志贺氏菌检测和分群实时荧光PCR方法的建立

为对志贺氏菌属细菌进行快速、准确检测和分群鉴定,根据志贺氏菌invC、rfc、wbgZ和rfpB基因,分别设计引物和探针,建立了鉴定志贺氏菌属以及福氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌和痢疾志贺菌氏菌实时荧光PCR方法,同时将根据ompA基因设计的引物和探针作为内参照,并通过特异性试验和人工接种试验等对该方法进行验证。结果显示,该方法对17株志贺氏菌和19株非志贺氏菌均出现100%的特异性;用增菌肉汤直接进行PCR检测,发现在消毒奶、冰淇淋、酸奶、奶酪、熟肉和香肠等即食食品中的志贺氏菌检出限为1～3 cfu/25 g(mL),在原奶、生肉和奶粉中的检出限分别为≤8 cfu/25 mL、12 cfu/25 g和≤12 cfu/25 g;分离培养后再对可疑菌落进行实时荧光PCR鉴定,发现所有样品的检出限为1～3 cfu/25 g(mL),与传统培养法检出限一致。结果表明,该实时荧光PCR方法是一个快速、敏感、特异的检测方法,适合于志贺氏菌的常规检测分析。     

不同代次大鼠骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞成骨分化比较

本研究旨在观察不同代次骨髓间充质干细胞(BMSCs)和脂肪间充质干细胞(ADSCs)体外培养的生长特点和体外诱导成骨能力。通过密度梯度离心和贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,用含地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并利用茜素红染色、碱性磷酸酶染色及PCR方法检测成骨细胞。结果表明骨髓及脂肪间充质干细胞呈成纤维细胞样生长,增殖能力强,生长迅速。第5、10、15、20代BMSCs及ADSCs经诱导培养后茜素红染色呈阳性并且出现"矿化"、碱性磷酸酶活性强,随着细胞代次的递增,诱导后细胞碱性磷酸酶活性呈递减趋势;诱导后的两类细胞传代后细胞仍能继续分化,并形成正常的"矿化"结节,且碱性磷酸酶染色均弱于初次诱导。结果提示,BMSCs及ADSCs易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨能力强且成骨细胞传代培养仍具有成骨能力,适合作为再生医学骨组织工程的种子细胞。     

以两种不同成纤维细胞为饲养层培养牛胚胎干细胞的比较

牛胚胎干细胞的培养一直未能确定最适合的饲养层,寻找一种适合于其生长的饲养层对于成功培养牛胚胎干细胞有重要意义。本研究以胎鼠和牛胎儿为材料,分别以含10%FBS的高糖DMEM和含10%FBS的DMEMF12为培养液,分离并且获得2～5代的胎鼠成纤维细胞和5～6代的牛胎儿成纤维细胞。在上述两种成纤维细胞为饲养层的条件下,采用含10%胎牛血清、0.1 mmol/Lβ-巯基乙醇、0.1 mmol/L非必须氨基酸、100 U/mL青霉素、0.05 mg/mL链霉素、20 ng/mL LIF和10 ng/mL bFGF的DMEMF12培养液培养牛胚胎干细胞,来寻找一种适合于牛胚胎干细胞培养的饲养层。结果表明,在相同的培养体系条件下培养牛胚胎干细胞,以胎鼠成纤维细胞为饲养层的贴壁率显著高于以牛胎儿成纤维细胞为饲养层的贴壁率(P0.05),以牛胎儿成纤维细胞为饲养层更利于胚胎滋养层的去除。