PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

【目的】探究蛋白酶体β5亚基（proteasome subunit beta type-5, PSMB5）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究蛋白酶体亚基PSMB5在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。【方法】利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,模拟牛骨骼肌生长发育过程,首先检测牛骨骼肌卫星细胞分化前后PSMB5的表达变化,采用qRT-PCR法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后基因表达水平的差异,采用Western blotting 法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后蛋白表达水平的差异。然后设计合成PSMB5的小干扰RNA si-RNA-PSMB5（si-PSMB5）,构建PSMB5过表达质粒载体pcDNA3.1-PSMB5（pcDNA-PSMB5）,采用（Lipofectamine）3000转染试剂将si-PSMB5和pcDNA-PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法及Western blotting法检测转染效果。最后采用EdU染色的方法检测干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星增殖的影响;进一步对牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,光学显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态,Western blotting检测分化标志因子肌球蛋白重链（MyHC）蛋白水平的表达变化,分析干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响,综合分析PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响。【结果】PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后PSMB5的mRNA和蛋白表达量均显著高于增殖期（P<0.05）。干扰或过表达PSMB5后,牛骨骼肌卫星细胞EdU阳性细胞率与对照组相比,差异均不显著（P>0.05）。干扰PSMB5的表达后,细胞分化形成的肌管数量明显少于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著低于对照组（P<0.05）;而过表达PSMB5后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.05）。【结论】PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞的增殖没有明显影响,但对牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程具有显著的调控作用。干扰PSMB5表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化进程,而过表达PSMB5可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化进程。探明PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的具体调控作用,为进一步开展PSMB5在牛成肌分化中的调控机制研究奠定了基础。     

阻断PI3K/AKT通路通过激活FoxO1抑制 猪骨骼肌卫星细胞分化

【目的】在骨骼肌生长或损伤刺激下,骨骼肌卫星细胞被激活、增殖分化形成肌管,促进骨骼肌的生长发育或修复组织创伤。FoxO1负调控骨骼肌的生成,但在骨骼肌卫星细胞分化过程中的作用未见报道。因此,笔者探索FoxO1对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响,希望为深入研究FoxO1调控骨骼肌生长发育的作用机理奠定基础。【方法】以1-3日龄健康大白猪为材料,采用单根肌纤维法分离培养猪骨骼肌卫星细胞,接种第2天、第4天和第6天在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。在细胞分化第8天,用免疫荧光染色方法染肌管,DAPI染核,并在荧光倒置显微镜下观察拍照。 待细胞汇合至70%-80%时,将培养基换成含50 nmol•L-1 渥曼青霉素（wortmannin,WM）的分化培养基,分别于细胞分化第0天、第4天和第8 天收集细胞,提取总RNA和总蛋白,采用real-time qPCR和Western blotting方法检测WM对FoxO1以及骨骼肌卫星细胞分化标志基因表达的影响。【结果】猪骨骼肌卫星细胞在接种第2天开始贴壁,呈梭形。第4天细胞数量增加,部分发生融合。第6天时细胞呈方向性生长。第8天细胞进一步融合形成肌管。WM处理组的FoxO1 mRNA表达水平未发生显著变化（P＞0.05）,非磷酸化的FoxO1蛋白表达显著高于对照组（P＜0.05）,而p-FoxO1蛋白表达较对照组显著下降（P＜0.05）。WM处理组的细胞在分化第8天,虽然也出现了蜂窝状生长,但是与对照组相比细胞未呈方向性生长并形成肌管。Western blotting结果显示,WM明显抑制猪骨骼肌卫星细胞分化早期标志基因MyoD、中后期标志基因MyoG和末期标志基因MyHC蛋白的表达。【结论】以WM阻断PI3K信号通路能使FoxO1去磷酸化,抑制猪骨骼肌卫星细胞的分化,延迟肌管的形成,并降低成肌分化标志基因MyoD、MyoG和MyHC的表达。总之,阻断PI3K信号通路通过激活FoxO1抑制猪骨骼肌卫星细胞分化。     

牛LncRNA-133a对骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

【目的】 探讨长链非编码RNA LncRNA-133a对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化过程的影响。【方法】 利用测序样品3、6、9月龄胎牛及24月龄成年和牛骨骼肌肌肉组织,qRT-PCR法检测LncRNA-133a的组织时序表达谱。构建牛骨骼肌卫星细胞的体外成肌诱导分化模型,模拟牛骨骼肌的生长发育过程,qRT-PCR法检测LncRNA-133a和肌细胞分化标记因子MyoG、MHC的细胞时序表达谱。利用过表达LncRNA-133载体（pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a） 或LncRNA-133a抑制物（si-LncRNA 133a） 转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法检测转染效率以及各转染处理组LncRNA-133a、MyoD、MyoG及MHC基因mRNA的表达水平,Western blotting检测MHC 基因的蛋白表达水平;同时,通过EdU细胞增殖检测、免疫荧光蛋白染色技术检测牛骨骼肌卫星细胞增殖阶段的细胞增殖量和分化阶段的肌管融合程度。【结果】 组织表达谱分析发现LncRNA-133a在3月龄胎牛肌肉组织中表达量最高,6月龄胎牛肌肉组织中次之,9月龄胎牛及成年牛肌肉组织中表达量最低,时序表达呈下降趋势;利用成功构建的牛骨骼肌卫星细胞体外诱导分化模型,进行LncRNA-133a、MyoG、MHC的细胞时序表达谱分析,结果发现在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中（D0-D3）,肌分化标记因子MyoG、MHC的表达水平逐渐升高,LncRNA-133a的表达在分化阶段呈上升趋势,且分化48 h时（D2）表达量最高;成功构建的过表达LncRNA-133a或抑制LncRNA-133a的牛骨骼肌卫星细胞模型,在增殖期（D0）：与对照组相比,过表达LncRNA-133a处理组EdU增殖染色检测得到EdU阳性细胞数显著增加（P<0.01）,而LncRNA-133a抑制处理组EdU阳性细胞数显著减少（P<0.01）;在分化48 h时（D2）：与对照组相比,LncRNA-133a过表达处理组肌细胞分化标记因子MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平显著升高（P<0.05）,Western blotting检测MHC蛋白表达量显著增加（P<0.01）,且MHC蛋白的免疫荧光蛋白染色检测观察到融合肌管的体积占比更大;而LncRNA-133a抑制处理组MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平均降低,其中MyoG显著降低（P<0.05）, MHC蛋白表达量显著减少（P<0.01）,同时MHC蛋白融合肌管的体积占比也降低。【结论】 研究证实LncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的作用,为进一步挖掘LncRNA-133a调节牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控网络机制奠定了基础。     

lncRNA-HZ5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控作用研究

为探究lncRNA对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程的影响,选取前期测序结果中在牛肌卫星细胞成肌分化前后差异表达且表达丰度较高的lncRNA-HZ5进行成肌分化调控研究,利用q RT-PCR技术对其在牛骨骼肌卫星细胞成肌分化前后的表达变化进行检测,然后设计合成lncRNA-HZ5的si RNA,转染牛骨骼肌卫星细胞,抑制lncRNA-HZ5表达,之后将肌卫星细胞进行成肌分化诱导,通过肌管形成状态和MHC表达水平检测分析lncRNA-HZ5表达水平改变对肌卫星细胞成肌分化过程的影响。结果表明:lncRNA-HZ5在成肌分化前后的表达存在显著差异,干扰lncRNA-HZ5表达后的肌卫星细胞经成肌分化诱导,肌管数量及MHC的表达量均显著高于对照组,说明下调lncRNA-HZ5表达可以显著促进肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,lncRNA-HZ5可以负调控牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。     

鸽骨骼肌卫星细胞的分离、培养及成肌特性

【目的】探讨白羽王鸽Columba livia骨骼肌卫星细胞的分离、培养和鉴定的方法,建立完整的家鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系。【方法】选择孵化16 d的鸽胚作为试验材料,采用组织块贴壁法和胶原酶消化法分离胸肌的骨骼肌卫星细胞并绘制其生长曲线。待卫星细胞分化出肌管后,采用免疫荧光法检测肌球蛋白重链(MyHC)的表达;在细胞分化出肌管前、后分别提取总RNA,采用RT-qPCR方法检测Desmin、Pax7、MyoG和MyoD1基因在细胞分化出肌管前、后的相对表达量。【结果】组织块贴壁法和胶原酶法均能成功地分离出骨骼肌卫星细胞,其生长曲线呈"S"型;该细胞经含体积分数为20%FBS的DMEM高糖培养液培养7 d后视野中出现大量明显可见的肌管,成肌特异性标志MyHC表达呈阳性。RT-qPCR结果表明,Desmin和MyoG基因分化后的相对表达量分别是分化前的5.68和10.38倍,而Pax7和MyoD1基因分化前的相对表达量分别是分化后的7.01和5.51倍。【结论】建立了鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系,为今后进行家鸽肌肉发育的研究提供细胞模型。     

UCH-L3通过影响RAD51调控牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化

本研究旨在探究泛素蛋白酶体系统中羧基末端水解酶L3(UbiquitinC-TerminalHydrolase L3,UCH-L3)通过影响RAD51调控牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的机制。使用已经建立的牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化模型，体外模拟骨骼肌的发育过程，采用免疫沉淀技术检测UCH-L3与RAD51是否相互作用，检测UCH-L3是否调控RAD51的泛素化水平，设计并合成RAD51的si-RNA，转染牛骨骼肌卫星细胞，筛选出有显著干扰效果的si-RNA，研究干扰RAD51后增殖和分化标志基因PAX7和MyHC表达水平变化，综合分析UCH-L3通过影响RAD51调控牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的机制。结果表明：过表达UCH-L3后RAD51的蛋白水平显著升高，UCH-L3可以调控RAD51的表达水平。UCH-L3与RAD51存在体内相互作用，UCH-L3可以影响RAD51的蛋白稳定性，干扰UCH-L3表达可以缩短RAD51的半衰期，UCH-L3能够调控RAD51泛素化水平，干扰RAD51后，牛骨骼肌卫星细胞增殖标志因子PAX7的蛋白水平与对照组无差异，分化标志因子MyHC的蛋白水...     

鹅成肌细胞的体外培养、鉴定及温度对细胞增殖分化的影响

骨骼肌的生长发育与动物生长性状有很强的关联性,建立鹅成肌细胞培养方法对于鹅骨骼肌生长发育的研究具有重要意义.本研究使用马岗鹅胚胎期15 d左右的胸腿肌组织,通过胰蛋白酶消化法分离细胞,差速贴壁法纯化成肌细胞;通过对成肌细胞分化决定因子Myog和成熟肌管标志基因Myh1的表达量进行检测,并结合肌管标志蛋白MyHC免疫荧光染色对分离纯化并诱导分化的成肌细胞进行鉴定.本研究发现腿肌成肌细胞增殖分化能力显著高于胸肌,成肌细胞在39℃培养温度下增殖分化能力高于37℃.本研究成功建立了马岗鹅胚成肌细胞系,对后续进行鹅骨骼肌发育调控机理研究具有重要意义.     

FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡和分化的调控

【目的】骨骼肌是动物机体的重要组成成分,其生长发育直接影响畜禽肉产量,叉头转录因子O1(forkhead box protein O1, FoxO1)作为重要的转录调控因子,其与骨骼肌生长发育密切相关。探究过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡与分化的作用,为肉牛遗传改良提供基础材料。【方法】采集牛的多个组织样品,提取其RNA并反转录,利用实时荧光定量PCR(qPCR)构建FoxO1组织表达谱。利用酶消化法分离得到牛骨骼肌细胞,通过观察其分化后肌管的形成以及qPCR检测其分化标志基因的表达情况来检验所分离细胞的分化性能。利用免疫荧光技术对牛骨骼肌细胞进行FoxO1亚细胞定位。设计并包装牛FoxO1过表达腺病毒,以提高牛骨骼肌细胞内FoxO1的表达。利用EdU染色检测过表达FoxO1对细胞相对增殖率的影响。利用流式细胞术检测过表达FoxO1对细胞周期分布的影响。利用qPCR检测过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡和分化相关基因表达水平的影响。【结果】组织表达谱结果显示FoxO1在多个组织中均有表达,其在成年牛的背脂中表达量最高,在背最长肌组织中表达量最低,且FoxO1在犊牛背最长肌...     

过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其成肌诱导分化

【目的】通过建立过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1基因的异位表达研究其在成肌分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1基因,并将其cDNA终止密码子TGA定向突变为GGA,定向克隆至带有增强型水母绿色荧光蛋白（ehanced green fluorescent protein,eGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1,经过酶切、测序鉴定后,采用LipofectiminTM LTX转染山羊胎儿成纤维细胞（goat embryonic fibroblast,GEF）以建立MyoD1异位表达细胞株并采用成肌诱导分化培养液进行成肌诱导分化,探究MyoD1在成肌过程中的生物学功能。【结果】成功克隆山羊MyoD1基因,并在MyoD1 的开放阅读框（ORF）两端引入XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点,将其终止密码子TGA定点突变为GGA,定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体,获得融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1;经G418（400 μg•mL-1）筛选2周后,获得MyoD1异位表达的GEF细胞株;间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay,IFA）检测结果显示该细胞株能够表达Myf-5等成肌相关免疫学标志;采用成肌分化培养基分化培养处理2—3 d可见少量肌管产生,并表达MyoG、Desmin和MyHC等早期成肌分化标志,处理5 d可见大量肌管形成。【结论】成功克隆出山羊MyoD1基因,构建了pEGFP-MyoD1真核表达载体并建立过表达MyoD1 GEF细胞系,过表达MyoD1 GEF系能够在成肌诱导培养液诱导形成肌管。     

干扰TP53INP2抑制牛成肌细胞分化

【背景】肌肉可以维持哺乳动物运动功能并调节机体代谢,它的数量和分布对肉质有重要影响,骨骼肌的生长发育及其遗传特性在很大程度上影响甚至决定家畜的产肉量和肉品质,研究骨骼肌的生长发育具有重要意义。TP53INP2对自噬的调控作用以及对前体脂肪细胞分化的调控机制已有研究,而对于牛成肌细胞分化的影响尚未报道。【目的】探究TP53INP2对秦川牛成肌细胞分化的影响,为肉牛肉用性状分子育种工作提供理论依据。【方法】利用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR）技术检测了TP53INP2在24月龄秦川牛不同组织中的表达特性,同时分析了其在体外培养的牛骨骼肌成肌细胞不同分化时期的表达规律;合成TP53INP2基因siRNA并转染秦川牛成肌细胞,转染后12h进行诱导分化,观察成肌细胞表型变化,并利用RT-qPCR技术和Western Blot技术分别检测其在诱导分化第四天时分化标志基因和蛋白的表达情况。【结果】1.RT-qPCR结果显示,TP53INP2在成年秦川牛背最长肌组织中表达量最高,在小肠组织中表达量最低。TP53INP2在成年牛心脏、肝脏、肾脏、网胃、瘤胃中表达量较高,在其余组织中表达量较低（与背最长肌相比）。2.随着成肌细胞的分化,该基因在第0—4天表达量呈上升趋势且在第4天达到峰值,随后表达量呈下降趋势。3.在成肌细胞中干扰TP53INP2后,试验组肌管的数量和长度均显著低于对照组。4.干扰TP53INP2并提取细胞总RNA,RT-qPCR结果显示,成肌细胞分化标志基因肌细胞生成素（MYOG）和肌球重链蛋白3（MYH3）相对于对照组表达量显著降低。5.干扰TP53INP2并提取细胞总蛋白,Western Blot结果显示,试验组MYOG、MYH3、MYOD的蛋白表达量均降低且与对照组相比差异极显著。【结论】干扰TP53INP2对牛成肌细胞的分化具有抑制作用,提示该基因可能对秦川牛肌肉组织的生长发育具有重要的调控作用,可对其进行深入的功能研究以期用于肉牛的分子育种实践中。     

猪骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定及其生物学特性

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37℃、5%CO_2细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈"S"型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异(P0.01)。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点(P0.01);CEBP/β和HSL表达趋势一致,均呈先升高后降低趋势。诱导成骨分化后,发现细胞形态变为不规则状,诱导后期细胞复层生长形成骨钙结节,茜素红染色可见圆形不透明钙化结节,数量和密度较未诱导时期都明显增加,结果表明细胞出现成骨向分化。成骨标志基因BGLAP、RUNX2的表达量也随诱导进程呈稳步上升趋势,相比未诱导细胞差异极显著(P0.01)。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。     

山羊MyoG启动子的克隆和活性检测

【目的】肌细胞生成素(myogenin,MyoG) 是生肌调节因子(MRFs)基因家族中唯一能在骨骼肌细胞发育与生长过程中均可表达的调控因子, 在肌肉细胞分化过程中起着中心调控的作用,它正调控着骨骼肌卫星细胞向成熟肌细胞分化的过程,是唯一不可代替的生肌调节因子。MyoG基因在复制、扩增、基因激活、转录、翻译等多级水平上对肌肉发育进行调控。基因转录的起始阶段是机体生长发育因子进行调控的开端,而此阶段调控的实质是通过启动子和上游调控序列的相互作用,调控目的基因的表达。因此克隆MyoG基因的启动子,探讨启动子区域的启动活性,有助于从理论上揭示MyoG基因表达的关键调控位点,同时也有利于揭示肌肉发育调控的相关机理,为治疗人类相关疾病以及改良家畜肉质研究提供实验依据。本研究克隆山羊Myogenin（MyoG）基因的启动子区域,检测其在哺乳动物骨骼肌细胞内的启动活性。【方法】克隆山羊MyoG基因的启动子序列,连入pDsRed2基本骨架构建了以红荧光蛋白基因为标记基因的真核表达载体pDsRed-GoatMyoG(5.3 kb)。表达载体pDsRed-GoatMyoG经酶切和测序鉴定后,分别转染体外培养的绵羊肌卫星细胞、肌管细胞和成纤维细胞,观察红色荧光蛋白表达情况,然后利用实时荧光定量PCR、Western blot和冰冻切片、免疫组化等技术检测细胞转染后标记基因mRNA 和蛋白在体外培养细胞中的的表达活性。pDsRed-GoatMyoG表达载体对小鼠进行肌肉注射,检测GoatMyoG启动子在体内组织中的启动特异性和效率。肌肉注射5 d后,分别取小鼠的注射腿肌肉组织、非注射腿肌肉组织、睾丸组织、肠组织和肝脏组织,通过实时荧光定量 PCR 检测标记基因DsRed在不同组织中的表达情况。【结果】克隆得到的MyoG启动子序列测序正确,载体pDsRed-GoatMyoG经酶切和测序鉴定,证实载体构建成功;转染质粒 pDsRed-GoatMyoG后,肌卫星细胞和肌管细胞在显微镜下均可观察到细胞发红色荧光,成纤维细胞没有红色荧光。通过实时荧光定量PCR检测得出,转基因肌管细胞内GoatMyoG 启动DsRed 基因表达mRNA 的相对量为14.07;通过Western blot技术检测出转基因肌管细胞含有GoatMyoG启动的DsRed蛋白质,在转基因成纤维细胞内没有检测到 DsRed 蛋白质,说明GoatMyoG启动子可在肌肉组织特异性启动外源基因表达。小鼠肌肉注射pDsRed-GoatMyoG质粒后,注射腿肌肉组织内GoatMyoG 启动DsRed 基因转录mRNA 的相对量为212.32,非注射腿肌肉组织内mRNA的相对量为39.76,注射腿肌肉组织和非注射腿肌肉组织内mRNA 的量均是其它组织的1.99倍以上。通过免疫组化技术在注射腿肌肉组织和非注射腿肌肉组织内均可检测到红色荧光蛋白,在睾丸、肠和肝脏内均未检测到DsRed 蛋白。【结论】山羊MyoG启动子可以特异性的在骨骼肌组织驱动外源基因的表达,是一种有效的肌肉特异性启动子。     

北京油鸡骨骼肌卫星细胞的分离、培养、鉴定及成肌诱导分化的研究

【目的】探讨体外培养条件下北京油鸡骨骼肌卫星细胞分离、培养及鉴定的方法,建立适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,为今后进一步研究北京油鸡骨骼肌卫星细胞提供技术平台。【方法】以15日龄的鸡胚胸肌为材料,采用联合酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法纯化细胞,使用Pax7、Desmin、Myod等骨骼肌卫星细胞的特异性标志对所得细胞进行免疫荧光鉴定,随后进行成肌诱导分化,并比较了3种培养体系对骨骼肌卫星细胞增殖的影响。【结果】细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,证实所培养的细胞为北京油鸡骨骼肌卫星细胞;成肌诱导后,细胞相互融合形成多核的肌管,成肌特异性标志MHC表达呈阳性;对不同扩增培养体系比较,结果表明,培养体系DMEM/F12+15%FBS+2.5ng·mL-1bFG最有利于北京油鸡骨骼肌卫星细胞的增殖。【结论】该试验成功地分离并鉴定了北京油鸡骨骼肌卫星细胞,建立了适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,同时成功地进行了成肌诱导分化,为今后研究北京油鸡骨骼肌生长和发育的机理提供了技术平台。     

转卵泡抑制素基因对绵羊肌源性细胞中 肌肉抑制素基因的调控

【目的】构建骨骼肌特异表达目的基因卵泡抑制素（follistatin,FST）的真核表达载体pCFCDs-red和 pSPFCDs-red,分别转染到不同细胞系中,检测FST及下游基因在RNA和蛋白水平的表达情况,同时测定骨骼肌特异启动子SP和α-actin的启动效率,以研究FST的特异表达对肌肉发育的影响。【方法】利用脂质体分别将真核表达载体pCFCDs-red和pSPFCDs-red转染到绵羊胎儿成纤维细胞（SFFCs）、骨骼肌卫星细胞（SMSCs）和SMSCs诱导肌管中,获得转基因细胞;对获得细胞的生长状况、细胞周期、细胞形态大小以及目的基因和下游基因的表达情况,分别用流式细胞仪、实时定量PCR和western blotting等方法进行检测分析。【结果】①转基因细胞系的生长趋势与非转基因细胞相似,转基因SMSCs细胞增殖的速度高于转基因SFFCs细胞;②流式细胞仪分析表明,转基因细胞系转染后70%以上细胞均处于G0/G1期,保持旺盛的分裂能力、具有单一峰值、细胞的整倍性好、细胞电子体积显著增大;③实时定量PCR及western blotting检测结果表明,转基因细胞系中FST的RNA及蛋白水平相比非转基因细胞系均上调;④转基因SMSCs和肌管相比转基因SFFCs细胞的FST表达量高,转pSPFCDs-red转基因细胞中FST的表达水平比转pCFCDs-red细胞系高。【结论】骨骼肌特异性启动子SP及α-actin能够在SMSCs及肌管中有效启动FST目的基因的表达,且在肌管中具有较高的表达量,SP启动子的启动效率较高于α-actin。在肌源性细胞中,FST的上调可以引起MSTN蛋白水平的下调,FST对骨骼肌细胞的生长发育具有一定促进作用。     

猪肌肉干细胞在三维水凝胶中的分化研究

【目的】 探究猪肌肉干细胞在三维水凝胶中的分化效果,为体外诱导肌肉干细胞分化成为肌肉组织提供方法指导。【方法】 将一定数目的猪肌肉干细胞分别在二维和三维条件下诱导分化（二维条件指在培养皿中培养细胞,三维条件指在水凝胶中培养细胞）,分别收取增殖阶段、预分化阶段、分化初期、分化成熟、分化末期的二维培养细胞的RNA和蛋白样品,以及分化7和14 d的三维培养细胞的RNA和蛋白样品。利用RT-qPCR技术检测细胞在两种条件下分化至不同阶段时成肌相关基因MYOG、CAV-3、MyHC-slow、MyHC-2a的表达水平;利用Western Blot技术检测细胞在两种条件下分化至不同阶段时MYOG、MyHC蛋白的表达水平;利用免疫荧光染色技术观察猪肌肉干细胞在二维和三维条件下融合形成的肌管;使用氨基酸自动分析仪检测分化14 d培养肌肉组织的氨基酸含量及组成。【结果】 二维培养的猪肌肉干细胞在分化第3天时开始发生肌融合,在分化第7天形成成熟肌管,随后进入分化末期,肌管开始脱落。三维培养的猪肌肉干细胞在分化第7天时还未完全伸展,细胞的MYOG和CAV-3表达水平低;分化第14天时水凝胶内已形成多核肌管,MYOG和CAV-3表达达到二维分化水平。三维分化有利于终末分化基因MyHC-slow和MyHC-2a的表达,分化14 d时MyHC-slow的表达量是二维分化7 d的12倍,MyHC-2a的表达量是二维分化7 d的4倍,但是MyHC蛋白的表达量仅为二维分化7 d时的1/6。氨基酸分析结果表明体外培养肌肉组织中17种水解氨基酸含量均低于猪肉,且必需氨基酸在总氨基酸的占比也低于猪肉,但是呈味氨基酸的占比相较猪肉更高。【结论】 猪肌肉干细胞可以在三维胶原水凝胶中分化形成肌管,且三维条件有利于成肌分化相关基因表达,但要实现MyHC蛋白的高表达还需进一步研究,按此方法体外培养的肌肉组织有较高的呈味氨基酸含量,可能会有较好的风味。     

猪骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定及其生物学特性

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37 ℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈“S”型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异（P<0.01）。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点（P<0.01）;CEBP/β和HSL表达趋势一致,均呈先升高后降低趋势。诱导成骨分化后,发现细胞形态变为不规则状,诱导后期细胞复层生长形成骨钙结节,茜素红染色可见圆形不透明钙化结节,数量和密度较未诱导时期都明显增加,结果表明细胞出现成骨向分化。成骨标志基因BGLAP、RUNX2的表达量也随诱导进程呈稳步上升趋势,相比未诱导细胞差异极显著（P<0.01）。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。     

绵羊MSTN基因慢病毒表达载体的构建及其对成肌细胞的分化作用

【目的】构建新疆细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,研究其在细毛羊成肌细胞分化中的作用,并探讨其作用机制。【方法】采用RT-PCR技术,扩增MSTN编码区序列,克隆入plex-mcs慢病毒表达载体,构建plex-MSTN慢病毒表达载体,并进行酶切及测序鉴定。将plex-MSTN包装成plex-MSTN慢病毒。用酶消化法分离培养新疆细毛羊成肌细胞,慢病毒感染制备MSTN过表达成肌细胞系,通过马血清诱导分化,Western blotting检测分化细胞MSTN基因的表达,免疫荧光分析分化肌管的融合率及肌管直径,Realtime RT-PCR检测分化相关基因的表达。【结果】 克隆的新疆细毛羊MSTN基因编码区全长序列（1 128 bp）与NCBI上公布的序列99.9%同源,仅在外显子2上存在单碱基突变;Western blotting检测结果显示,MSTN过表达成肌细胞过表达MSTN蛋白;免疫荧光检测表明,MSTN过表达成肌细胞的肌管融合率与肌管直径分别为5.69%和12.35 μm,显著低于非转化成肌细胞（10.21%和18.5 μm）（P<0.05）;Realtime RT-PCR结果显示,MSTN过表达成肌细胞中的Myogenin、p21、MyoD-基因表达显著下调,Smad3基因表达极显著上调（P<0.01）。【结论】 成功构建了细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,MSTN基因对细毛羊成肌细胞的分化具有显著的抑制作用,确定了MSTN基因与Myogenin、p21、MyoD及Smad3基因在成肌细胞分化过程中的调控关系。     

干扰E2F7对C2C12成肌细胞增殖的影响

【目的】探究转录因子E2F7在骨骼肌细胞发育过程中的作用。【方法】以C2C12成肌细胞为研究对象,通过设计小干扰RNA干扰C2C12成肌细胞中E2F7的表达,分为干扰组和对照组,并利用RT-PCR、CCK-8和EdU等技术检测在C2C12成肌细胞中干扰E2F7后对成肌细胞增殖的影响。【结果】E2F7 mRNA表达水平在C2C12成肌细胞增殖期极显著高于分化期(P0.01);与对照组相比,干扰组的细胞活率和新生细胞比率皆极显著高于对照组(P0.01);干扰E2F7显著提升了C2C12成肌细胞中Cyclin E的表达水平(P0.05),极显著促进Cyclin D和CDK4的表达(P0.01);并且干扰E2F7可显著促进E2F2 (P0.05)和极显著促进E2F1及E2F3的表达(P0.01),同时极显著促进与成肌细胞增殖相关microRNAs (miR-7、miR-25、miR-27和miR-92a)的表达(P0.01)。【结论】干扰E2F7可促进C2C12成肌细胞的增殖,E2F7可能是通过调控经典E2Fs信号通路和成肌细胞增殖相关microRNA发挥作用。     

oar-miR-133的表达对巴什拜羊骨骼肌细胞增殖和分化的影响

以巴什拜羊为对象,初步研究oar-miR-133的表达与巴什拜羊骨骼肌发育的关系。结果表明,oar-miR-133在巴什拜羊胎儿期第100天的骨骼肌和心肌中高表达;在巴什拜羊骨骼肌发育的不同阶段,oar-miR-133的表达量有明显的变化,在胎儿期的第100天和初生当天前后,骨骼肌中oar-miR-133的表达量均出现上调;当巴什拜羊骨骼肌卫星细胞处于增殖状态时,oar-miR-133表达量较低,而当骨骼肌卫星细胞处于诱导分化状态时,oar-miR-133表达量迅速升高,显著高于增殖状态(P0.05);当骨骼肌卫星细胞中的oar-miR-133表达水平升高时,骨骼肌卫星细胞几乎停止增殖,细胞有相互融合转化为肌管的趋势,同时细胞内可检测到细胞分化的标志基因MyHC基因的表达;生物信息学分析共预测到96个oar-miR-133的靶基因,GO分析及KEGG信号通路分析结果表明,这些基因在细胞内通过参与一些重要的信号通路而发挥其生物学功能。     

地鳖肽对H2O2刺激鸡骨骼肌卫星细胞增殖的影响

【目的】探讨地鳖肽对H2O2刺激的肌卫星细胞增殖的影响.【方法】采用两步酶消化法体外分离培养鸡骨骼肌卫星细胞(SCs),培养基中加入不同浓度地鳖肽培养细胞24h后H2O2刺激8h,免疫荧光鉴定SCs细胞,MTT法检测细胞存活情况,荧光实时定量PCR分析增殖调控基因表达水平.【结果】分离培养SCs表达Pax7的阳性细胞率达95%以上,两步酶消化法获得骨骼肌卫星细胞;中浓度H2O2单独处理SCs细胞8h后细胞活力下降为65.16%,而当不同浓度地鳖肽预处理SCs细胞后H2O2致细胞活力下降得到缓解;与正常组相比,H2O2降低了肌卫星细胞中Pax7、Myo D和Myf5基因的相对表达量,不同浓度地鳖肽预处理均能显著缓解H2O2导致的增殖调控基因表达降低.【结论】地鳖肽能显著提高SCs增殖调控因子的转录水平,改善H2O2刺激对SCs增殖的抑制作用.