马铃薯X病毒贵州分离物的分子鉴定

从贵州威宁县染病马铃薯植株中分离得到马铃薯X病毒贵州分离物(PVX-GZ),采用RT-PCR扩增并克隆了该分离物的外壳蛋白基因(CP).经测序,该CP基因长714 bp,编码237个氨基酸残基,分子量25.2 ku;与19种已报道的PVX各地分离物的同源性相比,其核苷酸和氨基酸序列分别在78.6％～97.5％和84.8％～99.6％之间,其中,与两种典型的PVX X3株系(荷兰分离物X3和英国分离物UK3)的基因序列同源性达97.1％以上.结合寄主鉴别结果,判断该分离物属PVX的X3株系.     

韭葱黄条病毒黑龙江分离物外壳蛋白基因克隆与序列分析

韭葱黄条病毒(Leek yellow stripe virus,LYSV)是大蒜上的重要病毒病害,几乎分布于全国所有大蒜种植区域,严重影响大蒜的产量和品质。对其建立RT-PCR分子检测体系以及对其外壳蛋白(CP)基因进行序列分析尤为重要。根据已报道的LYSVCP基因的核苷酸序列设计合成1对引物,以带毒植株总RNA为模板,应用RT-PCR方法,克隆了LYSV黑龙江分离物(LYSV-HLJ)CP基因全长cDNA序列。结果表明,LYSV-HLJCP基因全长885bp,编码295个氨基酸残基;与GenBank中其他不同分离物的CP核苷酸序列同源性为79.7%～88.6%,氨基酸序列同源性为83.7%～93.1%。依据LYSVCP氨基酸序列建立系统进化树,将LYSV不同分离物划分为4个类群,LYSV-HLJ与韩国和巴西大蒜上的LYSV有较近的亲缘关系,同属于ⅳ类,表现出一定的寄主相关性。     

郑州地区2种菊花病毒CP基因的克隆与序列分析

为了探明郑州地区感病菊花上病毒的种类及来源,采集有明显病症的菊花样品,根据已知的番茄不孕病毒(TAV)和菊花B病毒(CVB)的基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR扩增其外壳蛋白(CP)基因的方法对这2种病毒进行了检测,然后进行序列同源性及系统进化分析。结果显示,所得TAV的CP基因序列长度为481 bp,NCBI登录号为KU873003;所得3条CVB的CP基因序列长度均为547 bp,NCBI登录号分别为KU873004、KU873005、KU873006。将郑州分离物的CP基因与NCBI上已登录的其他分离物进行比对,TAV核苷酸序列同源性为91%~99%,氨基酸序列同源性为86%~100%;CVB核苷酸序列同源性为76%~99%,氨基酸序列同源性为77%~99%。系统进化分析表明,菊花TAV郑州分离物与北京分离物KP019201、黑龙江分离物KP019202、河南分离物KP019200和山西分离物KP019204的亲缘关系最近;CVB郑州分离物与印度分离物AJ812569、AJ871367的亲缘关系最近。     

甘蔗花叶病毒南城分离物外壳蛋白基因序列测定及分析

从江西南城甘蔗病株中获得1个甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)分离物,命名为SCMV-NCH。根据SCMV外壳蛋白(CP)基因N-端和C-端保守序列设计引物,对SCMV-NCH的CP基因进行RT-PCR扩增、克隆和测序,获得924个核苷酸(nt),推断编码308个氨基酸(aa)的近全长CP基因序列。与SCMV亚组SCMV、高粱花叶病毒(SrMV)、玉米矮花叶病毒(MDMV)、约翰逊草花叶病毒(JGMV)、玉米花叶病毒(ZeMV)、白草花叶病毒(PenMV)等6种病毒代表性株系外壳蛋白氨基酸序列同源性比较结果显示,SCMV-NCH与SCMV的同源性最高(86.2%),与其他5种病毒同源性相对较低(56.4%~72.2%)。与SCMV13个分离物外壳蛋白氨基酸序列进行同源性比较并构建关系树,结果显示SCMV-NCH与我国浙江2个分离物(Yuhang和Xiaosh)具有最近的亲缘发生关系。     

马铃薯Y病毒黑龙江分离株外壳蛋白基因克隆及序列分析

为研究马铃薯Y病毒的检测方法,参考GenBank中马铃薯Y病毒的全基因序列,应用Primer 6.0引物软件设计并合成了一对特异性引物PVYF、PVYR,利用RT-PCR方法对PVY病毒黑龙江分离株CP基因进行特异性扩增,对扩增片段进行序列测定并进行序列比对。结果表明:引物PVYF、PVYR可以扩增出包含PVY病毒CP基因全长的cDNA特异性片段,序列分析结果表明PVY病毒黑龙江分离株CP基因与GenBank上的40个不同PVY病毒分离株的CP基因氨基酸序列同源性为92.1%~97.4%,说明PVY病毒CP基因保守性较高,可以用作制备PVY病毒血清型检测方法的抗体基因。     

地黄病毒病的检测与初步鉴定

利用DAS-ELISA和RT-PCR等检测方法,对感染地黄病毒病的地黄进行检测和初步鉴定,并结合该病毒地黄分离物CP基因的克隆及序列分析进行验证。结果表明,烟草花叶病毒（TMV）为侵染地黄的主要病毒;扩增产物序列测定结果表明：TMV地黄分离物CP基因的核苷酸序列与GenBank上已登录的TMV其他株系CP基因核苷酸序列的同源性在85％～98％之间,氨基酸序列同源性在84％～98％之间,同源性较高。根据不同株系CP基因氨基酸序列进化树分析,推测该分离物可能为TMV的已有株系。     

云南马铃薯A病毒分布及其外壳蛋白分子变异分析

为研究云南马铃薯A病毒(PVA)分布及其外壳蛋白的分子变异,2007年至2011年分别从云南滇西北、滇东北、滇中及滇南马铃薯种植区采集381份马铃薯样品,进行马铃薯A病毒DAS-ELISA检测,结果表明,PVA阳性样品共43份,其中滇西北22份,滇中17份,滇东北4份,滇南未检出。对带有PVA的部分样品进行电镜负染色观察,电镜下观察到长约750 nm、直径约15 nm的线状粒子。根据已报道的PVA外壳蛋白基因(cp基因)序列设计合成特异性引物,以带毒样品总RNA为模板,RT-PCR扩增得到807 bp目的片段,克隆测序并对其推导的外壳蛋白(CP)氨基酸序列进行同源性分析,并比较分析了不同地区PVA分离物CP氨基酸序列分子变异。结果表明,云南不同地区PVA分离物与GenBank中登录的部分PVA分离物CP氨基酸序列同源性为93.3%～100%,依据不同PVA分离物CP氨基酸序列构建系统进化树,云南PVA分离物与中国福建分离物(AF483279)亲缘关系较近,形成一个进化簇。PVA不同分离物CP氨基酸序列分子变异分析表明,不同分离物CP氨基酸变异位点主要分布在氨基酸序列的N端。     

马铃薯X病毒的分子鉴定与检测技术

为建立快速、灵敏、特异的马铃薯X病毒(PVX)分子鉴定与检测技术,利用反转录—聚合酶链式反应(RT—PCR)技术扩增得到了PVXcp基因,并进行序列测定,同时采用RT—PCR方法和核酸斑点杂交(NASH)方法对PVX进行了分子检测。结果表明:利用PVXcp基因序列及蛋白氨基酸序列分析可准确鉴定PVX,并可分析各分离物间的分子差异。利用PVX特异性引物和DIG标记的PVXcp基因采用RT-PCR技术和NASH技术可对PVX进行准确的检测,其特异性及灵敏度均优于传统方法。     

马铃薯A病毒云南分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析

根据马铃薯病毒A(Potato virusA,PVA)外壳蛋白(CP)基因序列设计合成的一对引物,以带病毒植株总RNA为模板,RT-PCR扩增得到长约800 bp的目的片段。将目的片段克隆至pGEM-T Easy载体并进行了序列测定,测得全长为807 bp的PVA CP基因。测序结果与PVA其他分离物CP基因序列比较,其氨基酸同源性最高可达98.5%。根据GenBank中PVA CP氨基酸序列建立了病毒的系统进化树并对PVA不同分离物CP氨基酸序列差异性进行了分析。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒广东分离物的分子鉴定

采用RT-PCR方法,扩增并测定了黄瓜绿斑驳花叶病毒广东分离物(CGMMV-GD-GZ,CGMMV-GD-LZ,CGMMV-GD-LF)的外壳蛋白(coat protein,CP)和运动蛋白(movement protein,MP)基因序列。结果显示,CP基因序列全长486 bp,编码161个氨基酸;MP基因全长795 bp,编码264个氨基酸。CGMMV广东分离物与其他15个CGMMV分离物之间外壳蛋白基因核苷酸的同源性在90.9%～100%之间,运动蛋白核苷酸同源性为92.7%～100%;与同属其他13种病毒基因组核苷酸序列同源性分别仅为29.5%～56.2%和38.8%～61.8%。基于外壳蛋白和运动蛋白基因序列构建系统发育树显示,CGMMV不同分离物进化为亚洲和欧洲两大群体,3种CGMMV广东分离物与韩国、日本等亚洲分离物同源性极高,可能具有共同的侵染源。     

河北省马铃薯Y病毒株系分子鉴定及其RT-PCR检测

根据马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物,从感染PVY的马铃薯田间病叶组织中提取出病毒的RNA,进行cDNA合成及PCR扩增,得到一条长度约800bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的基因片段大小一致,本试验建立了快速、灵敏、简便的PVY检测的方法。将RT-PCR扩增产物克隆到质粒pGEM-T上,并进行了序列分析。结果表明,克隆的cDNA片段由801个核苷酸组成,编码267个氨基酸组成的理论分子量为29kD蛋白,与PVY外壳蛋白的大小一致,与基因库登记的代表性株系相比,它们之间的核苷酸序列同源性为89 6%～98 8%,氨基酸序列的同源性为93 3%～98 5%,说明PVYCP基因具有高度的保守性(记为PVY-HBEI),与国内报道的PVY-CHU、PVY-ZHJ和PVY-ZHOU株系的氨基酸序列同源性分别为96 6%、98 5%和97 8%,与PVYN和PVYO株系的氨基酸序列同源性分别为93 6%和97 8%,从分子水平上确定PVY-HBEI归属于普通株系(PVYO株系)。     

马铃薯病毒RT-PCR检测体系的建立

依据马铃薯病毒PVS、PVX、PLRV、PVA的CP保守序列设计特异性引物,从马铃薯病叶组织中提取出病毒总RNA,进行cDNA合成和PCR扩增,得到了与预期片段长度一致的PCR特异扩增产物,建立了能够同步检测PVS、PVX、PLRV、PVA的RT-PCR多重检测体系。该方法对PVS、PVX、PLRV、PVA扩增出的靶带大小分别为435、625、222、300 bp,凝胶电泳易辨别区分。研究结果表明,该方法特异性好、灵敏度高、快速简便,为马铃薯病毒的高效检测提供了有效手段。     

侵染南瓜的小西葫芦黄化花叶病毒的分离与鉴定

1999年秋在杭州一株表现典型黄化花叶的南瓜(Cucuribita moschata)上分离获得一株线状病毒HZ00s1.该病毒分离物在葫芦科作物(Cucuribitaceae)上引起系统症状.经寄主反应测定、病毒形态学和寄主组织病变观察, 初步确定该病毒为小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV).对ZYMV杭州分离物(HZ00s1)的外壳蛋白序列及3 端非编码区进行了克隆及序列测定,并与ZYMV Conneticut分离物、Florida分离物、California分离物以及WMV2 Tonga分离物进行了同源性分析.结果显示:HZ00s1分离物与其它3种ZYMV分离物CP基因核酸序列同源性为93%～94%,而与WMV2 Tonga分离物的同源性仅为67%,来自美国的3种ZYMV分离物之间的同源性高达95%～99%.HZ00s1分离物与其它3个ZYMV分离物CP氨基酸序列同源性在95%～98%之间.因此确定在杭州地区葫芦科作物上有ZYMV的发生.     

马铃薯卷叶病毒福建分离物的基因克隆与序列分析

依据马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链式反应扩增得到了PLRV福建分离物外壳蛋白基因,克隆并测定了其核苷酸序列,进行了同源性分析.依据PLRV外壳蛋白氨基酸序列建立了PLRV不同分离物的系统进化树.     

贵州芸薹黄化病毒的分子检测及基因型鉴定

【目的】对贵州省白菜、萝卜和甘蓝感染芸薹黄化病毒（Brassica yellows virus,BrYV）进行分子检测及基因型鉴定,为马铃薯卷叶病毒属病毒的防治提供理论参考。【方法】在贵州省遵义市、威宁县、关岭县、平坝县等县（市）共采集284份蔬菜（白菜、萝卜和甘蓝）疑似病毒病样品,利用马铃薯卷叶病毒属的通用引物进行RT-PCR分子检测,并对检测出的16个BrYV分离物进行P0和CP基因序列扩增,再与已报道的BrYV基因序列进行比对,从而构建系统发育进化树,鉴定其基因型。【结果】284份疑似病毒病样品中,有43份样品检测出BrYV,检出率为15.14%,其中,感染BrYV白菜样品12份,占白菜总样品数的12.77%;感染BrYV萝卜样品14份,占萝卜总样品数的20.29%;感染BrYV甘蓝样品17份,占甘蓝总样品数的14.05%。贵州16个BrYV分离物P0基因核苷酸序列的相似性为89.9%~100.0%,CP基因核苷酸序列的相似性为93.5%~100.0%,二者编码的氨基酸序列相似性均为100.0%。基于P0基因构建的系统发育进化树可知,BrYV-Pingba-BC-2、BrYV-Zunyi-LB-1和BrYV-Zhijing-BC-1均与BrYV-BJS和BrYV-BBJ聚为一类,其余13个分离物均与BrYV-ABJ和BrYV-AJS聚为一类。基于CP基因构建的系统发育进化树可知,贵州不同地区不同蔬菜作物的16个BrYV分离与BrYV-A和BrYV-B基因型无明显分界,亲缘关系均较近。BrYV P0基因检测到5个重组事件,BrYV CP基因未检测到潜在重组事件。【结论】BrYV在贵州白菜、萝卜和甘蓝上普遍发生,但对萝卜的危害最重,主要存在BrYV-A和BrYV-B 2种基因型。     

马铃薯X病毒外壳蛋白基因的克隆与系统进化分析

从贵州威宁等地采集马铃薯病叶样本,采用试管捕捉反转录PCR（tube-capture-RT-PCR,TC-RT-PCR）的方法克隆出714 bp的PVX CP基因,编码237个氨基酸残基.系统进化分析表明,PVX CP基因可分为两大类群,推测分离物属于X3株系,并建议重型花叶也可作为PVX病叶样本.     

水稻条纹病毒云南分离物CP基因克隆及序列比较分析

 对采自云南保山、楚雄、石林和宜良等4地的水稻条纹叶枯病感病稻株,提取病叶总RNA,经RT-PCR扩增,获得4个RSV云南分离物的CP基因片段。序列测定表明,该片段长999 bp,其中CP基因由969个核苷酸组成,编码322个氨基酸。与其它已报道的RSV分离物CP基因进行同源性比较,发现我国RSV分离物可以划分为2个不同的组,大部分RSV云南分离物为一组,其它的RSV 分离物为另一组。以RSV-CXi分离物的CP与纤细病毒属的其它5种病毒的CP进行氨基酸同源性比较,结果表明RSV与MStV亲缘关系最近,而与RGSV亲缘关系最远。