普通小麦供体种穗发芽抗性相关基因 AIP2的克隆与进化研究

克隆普通小麦3个基因组供体种的穗发芽抗性相关基因 AIP2（ABI3 interacting protein 2）,预测、分析其功能,阐明其保守区域在不同材料间的变异,为其进化研究提供理论依据,同时为普通小麦 AIP2基因的研究以及利用该基因改良穗发芽性状奠定基础。以野生一粒小麦（Triticum boeoticum,AA,2n=14）、拟斯卑尔脱山羊草（Aegilops speltoides,SS,2n=14）、节节麦（Aegilops tauschii, DD, 2n=14）为材料,采用同源克隆的方法克隆 AIP2基因,利用生物信息学软件分析其基因结构及功能,并进行遗传进化分析。结果表明,从小麦3个供体种材料中成功克隆 AIP2基因,该基因开放阅读框非常保守,均为969 bp,编码323个氨基酸残基。3个供体材料间 AIP2氨基酸序列仅存在7个氨基酸残基的差异,结构域预测结果显示,AIP2蛋白含有锌指环家族典型的锌指环结构域,进化分析发现, AIP2基因在植物中非常保守,推测该基因在禾谷类作物中可能具有相似的功能。     

日本文昌鱼ZP蛋白氨基酸序列多样性的初步研究

ZP蛋白家族是一类具有相对保守的ZP结构域的蛋白质,通常在精卵结合过程中起作用。从日本文昌鱼（Branchiostoma japonicum）中发现一种编码927个氨基酸残基的ZP蛋白cDNA。利用SMART预测该ZP蛋白序列含有3个结构域：透明带结构域、跨膜结构域以及低复杂度区域。利用该ZP基因的整个开放阅读框,检测该基因在日本文昌鱼群体中的氨基酸序列多样性。研究结果发现,在9个日本文昌鱼个体中扩增获得序列长度为2 481~2 784 bp,编码826~927个氨基酸。氨基酸序列比对显示,存在55个变异位点,占总氨基酸残基数的5.93%（55/927）,其中有2个个体的氨基酸序列分别存在9个和101个氨基酸残基的缺失,这可能与ZP基因的不同剪切有关。揭示了日本文昌鱼ZP蛋白序列多样性可能与该蛋白的结构与功能多样性具有一定的相关性。     

盐芥STZ转录因子基因的克隆及序列分析

【目的】克隆盐芥STZ转录因子基因,对其进行序列分析,为进一步研究ThSTZ转录因子在逆境应答中的作用奠定基础。【方法】利用GenBank数据库中盐芥STZ转录因子的EST序列设计特异引物,通过3′RACE技术克隆ThSTZ基因的全长序列,应用生物信息学手段对该基因编码蛋白的结构与功能、亚细胞定位等进行预测,并对其编码氨基酸序列的同源性和系统进化进行分析。【结果】盐芥STZ转录因子基因全长717 bp,编码238个氨基酸。其编码蛋白含有2个C2H2型锌指结构域,位于细胞核内,属于C2H2家族转录因子;多重序列比对和系统进化分析表明,盐芥STZ转录因子与拟南芥属植物同源蛋白的相似性最高。【结论】获得了ThSTZ转录因子基因的全长序列,为进一步探讨ThSTZ转录因子在逆境应答中的功能奠定了基础。     

梭梭VHA B基因克隆及序列分析

采用RT PCR和RACE法从超旱生、耐盐植物梭梭（Haloxylon ammodendron）中扩增出VHA B基因cDNA序列，其开放阅读框为1 413 bp，推测编码全长为471个氨基酸残基的氨基酸序列，该蛋白分子量约为52.304 ku，等电点为5.08。运用SMART、DNAMAN、GOR4、TMPred等生物信息学软件对梭梭VHA B功能域、跨膜结构进行分析显示，梭梭VHA B含有3个ATP synt_ab_N 、ATP synt_ab、ATP synt_ab_C结构域，但是不含跨膜结构域和信号肽。氨基酸序列同源性结果显示，HaVHA B与盐爪爪、盐穗木、碱蓬等同源性高达89.68%。说明VHA B基因是一个高度保守基因。     

东方百合‘索邦’组蛋白去乙酰化酶基因 LoSorHDA1的克隆与表达分析

以东方百合‘索邦’（Sorbonne）为材料，结合前期转录组数据，克隆组蛋白去乙酰化酶基因HDA1(Histone deacetylases)，命名为LoSorHDA1。LoSorHDA1序列长1 518 bp，编码505个氨基酸，生物信息学预测含有一个高度保守的组蛋白去乙酰化结构域。系统进化分析表明，LoSorHDA1与拟南芥等物种的HDA1同源蛋白聚为一支，而与HDAC家族其他成员关系较远；LoSorHDA1编码的氨基酸序列与单子叶植物小果野焦（Musa acuminata）的相似度最高，而双子叶植物HDA1则聚为另一支。RT-PCR结果显示：LoSorHDA1在‘索邦’不同组织中普遍表达，其中在茎生根、嫩茎、花被片、花丝、柱头、花柱、子房中表达量较高，在下部叶和花药中表达稍弱。亚细胞定位表达结果表明，LoSorHDA1定位在细胞核和细胞质中。荧光定量PCR结果显示：LoSorHDA1在不同花发育阶段中的各个花部组织中均有不同程度的表达，在雌雄蕊中表达趋势相反，而在内外花被片中的表达趋势较为一致，说明LoSorHDA1可能参与东方百合花发育进程，这为后续LoSorHDA1的去乙酰化修饰在百合花发育中的功能研究奠定基础。     

枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的克隆与表达分析

为探究枸杞查耳酮异构酶CHI1基因在不同组织中的表达模式和功能,利用同源克隆的方法获得1个枸杞（Lycium chinense）LcCHI1基因（Genbank No. OR026273）,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,利用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对其组织表达的特异性进行分析,并进行原核表达分析。结果表明：1）枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的cDNA序列全长695 bp,开放阅读框为633 bp,编码210个氨基酸,含有１个保守的Chalcone_3 family结构域。2）氨基酸序列比对显示,LcCHI1蛋白符合Chalcone蛋白结构特征且与其他物种Chalcone蛋白具有高度的相似性。聚类分析表明,LcCHI1蛋白与茄科的CHI蛋白单独聚成一支。3）LcCHI1在枸杞花、嫩叶与嫩枝中表达量较高,在根中表达量较低。随着枸杞果实的发育,LcCHI1表达呈先升高后降低趋势,在变色果中表达量最高。4）在原核表达载体中构建LcCHI1重组蛋白,经SDS-PAGE电泳分析在63 ku处出现表达蛋白。综上,LcCHI1基因在枸杞花和变色果中表达较高,并能进行原核蛋白表达,研究结果为枸杞类黄酮合成途径中CHI基因的功能验证奠定基础。     

小黑杨RAV1与RAV2基因的克隆与表达分析

【目的】克隆小黑杨（Populus×xiaohei T.S.Hwang et Liang）RAV1和RAV2基因，分析这2个基因在非生物胁迫下的表达模式，为进一步研究小黑杨基因功能提供理论依据。【方法】以抗逆性强的小黑杨根为试材，克隆2个RAV家族成员。利用生物信息学方法对小黑杨2个RAV基因的理化性质、保守基序、保守结构域、系统进化进行分析，并采用半定量 RT-PCR方法探讨这2个基因在小黑杨顶芽、叶、木质部、韧皮部、根、第1～14片叶、第1～11茎节中的表达情况，以及在CdCl₂、NaCl、NaHCO₃、PEG和ABA胁迫下的表达特性。【结果】从小黑杨中克隆出2个RAV基因,命名为PsnRAV1和PsnRAV2。PsnRAV1编码405个氨基酸，预测分子质量约为99.46 ku，等电点5.06，不存在信号肽；PsnRAV2编码407个氨基酸，预测分子质量约为99.33 ku，等电点5.06，存在信号肽；2个基因均位于细胞核上。保守结构域和保守基序分析结果表明，小黑杨RAV蛋白具有RAV家族特有的AP2和B3这2个保守蛋白结构域，基序1、2、3是构成2个结构域的主要基序。系统进化分析表明，20种植物的RAV蛋白分为3组，其中PsnRAV1和PsnRAV2与毛果杨（Populus trichocarpa）RAV同源性很高。半定量RT-PCR分析结果显示，2个PsnRAVs基因在小黑杨的顶芽、叶、木质部、韧皮部和根中均有表达；且随着叶和茎的发育，2个基因的表达量均呈现升高的趋势。在CdCl₂、NaCl、NaHCO₃模拟的重金属及盐胁迫下，2个基因的表达模式虽不相同，但在根部均受到诱导；在PEG模拟的干旱胁迫下，PsnRAV1和PsnRAV2在叶片和根部均有响应，其中在根部受到的诱导更为明显，尤以PsnRAV2的表达更为显著；此外，PsnRAV1和PsnRAV2也受到ABA的诱导，其在叶中的表达量在初期表现为上升，而后期下降。【结论】2个PsnRAVs基因与小黑杨的抗逆性密切相关，可能参与了小黑杨的非生物胁迫应答，其中PsnRAV2在胁迫下的作用更为显著。     

马泰勒虫RON2基因的原核表达及生物信息学分析

【目的】对马泰勒虫棒状体颈部蛋白2（RON2）进行原核表达和生物信息学分析,为后续蛋白互作试验提供材料基础。【方法】以马泰勒虫新疆分离株为研究对象,克隆其RON2基因,并与GenBank中已知的马泰勒虫美国WA株基因组数据和顶复门原虫RON2基因序列本地数据库进行BLAST比对,确定其进化关系。构建重组表达载体pET-32a-RON2,融合表达重组蛋白,对RON2基因编码蛋白进行生物信息学分析。【结果】马泰勒虫新疆株RON2基因（NCBI登录号MT939257）长3 920 bp,高度保守,与顶复门原虫RON2基因核苷酸和氨基酸序列的相似性分别为31.2%～82.7%和23.8%～79.5%。成功构建原核表达重组质粒,获得的RON2融合重组蛋白分子质量为26 ku,为包涵体蛋白。生物信息学分析表明,RON2蛋白是一种碱性、不稳定亲水性跨膜蛋白,二级结构以α螺旋为主,亲水性较差,抗原性较弱,与其他顶复门原虫RON2蛋白具有相似的三级空间特殊结构和氨基酸序列,且可能与其他入侵蛋白存在相互作用关系。【结论】获得马泰勒虫新疆株RON2基因,诱导表达获得部分RON2融合重组蛋白,该蛋白存在与其他入侵相关蛋白相互作用的位点,可能参与了虫体入侵宿主细胞的过程。     

羊口疮病毒安徽株116基因的生物信息学分析及原核表达

为了对羊口疮病毒（Orf virus, ORFV）安徽株116基因进行生物信息学分析及原核表达。以ORFVAH-F10株为模板PCR扩增116基因，使用生物信息学软件预测该基因编码蛋白的结构与功能。同时将扩增产物克隆至pET-32a（＋）原核表达载体，经BamH I及EcoR I双酶切鉴定后进行测序，构建pET-32a（＋）-116重组质粒。转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）进行IPTG诱导，纯化蛋白后免疫BALB/c雌性小鼠制备多克隆抗体。测序结果显示，ORFV116基因全长561 bp，编码186个氨基酸。生物信息学分析结果显示：该蛋白分子量约为20.33 kDa，为不稳定亲水性蛋白；无信号肽、保守结构域及跨膜结构域；含有2个N糖基化位点和42个磷酸化位点；二级结构以无规则卷曲为主，分别为延伸链（5.91%）、α-螺旋（14.52%）与无规则卷曲（79.57%）；预测该蛋白含有20个可能的B细胞优势抗原表位与4个CTL细胞表位。SDS-PAGE及Western-blot结果显示，ORFV116蛋白大小约为51 kDa，主要以可溶形式表达且具有良好的反应原性。     

沙门菌、巴氏杆菌和大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立

旨在建立一种可以应用于临床样本同时检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌感染的多重PCR方法。根据NCBI上已收录的沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌 kmt1基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能够同时检测3种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法可以从沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌以及3种细菌的混合物中扩增出3条大小分别为286 bp、457 bp和652 bp的特异性条带,其他对照组检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×10　、1.99×10　、2.01×10　 CFU/mL;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。可见：所建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的混合感染。     

兰州百合和有斑百合的核型研究

【目的】研究兰州百合及有斑百合的染色体核型。【方法】利用染色体常规压片的方法,对兰州百合和有斑百合的染色体数目及核型进行了研究和分析。【结果】兰州百合的核型公式为2n=2x=24=2m+2sm+6st+14t,相对长度为6.35%～12.07%,核型不对称系数为83.25%,染色体相对差异较大。有斑百合的核型公式为2n=2x=24=4m+12st+8t,相对长度为6.11%～12.90%,核型不对称系数为80.11%。【结论】兰州百合的核型类型属于3A型,有斑百合的核型类型为3B型,以有斑百合核型的进化较高,可见不同居群的百合间核型存在差异。     

二色胡枝子黄酮体外抗氧化活性

通过二色胡枝子黄酮(Lespedeza bicolor flavonoids ,LBF)清除羟自由基、超氧阴离子的效果及抑制猪油、菜油和亚油酸的自氧化来研究其体外抗氧化作用.结果表明:二色胡枝子黄酮对清除自由基有显著作用,且清除率随黄酮浓度的增加而增大;能够明显地抑制猪油、菜油、亚油酸的自氧化,抑制作用随浓度的增大而增强.作为天然的抗氧化剂,二色胡枝子黄酮具有一定开发利用价值.     

美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia的wsp基因分子检测及系统发育分析

【目的】对美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia进行分子生物学鉴定,确定该蓟马体内Wolbachia的进化位置,为进一步探讨Wolbachia对其生殖作用的调控机制提供理论依据。【方法】以wsp基因为目的基因,对美洲棘蓟马体内的共生菌Wolbachia进行特异性扩增和测序,使用Clustal X 1.83软件对所得DNA序列进行比对;在MEGA 4.0软件中采用邻接法对Wolbachia的系统发育关系进行分析。【结果】利用wsp基因的特异性引物从美洲棘蓟马体内扩增出了632 bp的Wolbachia的wsp基因片段(GenBank登录号为JN315668),580 bp的Wolbachia A群的wsp基因片段和405 bp的Mel亚群的wsp基因片段。系统发育分析结果表明,美洲棘蓟马体内的Wolbachia与黑腹果蝇亲缘关系较近。【结论】美洲棘蓟马体内感染的Wolbachia属于A群Mel亚群。     

加州新小绥螨对截形叶螨的捕食作用

为明确加州新小绥螨Neoseiulus californicus(McGregor)对截形叶螨Tetranychus truncate(Ehara)的捕食潜力,采用捕食者功能反应方程及参数研究加州新小绥螨对截形叶螨各螨态捕食作用。结果表明,加州新小绥螨对雌成螨、若螨、卵的选择性捕食系数分别为0.365、1.276和1.390。在不同温度条件下,加州新小绥螨对截形叶螨的功能反应均属于HollingⅡ型;对猎物卵和幼若螨的控制能力最强。在试验温度范围内,加州新小绥螨的捕食能力随温度升高呈先增后减趋势,28℃时最强,对截形叶螨雌成螨、若螨和卵的攻击系数(a)最大,分别为0.639、0.730和0.842;处理时间最短,分别为0.126、0.075和0.039d;最大日捕食量分别为7.943头、13.405头和25.575粒。加州新小绥螨的捕食作用存在较强的种内干扰反应,随着捕食者密度的增大,平均捕食量逐渐减少,捕食作用率也相应降低,捕食作用率与其自身密度的关系为E=0.423P-0.747。     

甘蓝型油菜与黑芥双倍体减数分裂的原位杂交分析

【目的】探明植物杂种后代减数分裂异常与花粉败育之间的关系。【方法】通过甘蓝型油菜与黑芥种间杂交和基因组加倍,获得芸薹属三基因组双倍体,采用基因组原位杂交方法,观察三基因组双倍体花粉母细胞的减数分裂规律。【结果】与单倍体相比,双倍体花粉育性得到一定恢复,但可育花粉的比例较低,只有10%~20%。基因组原位杂交结果显示,双倍体花粉母细胞减数分裂终变期染色体以形成同源二价体为主,但也有部分染色体形成四价体或六价体。四价体有3种形式:B基因组染色体形成的四价体、AC基因组染色体形成的四价体及B与AC基因组之间形成的异配四价体。减数分裂后期Ⅰ染色体均等分离的细胞占总数的70%左右,在第2次减数分裂期也观察到非正常分裂如非四分孢子、微核等现象。【结论】减数分裂过程中的染色体异常行为可能是导致花粉育性不高的重要原因;虽然不正常的减数分裂导致花粉育性下降,但双亲染色体的异源联会可为双亲遗传物质的交换提供条件。     

神经毒素基因RjAa17f在Sf9细胞中的表达及活性分析

【目的】在昆虫草地贪夜蛾细胞(Sf9)中表达一种能专一阻断昆虫钠、钾离子通道的神经毒素基因RjAa17f。【方法】运用杆状病毒真核表达系统表达RjAa17f毒蛋白,并用蛋白质印迹对其进行检测;测定RjAa17f毒蛋白引起健康棉铃虫中肠膜电位的变化,并对其毒力进行测定。【结果】通过重组杆状病毒质粒的转染和Western blot检测验证,神经毒素基因RjAa17f的重组Bacmid已经成功转染到Sf9细胞中,且在Sf9中表达出与预测大小一致的RjAa17f目的蛋白;此毒蛋白作用于棉铃虫中肠3~12h后,中肠膜电位与CK相比差异显著,且随着作用时间的延长,棉铃虫中肠膜电位呈逐步升高的趋势,作用9h以后,升高的幅度逐渐降低,趋于平缓。RjAa17f毒蛋白对棉铃虫的LD50为108.12μg/g。【结论】在Sf9细胞内表达出了有活性的RjAa17f毒蛋白,且该毒蛋白对棉铃虫中肠膜电位有显著改变。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

细粒棘球蚴重组St-Eg 95-Eg.ferritin疫苗构建及生物学特性检测

构建表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的重组口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株并评价其生物学特性。将细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,将重组质粒分别电转入减毒鼠伤寒沙门菌X3770和X4550,获得重组疫苗菌株St-Eg95-Eg.ferritin,对重组菌的稳定性、生长状态及安全性进行分析。结果表明,经PCR和酶切鉴定成功构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,Western blot检测Eg95-Eg.ferritin蛋白在重组菌中获得表达;生物学特性研究结果表明,重组质粒可稳定存在,且不影响重组菌的生长状态,小鼠口服试验证实,重组菌安全无毒性。成功构建能稳定表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株,将为研究包虫病口服基因工程疫苗奠定基础。     

黄花烟草(Nicotiana rustica)、迪勃纳氏烟草(Nicotiana debneyi)与Nicotiana tabacum K326互交亲和性的荧光鉴定

利用荧光显微镜对烟草互交组合Nicotiana tabacum K326×Nicotiana rustica与Nicotiana tabacum K326×Nicotiana debneyi授粉后花粉管生长部位和形态进行观察比较。结果显示,在正交组合中,N.rustica、N.debneyi花粉管大量生长进入Nicotiana tabacum K326花柱离柱头3/4区间后停止生长,在停止生长部位弯曲、膨胀,形成大量不规则胼胝质颗粒;用蒙导法、切割花柱法、已开放花朵授粉及已开花朵重复涂抹授粉等方法均未能有效促进2个父本花粉管在K326花柱中生长,而蕾期授粉花粉管可以生长进入子房,但授粉后没有获得种子;在反交组合中,K326花粉管可以在N.rustica、N.debneyi花柱中大量生长并进入子房,N.debneyi授粉后获得种子,种子萌发率为(49.67±1.53)%。