绵羊成肌细胞的纯化、培养、鉴定及其成肌诱导分化研究

为建立绵羊成肌细胞体外纯化、培养和鉴定的方法以及对成肌细胞进行成肌诱导分化的初步研究,本试验以绵羊胎儿为材料,采用胶原蛋白酶ⅠA消化分离成肌细胞,分别用Percoll分离液梯度离心和2次差速贴壁法纯化成肌细胞,采用免疫荧光方法检测成肌细胞的特异性标志蛋白Desmin以及RT-PCR鉴定成肌细胞的定型因子Myf5和MyoD1。细胞传至第二代后用CCK-8试剂盒检测细胞生长曲线。利用含2%马血清的培养基进行分化诱导并进行MYH1(Myosin heavy chain 1肌球蛋白重链1)免疫荧光染色。结果显示,梯度离心和差速贴壁法均可获得较高纯度的成肌细胞,纯度均在92%以上。RT-PCR结果显示细胞高表达Myf5和MyoD1。细胞符合正常生长规律,生长曲线近似S形。对成肌细胞进行诱导分化,大部分细胞融合为肌管,成肌特异性标志MYH1表达呈阳性。本研究获得了绵羊成肌细胞分离纯化培养及鉴定的方法、高纯度的绵羊成肌细胞系,为以后利用成肌细胞研究肌肉发育调控机理提供了材料。     

鸭骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定

为建立鸭骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定方法,以高邮鸭13胚龄的胸肌和腿肌为材料,采用混合酶消化法和差速贴壁法分离纯化骨骼肌卫星细胞,用特异性标志Pax7对纯化细胞进行免疫荧光鉴定.结果表明胸肌和腿肌都能成功获取骨骼肌卫星细胞,细胞增殖旺盛,分化良好;纯化后的细胞免疫荧光鉴定阳性率达95％.表明该技术能成功分离和鉴定鸭骨骼肌卫星细胞,为以后骨骼肌卫星细胞相关研究提供了技术平台.     

肉鸡成肌细胞的分离培养与鉴定陈凯凯张成*赵菲王驰王孝成耿照玉姜润深

为建立肉鸡成肌细胞的体外分离、培养及鉴定体系,选取11d鸡胚为材料,利用Ⅰ型胶原酶消化鸡胚胸肌,差速贴壁法分离纯化成肌细胞,优化成肌细胞培养条件;通过细胞形态学观察和成肌分化标志基因表达情况进行细胞鉴定,并利用含2%马血清的培养基诱导其成肌分化。结果表明:分离获得的细胞贴壁后呈纺锤形,39.5℃培养条件下细胞增殖速度显著高于37.0℃(P0.05);经实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测分析,增殖期与分化期均有成肌细胞的特异性标志基因成肌因子5(Myogenic factor 5,Myf5)与成肌分化因子1(Myogenic differentiation 1,MyoD)的表达,且与增殖期相比,成肌细胞分化期肌细胞生成素(Myogenin,MyoG)与肌肉调节因子4(Muscle regulatory factor,MRF4)基因表达量显著升高(P0.05);此外,细胞增殖期结蛋白(Desmin)和分化期肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MyHC)呈阳性表达。综上,成功分离获得了肉鸡成肌细胞,并在39.5℃培养条件下具有更好的增殖能力,为研究肌肉发育及其营养调控机制奠定了基础。     

猪骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定及其生物学特性

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37℃、5%CO_2细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈"S"型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异(P0.01)。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点(P0.01);CEBP/β和HSL表达趋势一致,均呈先升高后降低趋势。诱导成骨分化后,发现细胞形态变为不规则状,诱导后期细胞复层生长形成骨钙结节,茜素红染色可见圆形不透明钙化结节,数量和密度较未诱导时期都明显增加,结果表明细胞出现成骨向分化。成骨标志基因BGLAP、RUNX2的表达量也随诱导进程呈稳步上升趋势,相比未诱导细胞差异极显著(P0.01)。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。     

大鼠骨骼肌卫星细胞培养的研究

[目的]探讨在体外条件下骨骼肌卫星细胞纯化、培养、鉴定的方法及确定其生物学特性。[方法]取新生大鼠的小腿肌肉,采用肌组织块和肌细胞培养两种方法。分别用胰蛋白酶对培养中的肌组织块和肌细胞进行消化,采用离心及差速贴壁法纯化,得到更高纯度的大鼠骨骼肌肌卫星细胞,进行体外原代骨骼肌和传代骨骼肌的细胞培养。传至第2代后,用分化培养基诱导分化,观察骨骼肌细胞各个阶段的形态特征并拍照。[结果]此方法分离的细胞成活率较高,体外生长、增殖良好。在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管。[结论]该实验成功探讨了新生大鼠骨骼肌卫星细胞的分化能力并建立了卫星细胞纯化方法,适用于开展细胞移植和肌组织工程方面的研究。     

北京油鸡骨骼肌卫星细胞的分离、培养、鉴定及成肌诱导分化的研究

【目的】探讨体外培养条件下北京油鸡骨骼肌卫星细胞分离、培养及鉴定的方法,建立适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,为今后进一步研究北京油鸡骨骼肌卫星细胞提供技术平台。【方法】以15日龄的鸡胚胸肌为材料,采用联合酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法纯化细胞,使用Pax7、Desmin、Myod等骨骼肌卫星细胞的特异性标志对所得细胞进行免疫荧光鉴定,随后进行成肌诱导分化,并比较了3种培养体系对骨骼肌卫星细胞增殖的影响。【结果】细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,证实所培养的细胞为北京油鸡骨骼肌卫星细胞;成肌诱导后,细胞相互融合形成多核的肌管,成肌特异性标志MHC表达呈阳性;对不同扩增培养体系比较,结果表明,培养体系DMEM/F12+15%FBS+2.5ng·mL-1bFG最有利于北京油鸡骨骼肌卫星细胞的增殖。【结论】该试验成功地分离并鉴定了北京油鸡骨骼肌卫星细胞,建立了适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,同时成功地进行了成肌诱导分化,为今后研究北京油鸡骨骼肌生长和发育的机理提供了技术平台。     

小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定

采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离小鼠骨骼肌卫星细胞,应用差速贴壁法进行纯化,并利用RT-PCR和免疫荧光染色方法对分化前后细胞的标志基因进行鉴定。结果显示:分离出的肌卫星细胞生长状态良好,RT-PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达,诱导分化形成肌管后,分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。本研究成功从小鼠肌肉组织中分离出了肌卫星细胞,并具有很好的体外分化能力,可以为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供良好的细胞模型。     

肉鸡成肌细胞的分离培养与鉴定

为建立肉鸡成肌细胞的体外分离、培养及鉴定体系，选取11 d鸡胚为材料，利用Ⅰ型胶原酶消化鸡胚胸肌，差速贴壁法分离纯化成肌细胞，优化成肌细胞培养条件；通过细胞形态学观察和成肌分化标志基因表达情况进行细胞鉴定，并利用含2%马血清的培养基诱导其成肌分化。结果表明:分离获得的细胞贴壁后呈纺锤形，39.5 ℃培养条件下细胞增殖速度显著高于37.0 ℃(P<0.05)；经实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测分析，增殖期与分化期均有成肌细胞的特异性标志基因成肌因子5(Myogenic factor 5，Myf5)与成肌分化因子1(Myogenic differentiation 1，MyoD)的表达，且与增殖期相比，成肌细胞分化期肌细胞生成素(Myogenin，MyoG)与肌肉调节因子4(Muscle regulatory factor，MRF4)基因表达量显著升高(P<0.05)；此外，细胞增殖期结蛋白(Desmin)和分化期肌球蛋白重链(Myosin heavy chain，MyHC)呈阳性表达。综上，成功分离获得了肉鸡成肌细胞，并在39.5 ℃培养条件下具有更好的增殖能力，为研究肌肉发育及其营养调控机制奠定了基础。     

猪骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定及其生物学特性

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37 ℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈“S”型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异（P<0.01）。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点（P<0.01）;CEBP/β和HSL表达趋势一致,均呈先升高后降低趋势。诱导成骨分化后,发现细胞形态变为不规则状,诱导后期细胞复层生长形成骨钙结节,茜素红染色可见圆形不透明钙化结节,数量和密度较未诱导时期都明显增加,结果表明细胞出现成骨向分化。成骨标志基因BGLAP、RUNX2的表达量也随诱导进程呈稳步上升趋势,相比未诱导细胞差异极显著（P<0.01）。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。     

鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞分离培养及生物学特性

为研究鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞生物学特性,取30～50日龄鲁西黄牛胚胎四肢骨骼肌,分离培养鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞.结果显示,试验成功地分离了鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞,原代培养并传代至16代,免疫细胞化学染色检测卫星细胞表面特异性标志Desmin、MyoD呈阳性表达,RT-PCR检测Desm in、c-Met、Myf5、pax7呈阳性表达;绘制生长曲线,结果说明细胞具有较强增殖能力;应用流式细胞仪对细胞进行周期分析,结果显示S期细胞所占比例为8.94％;骨骼肌卫星细胞向成肌细胞诱导10 d后,免疫细胞化学染色检测成肌特异性标志骨骼肌肌球蛋白呈阳性表达;骨骼肌卫星细胞向脂肪细胞诱导7d后,油红O染色呈阳性,RT-PCR检测脂肪细胞特异性标志pparγ、LPL呈阳性表达.结果表明试验成功建立了鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞的体外扩增培养体系,且该骨骼肌卫星细胞有发育形成肌管和脂肪细胞的多项分化潜能.     

鸽骨骼肌卫星细胞的分离、培养及成肌特性

【目的】探讨白羽王鸽Columba livia骨骼肌卫星细胞的分离、培养和鉴定的方法,建立完整的家鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系。【方法】选择孵化16 d的鸽胚作为试验材料,采用组织块贴壁法和胶原酶消化法分离胸肌的骨骼肌卫星细胞并绘制其生长曲线。待卫星细胞分化出肌管后,采用免疫荧光法检测肌球蛋白重链(MyHC)的表达;在细胞分化出肌管前、后分别提取总RNA,采用RT-qPCR方法检测Desmin、Pax7、MyoG和MyoD1基因在细胞分化出肌管前、后的相对表达量。【结果】组织块贴壁法和胶原酶法均能成功地分离出骨骼肌卫星细胞,其生长曲线呈"S"型;该细胞经含体积分数为20%FBS的DMEM高糖培养液培养7 d后视野中出现大量明显可见的肌管,成肌特异性标志MyHC表达呈阳性。RT-qPCR结果表明,Desmin和MyoG基因分化后的相对表达量分别是分化前的5.68和10.38倍,而Pax7和MyoD1基因分化前的相对表达量分别是分化后的7.01和5.51倍。【结论】建立了鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系,为今后进行家鸽肌肉发育的研究提供细胞模型。     

PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

【目的】探究蛋白酶体β5亚基(proteasome subunit beta type-5, PSMB5)对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究蛋白酶体亚基PSMB5在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。【方法】利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,模拟牛骨骼肌生长发育过程,首先检测牛骨骼肌卫星细胞分化前后PSMB5的表达变化,采用qRT-PCR法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后基因表达水平的差异,采用Western blotting法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后蛋白表达水平的差异。然后设计合成PSMB5的小干扰RNAsi-RNA-PSMB5 (si-PSMB5),构建PSMB5过表达质粒载体pcDNA3.1-PSMB5(pcDNA-PSMB5),采用(Lipofectamine)3000转染试剂将si-PSMB5和pcDNA-PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法及Western blotting法检测转染效果。最后采用EdU染色的方法检测干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星增殖的影响;进一步对牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,光学显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态,Western blotting检测分化标志因子肌球蛋白重链(MyHC)蛋白水平的表达变化,分析干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响,综合分析PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响。【结果】PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后PSMB5的mRNA和蛋白表达量均显著高于增殖期(P0.05)。干扰或过表达PSMB5后,牛骨骼肌卫星细胞EdU阳性细胞率与对照组相比,差异均不显著(P0.05)。干扰PSMB5的表达后,细胞分化形成的肌管数量明显少于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著低于对照组(P0.05);而过表达PSMB5后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著高于对照组(P0.05)。【结论】PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞的增殖没有明显影响,但对牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程具有显著的调控作用。干扰PSMB5表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化进程,而过表达PSMB5可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化进程。探明PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的具体调控作用,为进一步开展PSMB5在牛成肌分化中的调控机制研究奠定了基础。     

PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

【目的】探究蛋白酶体β5亚基（proteasome subunit beta type-5, PSMB5）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究蛋白酶体亚基PSMB5在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。【方法】利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,模拟牛骨骼肌生长发育过程,首先检测牛骨骼肌卫星细胞分化前后PSMB5的表达变化,采用qRT-PCR法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后基因表达水平的差异,采用Western blotting 法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后蛋白表达水平的差异。然后设计合成PSMB5的小干扰RNA si-RNA-PSMB5（si-PSMB5）,构建PSMB5过表达质粒载体pcDNA3.1-PSMB5（pcDNA-PSMB5）,采用（Lipofectamine）3000转染试剂将si-PSMB5和pcDNA-PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法及Western blotting法检测转染效果。最后采用EdU染色的方法检测干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星增殖的影响;进一步对牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,光学显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态,Western blotting检测分化标志因子肌球蛋白重链（MyHC）蛋白水平的表达变化,分析干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响,综合分析PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响。【结果】PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后PSMB5的mRNA和蛋白表达量均显著高于增殖期（P<0.05）。干扰或过表达PSMB5后,牛骨骼肌卫星细胞EdU阳性细胞率与对照组相比,差异均不显著（P>0.05）。干扰PSMB5的表达后,细胞分化形成的肌管数量明显少于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著低于对照组（P<0.05）;而过表达PSMB5后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.05）。【结论】PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞的增殖没有明显影响,但对牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程具有显著的调控作用。干扰PSMB5表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化进程,而过表达PSMB5可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化进程。探明PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的具体调控作用,为进一步开展PSMB5在牛成肌分化中的调控机制研究奠定了基础。     

lncRNA-HZ5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控作用研究

为探究lncRNA对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程的影响,选取前期测序结果中在牛肌卫星细胞成肌分化前后差异表达且表达丰度较高的lncRNA-HZ5进行成肌分化调控研究,利用q RT-PCR技术对其在牛骨骼肌卫星细胞成肌分化前后的表达变化进行检测,然后设计合成lncRNA-HZ5的si RNA,转染牛骨骼肌卫星细胞,抑制lncRNA-HZ5表达,之后将肌卫星细胞进行成肌分化诱导,通过肌管形成状态和MHC表达水平检测分析lncRNA-HZ5表达水平改变对肌卫星细胞成肌分化过程的影响。结果表明:lncRNA-HZ5在成肌分化前后的表达存在显著差异,干扰lncRNA-HZ5表达后的肌卫星细胞经成肌分化诱导,肌管数量及MHC的表达量均显著高于对照组,说明下调lncRNA-HZ5表达可以显著促进肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,lncRNA-HZ5可以负调控牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。     

干扰TP53INP2抑制牛成肌细胞分化

【背景】肌肉可以维持哺乳动物运动功能并调节机体代谢,它的数量和分布对肉质有重要影响,骨骼肌的生长发育及其遗传特性在很大程度上影响甚至决定家畜的产肉量和肉品质,研究骨骼肌的生长发育具有重要意义。TP53INP2对自噬的调控作用以及对前体脂肪细胞分化的调控机制已有研究,而对于牛成肌细胞分化的影响尚未报道。【目的】探究TP53INP2对秦川牛成肌细胞分化的影响,为肉牛肉用性状分子育种工作提供理论依据。【方法】利用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR）技术检测了TP53INP2在24月龄秦川牛不同组织中的表达特性,同时分析了其在体外培养的牛骨骼肌成肌细胞不同分化时期的表达规律;合成TP53INP2基因siRNA并转染秦川牛成肌细胞,转染后12h进行诱导分化,观察成肌细胞表型变化,并利用RT-qPCR技术和Western Blot技术分别检测其在诱导分化第四天时分化标志基因和蛋白的表达情况。【结果】1.RT-qPCR结果显示,TP53INP2在成年秦川牛背最长肌组织中表达量最高,在小肠组织中表达量最低。TP53INP2在成年牛心脏、肝脏、肾脏、网胃、瘤胃中表达量较高,在其余组织中表达量较低（与背最长肌相比）。2.随着成肌细胞的分化,该基因在第0—4天表达量呈上升趋势且在第4天达到峰值,随后表达量呈下降趋势。3.在成肌细胞中干扰TP53INP2后,试验组肌管的数量和长度均显著低于对照组。4.干扰TP53INP2并提取细胞总RNA,RT-qPCR结果显示,成肌细胞分化标志基因肌细胞生成素（MYOG）和肌球重链蛋白3（MYH3）相对于对照组表达量显著降低。5.干扰TP53INP2并提取细胞总蛋白,Western Blot结果显示,试验组MYOG、MYH3、MYOD的蛋白表达量均降低且与对照组相比差异极显著。【结论】干扰TP53INP2对牛成肌细胞的分化具有抑制作用,提示该基因可能对秦川牛肌肉组织的生长发育具有重要的调控作用,可对其进行深入的功能研究以期用于肉牛的分子育种实践中。     

阻断PI3K/AKT通路通过激活FoxO1抑制 猪骨骼肌卫星细胞分化

【目的】在骨骼肌生长或损伤刺激下,骨骼肌卫星细胞被激活、增殖分化形成肌管,促进骨骼肌的生长发育或修复组织创伤。FoxO1负调控骨骼肌的生成,但在骨骼肌卫星细胞分化过程中的作用未见报道。因此,笔者探索FoxO1对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响,希望为深入研究FoxO1调控骨骼肌生长发育的作用机理奠定基础。【方法】以1-3日龄健康大白猪为材料,采用单根肌纤维法分离培养猪骨骼肌卫星细胞,接种第2天、第4天和第6天在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。在细胞分化第8天,用免疫荧光染色方法染肌管,DAPI染核,并在荧光倒置显微镜下观察拍照。 待细胞汇合至70%-80%时,将培养基换成含50 nmol•L-1 渥曼青霉素（wortmannin,WM）的分化培养基,分别于细胞分化第0天、第4天和第8 天收集细胞,提取总RNA和总蛋白,采用real-time qPCR和Western blotting方法检测WM对FoxO1以及骨骼肌卫星细胞分化标志基因表达的影响。【结果】猪骨骼肌卫星细胞在接种第2天开始贴壁,呈梭形。第4天细胞数量增加,部分发生融合。第6天时细胞呈方向性生长。第8天细胞进一步融合形成肌管。WM处理组的FoxO1 mRNA表达水平未发生显著变化（P＞0.05）,非磷酸化的FoxO1蛋白表达显著高于对照组（P＜0.05）,而p-FoxO1蛋白表达较对照组显著下降（P＜0.05）。WM处理组的细胞在分化第8天,虽然也出现了蜂窝状生长,但是与对照组相比细胞未呈方向性生长并形成肌管。Western blotting结果显示,WM明显抑制猪骨骼肌卫星细胞分化早期标志基因MyoD、中后期标志基因MyoG和末期标志基因MyHC蛋白的表达。【结论】以WM阻断PI3K信号通路能使FoxO1去磷酸化,抑制猪骨骼肌卫星细胞的分化,延迟肌管的形成,并降低成肌分化标志基因MyoD、MyoG和MyHC的表达。总之,阻断PI3K信号通路通过激活FoxO1抑制猪骨骼肌卫星细胞分化。     

不同代次牛成肌细胞的诱导分化及相关基因的表达分析

利用初生荷斯坦牛的成肌细胞,在不同代次以含体积分数为2%马血清的DMEM进行诱导分化,在之后0、2、4、6、8、10d观察细胞的形态变化并收集细胞提取总RNA,检测成肌相关基因的表达情况,为进一步研究牛肌肉发生过程及相关基因的表达调控提供依据。同时利用实时荧光定量PCR分别检测肌性相关基因MyoD(生肌决定因子)、MyoG(肌细胞生成素)以及非肌性相关基因A-FABP(脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白)表达水平的变化。研究表明:1各代细胞在诱导培养4d后开始有肌管形成,其后越来越多,8d时达高峰。2成肌细胞向成熟肌细胞分化过程中,MyoD、MyoG、A-FABP基因都呈先上升然后下降的趋势。3高代次成肌细胞比低代次细胞增殖慢,而且在诱导分化后,肌管的数目明显变少;MyoD、MyoG、A-FABP随着代次的升高而下降。故推断MyoD、MyoG以及A-FABP基因会在成肌分化开始后的不同阶段被激活,从而发挥不同的调控作用,而且随着传代次数的增加成肌细胞的分化能力减弱。     

不同鹅种肌肉生长抑制素基因表达差异研究

以太湖鹅和罗曼鹅为研究素材,应用实时荧光定量PCR技术和ELISA技术,对MSTN基因在2个鹅种中的表达差异及其与骨骼肌生长的相关性进行比较研究。结果发现,2个鹅品种下丘脑、垂体、肝脏中MSTN基因基本都不表达,只在胸肌、腿肌中表达。罗曼鹅腿肌重显著高于太湖鹅,太湖鹅腿肌MSTN基因表达量却极显著高于罗曼鹅;腿肌率和胸肌MSTN蛋白表达量呈显著正相关,腹脂率和胸肌MSTN基因表达量呈显著正相关;表明MSTN基因发挥着抑制骨骼肌生长的作用,同时可以促进脂肪的积累。在2个鹅种中,公鹅腿肌MSTN蛋白表达量高于母鹅,表明70日龄时的仔鹅腿肌生长母鹅快于公鹅;腿肌MSTN基因表达量显著高于胸肌,提示70日龄时的仔鹅胸肌生长速度远远大于腿肌。     

过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其成肌诱导分化

【目的】通过建立过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1基因的异位表达研究其在成肌分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1基因,并将其cDNA终止密码子TGA定向突变为GGA,定向克隆至带有增强型水母绿色荧光蛋白（ehanced green fluorescent protein,eGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1,经过酶切、测序鉴定后,采用LipofectiminTM LTX转染山羊胎儿成纤维细胞（goat embryonic fibroblast,GEF）以建立MyoD1异位表达细胞株并采用成肌诱导分化培养液进行成肌诱导分化,探究MyoD1在成肌过程中的生物学功能。【结果】成功克隆山羊MyoD1基因,并在MyoD1 的开放阅读框（ORF）两端引入XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点,将其终止密码子TGA定点突变为GGA,定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体,获得融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1;经G418（400 μg•mL-1）筛选2周后,获得MyoD1异位表达的GEF细胞株;间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay,IFA）检测结果显示该细胞株能够表达Myf-5等成肌相关免疫学标志;采用成肌分化培养基分化培养处理2—3 d可见少量肌管产生,并表达MyoG、Desmin和MyHC等早期成肌分化标志,处理5 d可见大量肌管形成。【结论】成功克隆出山羊MyoD1基因,构建了pEGFP-MyoD1真核表达载体并建立过表达MyoD1 GEF细胞系,过表达MyoD1 GEF系能够在成肌诱导培养液诱导形成肌管。     

太湖鹅与皖西白鹅腿肌GHR、IGF-I、IGF-IR和IGFBP-3 mRNA表达及其与屠宰性状相关性分析（英文）

[目的]探讨IGFs系统对鹅骨骼肌生长的影响。[方法]以太湖鹅和皖西白鹅为研究材料,采用荧光定量PCR方法研究鹅70日龄腿肌中GHR、IGF-I、IGF-IR和IGFBP-3 mRNA表达的品种、性别特异性,并与屠宰性能做相关性分析。[结果]结果表明,鹅腿肌GHR、IGF-I、IGFIR和IGFBP-3 mRNA表达没有品种差异性,而体重和腿肌重品种差异显著。体重、腿肌重和腿肌率均无性别差异,除了太湖鹅腿肌IGF-I mRNA表达公鹅显著大于母鹅（P=0.032）,其他3个基因均无性别差异。检测的4个基因中仅IGFBP-3 mRNA表达和腿肌率呈极显著正相关,提示70日龄时IGFs系统可能通过IGFBP-3发挥对鹅腿肌生长的调节作用。[结论]为鹅骨骼肌生长发育研究工作提供理论依据。