结果表明:不结球白菜对TuMV的抗性由显性单基因控制。通过SSR引物筛选,得到在双亲间稳定表现多态性的引物54对。用这些引物筛选抗感池,得到1个与芜菁花叶病毒抗病基因连锁的SSR标记Ra3E05,连锁距离为8.7 cM。将该标记测序,得到1条184 bp的序列,根据该序列重新设计引物,将SSR标记转化为序列特异扩展区城(SCAR)标记SCRa2,用F2群体对其验证,带型与原SSR标记表现一致,可用于分子标记辅助育种。     

韭葱黄条病毒黑龙江分离物外壳蛋白基因克隆与序列分析

韭葱黄条病毒(Leek yellow stripe virus,LYSV)是大蒜上的重要病毒病害,几乎分布于全国所有大蒜种植区域,严重影响大蒜的产量和品质。对其建立RT-PCR分子检测体系以及对其外壳蛋白(CP)基因进行序列分析尤为重要。根据已报道的LYSVCP基因的核苷酸序列设计合成1对引物,以带毒植株总RNA为模板,应用RT-PCR方法,克隆了LYSV黑龙江分离物(LYSV-HLJ)CP基因全长cDNA序列。结果表明,LYSV-HLJCP基因全长885bp,编码295个氨基酸残基;与GenBank中其他不同分离物的CP核苷酸序列同源性为79.7%～88.6%,氨基酸序列同源性为83.7%～93.1%。依据LYSVCP氨基酸序列建立系统进化树,将LYSV不同分离物划分为4个类群,LYSV-HLJ与韩国和巴西大蒜上的LYSV有较近的亲缘关系,同属于ⅳ类,表现出一定的寄主相关性。     

芜菁花叶病毒萝卜与甘蓝分离物P3基因的克隆与序列分析

芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)危害范围广,变异快,对其序列进行分析,能对病毒的演变与进化有深入的了解,为抗病育种打下基础.P3蛋白是TuMV高度容易变异的蛋白之一,包含一个对Brassica属和Raphanus属不同宿主侵染能力的决定因子,决定了宿主范围.笔者分别从北京感病的萝卜和甘蓝上分离得到4个TuMV分离物BJ - R01和BJ - 1301、BJ - B02、BJB03.利用RT - PCR克隆了这4个分离物的P3基因,测定了它们的核苷酸序列,并进行了序列分析.结果表明,4个分离物的P3基因均为1 065个碱基,编码355个氨基酸.4个分离物P3基因的同源性较高,核苷酸序列同源性在92.6％ ～99.3％,氨基酸同源性在93.5％ ～99.7％.根据系统进化树分析,4个TuMV分离物均属于world -B组.经对宿主的致病性鉴定,4个TuMV分离物均为BR致病型.4个TuMV分离物对Brassica属植物均表现出强致病性,但对Raphanus属植物致病性显现出明显的差异.     

The Function Identification of the Candidate Disease-Resistance Gene in Cabbage

In order to understand the function of TuR2, a candidate disease-resistance gene was isolated from cabbage, we transformed it into mustard （Brassicajuncea L. Linshicaoyaozi） which was susceptible to TuMV through Agrobacterium tumefacine-mediated method. Transgenic plants were detected by Southern blotting and Northern blotting. Our results confirmed that the TuR2 gene had been integrated into the mustard genome, and it showed different expression levels among primary transplants （T0）. The primary transplants （T0） and the first progenies of transgenic plants （T1） were inoculated with TuMV in a greenhouse. The transgenic plants had high TuMV-resistance, whereas the serious virus disease symptom was observed in CK （no transformation plants）. The TuR2 gene in the first progenies of transgenic plants （T1） showed dominant monogenic inheritance. Compared with CK, the progenies containing TuR2 gene had stronger resistance to TuMV. The TuR2 gene which was isolated from cabbage had the function of TuMV-resistance.     

马铃薯A病毒云南分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析

根据马铃薯病毒A(Potato virusA,PVA)外壳蛋白(CP)基因序列设计合成的一对引物,以带病毒植株总RNA为模板,RT-PCR扩增得到长约800 bp的目的片段。将目的片段克隆至pGEM-T Easy载体并进行了序列测定,测得全长为807 bp的PVA CP基因。测序结果与PVA其他分离物CP基因序列比较,其氨基酸同源性最高可达98.5%。根据GenBank中PVA CP氨基酸序列建立了病毒的系统进化树并对PVA不同分离物CP氨基酸序列差异性进行了分析。     

菜豆荚斑驳病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆菜豆荚斑驳病毒(BPMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆BPMV CP基因,将其连接至pMD19-T Simple载体后对阳性克隆进行测序,检测其与已知病毒外壳蛋白基因序列的同源性;将CP基因定向插入双酶切的pET30a,构建其原核表达载体并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验克隆得到的CP基因大小为1 122 bp,与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;试验成功构建了原核表达载体pET30a-BPMV CP,发现重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导4 h条件下表达量最高。[结论]该研究为BPMV抗血清的制备与液相芯片检测方法的建立奠定了基础。