马铃薯A病毒云南分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析

根据马铃薯病毒A(Potato virusA,PVA)外壳蛋白(CP)基因序列设计合成的一对引物,以带病毒植株总RNA为模板,RT-PCR扩增得到长约800 bp的目的片段。将目的片段克隆至pGEM-T Easy载体并进行了序列测定,测得全长为807 bp的PVA CP基因。测序结果与PVA其他分离物CP基因序列比较,其氨基酸同源性最高可达98.5%。根据GenBank中PVA CP氨基酸序列建立了病毒的系统进化树并对PVA不同分离物CP氨基酸序列差异性进行了分析。     

马铃薯A病毒在云南省的发生及其P3蛋白序列分析

[目的]了解马铃薯A病毒在云南省的发生分布情况,明确云南省分离物变异情况。[方法]用DAS-ELSIA的方法,检测云南省19个种植马铃薯县(市)的389个样品;对5个地区的阳性样品用RT-PCR扩增马铃薯A病毒P3蛋白基因,克隆测序,使用DN AM AN及DN AStar等软件分析序列,采用MEGA 6.0邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统进化树。[结果]D AS-ELISA检测389个样品,PVA的检出率为20.82%。用P3蛋白基因特异性引物从云南5个不同地区的PVA阳性样品中扩增得到1041bp的目的片段;比较分析了云南省5个地区马铃薯A病毒分离物之间,及与国内外13个分离物的P3蛋白和PIPO蛋白同源性,发现云南省5个地区PVA分离物之间P3蛋白和PIPO蛋白氨基酸序列同源性分别为98.8%～99.7%和97.6%～100.0%;与国内外13个分离物P3蛋白和PIPO蛋白的氨基酸序列同源性分别为90.8%～99.1%和90.5%～100.0%。系统进化树显示,云南省5个分离物与湖南省分离物(KF977085)亲缘关系最近;PVA马铃薯分离物和新西兰树番茄分离物之间亲缘关系较远。[结论]PVA在云南省发生普遍;云南省马铃薯A病毒存在一定程度的变异;PVA存在一定的寄主适应性。     

马铃薯X病毒黑龙江分离物外壳蛋白基因克隆与序列分析

马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)是重要的马铃薯病毒之一,几乎分布于全国所有马铃薯种植区域,严重影响马铃薯的产量和品质。对其建立RT-PCR分子检测体系以及对其外壳蛋白(CP)基因进行序列分析尤为重要。根据已报道的PVX的核苷酸序列设计合成1对引物,以带毒植株总RNA为模板,应用RT-PCR方法,克隆了PVX黑龙江分离物(P2)全长CP基因序列。序列分析表明:P2CP基因全长711 bp,编码237个氨基酸残基,与GenBank中17个不同分离物的CP核苷酸序列同源性为75.5%~96.3%,氨基酸序列同源性为89.4%~99.2%。依据PVXCP氨基酸序列建立系统进化树,将PVX不同分离物划分为两大类群,P2与PVX中国分离物亲缘关系较近,同属于类型Ⅱ,表现一定的地域相关性。同时,应用该RT-PCR分子检测体系进行马铃薯样品检测。     

杭州郊区马铃薯A病毒分离物的基因组3'-末端序列测定及系统进化分析

采用马铃薯A病毒属通用引物Sprimer扩谱了引起浙江杭州郊区发生的马铃薯病毒基因组3'-末端1687核苷酸序列,它包括MIb,CP和3'-UTR,3'-末端含Poly(A)尾,蚜传基序DAG位于多聚蛋白第215－217氨基酸。BLAST分析表明该病毒为马铃薯A病毒（PVA）,它与已报道的19个PVA分离物CP氨基酸进行比较,PVA浙江分离物与荷兰Alc分离物同源性最高,为99．6％。系统进化树分析表明,PVA分离物间存在一些明显的进化群体。     

菜豆黄花叶病毒外壳蛋白(CP)序列分析

以菜豆黄花叶病毒分离物、蚕豆、豌豆为试验材料,进行了菜豆黄花叶病毒外壳蛋白(CP)序列分析。结果显示,目标片段中包含819 bp的外壳蛋白序列,编码273个氨基酸。分离物的外壳蛋白基因核苷酸和推导编码蛋白质的氨基酸序列的同源性分别为98.7%~99.9%和98.9%~100.0%。与65个菜豆黄花叶病毒外壳蛋白进行序列同源性和系统进化树分析的结果表明,菜豆黄花叶病毒青海蚕豌豆分离物与云南蚕豆分离物同源性最高。外壳蛋白的序列特征揭示,NAG为菜豆黄花叶病毒中病毒的蚜传相关基序。     

马铃薯卷叶病毒福建分离物的基因克隆与序列分析

依据马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链式反应扩增得到了PLRV福建分离物外壳蛋白基因,克隆并测定了其核苷酸序列,进行了同源性分析.依据PLRV外壳蛋白氨基酸序列建立了PLRV不同分离物的系统进化树.     

马铃薯病毒疫情调查及马铃薯S病毒的检测鉴定

[目的]了解河北省张家口市马铃薯病毒病害发生情况并对马铃薯S病毒（PVS）进行鉴定。[方法]对采自河北省张家口市的46份马铃薯样品进行生物学测定和血清学及分子生物学检测。[结果]46份样品中有35份为马铃薯Y病毒（PVY）侵染,其中有6份是PVY与PVS混合侵染,其余29份为PVY单独侵染。用特异性引物扩增PVS外壳蛋白基因的部分序列,获得685bp的目的产物,该序列与已报道的PVS核苷酸序列同源性在80％以上,编码227个氨基酸,与已报道的PVS外壳蛋白的氨基酸同源性均在90％以上。证明该样品中确实携带PVS。[结论]该研究为今后该地区马铃薯病毒病害的控制及防治提供了依据。     

水稻条纹病毒外壳蛋白基因和病害特异性蛋白基因的克隆和序列分析

水稻条纹病毒编码的外壳蛋白 (CP)和病害特异性蛋白 (SP)是两种与症状密切相关的蛋白 .本文对我国云南 YL分离物的 CP基因和 SP基因进行了克隆和测序 .结果表明 ,CP基因和 SP基因分别由 96 6和 534个核苷酸组成 .与已发表的一些分离物相比 ,YL分离物 CP基因与我国山东 C分离物和日本 T、M分离物的核苷酸序列一致性在 96 .0 %左右 ,氨基酸序列一致性为 97.0 % ,但从序列一致性和碱基变异方式来看 ,C分离物与 T、M分离物的亲缘关系稍近 .YL 分离物 SP基因和云南 CX分离物之间有 99.0 %的核苷酸序列一致性 ,但与 T、M分离物的核苷酸一致性只有 94 .0 %左右 .可见 ,不同分离物间 SP基因的变异与其地理分布有密切的关系 .     

甘蔗花叶病毒南城分离物外壳蛋白基因序列测定及分析

从江西南城甘蔗病株中获得1个甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)分离物,命名为SCMV-NCH。根据SCMV外壳蛋白(CP)基因N-端和C-端保守序列设计引物,对SCMV-NCH的CP基因进行RT-PCR扩增、克隆和测序,获得924个核苷酸(nt),推断编码308个氨基酸(aa)的近全长CP基因序列。与SCMV亚组SCMV、高粱花叶病毒(SrMV)、玉米矮花叶病毒(MDMV)、约翰逊草花叶病毒(JGMV)、玉米花叶病毒(ZeMV)、白草花叶病毒(PenMV)等6种病毒代表性株系外壳蛋白氨基酸序列同源性比较结果显示,SCMV-NCH与SCMV的同源性最高(86.2%),与其他5种病毒同源性相对较低(56.4%~72.2%)。与SCMV13个分离物外壳蛋白氨基酸序列进行同源性比较并构建关系树,结果显示SCMV-NCH与我国浙江2个分离物(Yuhang和Xiaosh)具有最近的亲缘发生关系。     

马铃薯X病毒贵州分离物的分子鉴定

从贵州威宁县染病马铃薯植株中分离得到马铃薯X病毒贵州分离物(PVX-GZ),采用RT-PCR扩增并克隆了该分离物的外壳蛋白基因(CP).经测序,该CP基因长714 bp,编码237个氨基酸残基,分子量25.2 ku;与19种已报道的PVX各地分离物的同源性相比,其核苷酸和氨基酸序列分别在78.6％～97.5％和84.8％～99.6％之间,其中,与两种典型的PVX X3株系(荷兰分离物X3和英国分离物UK3)的基因序列同源性达97.1％以上.结合寄主鉴别结果,判断该分离物属PVX的X3株系.     

水稻条纹病毒云南分离物病害特异性蛋白基因的分子变异

对采自云南大理、陆良、禄劝、石林、玉溪、保山和宜良等地的水稻条纹叶枯病病样,提取病叶总RNA,经RT-PCR、cDNA克隆和序列测定,获得了水稻条纹病毒(Rice strip virus,RSV)7个云南分离物的SP基因序列,核苷酸长为537 nts,并与GenBank中已报道的RSV SP基因进行同源性比较,综合分析了云南RSV不同分离物SP基因的分子变异.对纤细病毒属6种病毒的SP蛋白氨基酸序列进行进化分析,结果表明RSV与MStV亲缘关系最近,与RGSV亲缘关系最远.     

水稻条纹病毒云南分离物CP基因克隆及序列比较分析

 对采自云南保山、楚雄、石林和宜良等4地的水稻条纹叶枯病感病稻株,提取病叶总RNA,经RT-PCR扩增,获得4个RSV云南分离物的CP基因片段。序列测定表明,该片段长999 bp,其中CP基因由969个核苷酸组成,编码322个氨基酸。与其它已报道的RSV分离物CP基因进行同源性比较,发现我国RSV分离物可以划分为2个不同的组,大部分RSV云南分离物为一组,其它的RSV 分离物为另一组。以RSV-CXi分离物的CP与纤细病毒属的其它5种病毒的CP进行氨基酸同源性比较,结果表明RSV与MStV亲缘关系最近,而与RGSV亲缘关系最远。     

不同来源苹果茎沟病毒分离物部分序列分子特性研究

[目的]明确为害新疆不同品种梨的苹果茎沟病毒(Apple Stem Grooving Virus,ASGV)侵染状况,并对获得的病毒基因序列进行分子鉴定.[方法]采用生物学和分子生物学方法对来源于新疆梨、砂梨及红梨上的ASGV进行检测,将获得基因序列进行比对分析.[结果]从10份新疆梨、2份砂梨及3份云南红梨样品上扩增到预期大小为500 by的ASGV扩增产物.对扩增产物进行克隆和测序,序列分析的结果显示,15个ASGV分离物的CP基因核昔酸及其编码的氨基酸序列相似性分别为88.2;-100;和95.6;-100;,CP基因核苷酸序列构建系统发育树显示,来源于库尔勒香梨分离物KII-3、KII-5、KII-7和新梨7号的分离物XII-5、XII -6,与早期已报道的库尔勒香梨分离物KRL-1及砂梨分离物P-6-1-17亲缘关系较近,聚集成簇.此外,库尔勒香梨的分离物KII-10、KII-14及新粱7号的分离物XII-10与云南红梨上2个分离物YN-2和YN-4聚集成簇,遗传距离较近.[结论]CP基因核昔酸序列系统发育树显示,来源于新获不同品种梨的8个ASGV 分离物及红梨上3个ASGV分离物位于两个不同的组群,存在复杂遗传变异现象.     

中国野生柑橘上衰退病毒分离株分子特征分析

 【目的】了解中国野生柑橘上携带柑橘衰退病毒（CTV）分离株的CP/HinfⅠRFLP组群构成和分子特征。【方法】运用RT-PCR对采自中国云南、广西、四川、湖南、江西等省11个野生柑橘上CTV分离株的病毒衣壳蛋白基因(CPG)进行扩增，利用RFLP和SSCP对CPG进行分析，并将测定的CPG序列进行同源性比较和聚类分析。【结果】发现野生柑橘上11个CTV分离株以单一组群感染为主；这些CTV分离株CPG的核苷酸序列和相应的氨基酸序列同源性分别为92.5％～99.5％和95.0％～100％；与GenBank收录的9个全基因组CTV分离株的相应基因序列进行聚类分析，其核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为92.1％～98.8％和94.6％～100％。【结论】序列同源性比较说明CTV CPG具有高度保守性，同时系统进化分析表明收集到的野生CTV分离株与国外分离株分属5大类群，具有较复杂的亲缘关系。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒广东分离物的分子鉴定

采用RT-PCR方法,扩增并测定了黄瓜绿斑驳花叶病毒广东分离物(CGMMV-GD-GZ,CGMMV-GD-LZ,CGMMV-GD-LF)的外壳蛋白(coat protein,CP)和运动蛋白(movement protein,MP)基因序列。结果显示,CP基因序列全长486 bp,编码161个氨基酸;MP基因全长795 bp,编码264个氨基酸。CGMMV广东分离物与其他15个CGMMV分离物之间外壳蛋白基因核苷酸的同源性在90.9%～100%之间,运动蛋白核苷酸同源性为92.7%～100%;与同属其他13种病毒基因组核苷酸序列同源性分别仅为29.5%～56.2%和38.8%～61.8%。基于外壳蛋白和运动蛋白基因序列构建系统发育树显示,CGMMV不同分离物进化为亚洲和欧洲两大群体,3种CGMMV广东分离物与韩国、日本等亚洲分离物同源性极高,可能具有共同的侵染源。     

马铃薯3种病毒的多重PCR检测方法构建

[目的]构建马铃薯A病毒（Potato virus A,PVA）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）3种马铃薯主要易受感染的病毒多重PRC（multiplex PCR）检测方法。[方法]根据GenBank公布的PVA、TMV、PVY基因序列分别设计引物,建立3种马铃薯病毒的多重PCR方法;通过构建3种病毒PCR扩增目的基因的质粒用于制备标准品进行敏感性验证,利用PVX（Potato virus X）、PVM（Potato virus M）、PVS（Potato virus S）、PVV（Potato virus V）,CMV（Cucumber mosaic virus）等其他马铃薯病毒进行特异性试验;并对11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎采集样品进行了检测。[结果]研究中构建的马铃薯3种病毒多重PCR检测方法,最低检测下限：PVA为100 copies/2μl,PVY为100 copies/2μl,TMV为1 000 copies/2μl,与PVX、PVM、PVV、PVS、CMV等其他马铃薯病毒无交叉反应,具有良好的特异性;11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎中7份样品检出3种病毒感染阳性。[结论]该研究成功构建了马铃薯PVA、TMV、PVY病毒的多重PCR方法,为马铃薯病毒检测技术应用奠定一定基础。