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1.
为研究猪流行性腹泻病毒中COE基因的原核表达情况及免疫原性,从感染猪流行性腹泻病毒的猪体内采集肠内容物、肠段及肠系膜淋巴结,参照GenBank中所收录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株的COE基因序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增出COE基因,克隆到原核表达载体pET-32α上,并构建重组表达质粒pET-32α-COE,在大肠杆菌Rosetta中进行表达,并进行Western blot检测。结果显示,重组蛋白获得了高效的表达,并能与多抗血清发生特异的免疫印迹反应。COE基因是猪流行性腹泻病毒的中和抗原位点,具有良好的免疫学活性。  相似文献   

2.
【目的】克隆维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)低钙反应蛋白(AcrV)并进行原核表达,为进一步研究AcrV蛋白的结构功能及AcrV基因工程亚单位疫苗的制备奠定基础。【方法】克隆维氏气单胞菌TH0426菌株AcrV基因,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级结构及三级结构。将AcrV基因克隆到pET-30a(+)原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,进行EcoR Ⅴ和Xho Ⅰ双酶切鉴定和测序鉴定。用IPTG对 pET-30a(+)-AcrV进行诱导表达,对IPTG浓度(0.2,0.4,0.6和0.8 mmol/L)和诱导时间(2,3,4和5 h)进行优化。在最佳条件下诱导表达重组蛋白AcrV,经镍柱纯化且尿素梯度复性后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,进行SDS-PAGE及Western blot分析,对目的蛋白的免疫原性进行检测。【结果】成功获得了1 086 bp的AcrV全基因,编码361个氨基酸。AcrV蛋白是无跨膜结构且不编码信号肽的蛋白,有2个高度保守的结构功能域,属于全α型蛋白。成功构建了原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,其最佳诱导表达条件为IPTG 0.8 mmol/L诱导5 h。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,AcrV蛋白能被鼠抗阳性血清识别,表明其具有一定的反应原性。【结论】成功克隆了1 086 bp的AcrV基因,分析了其编码蛋白的生物信息;获得了免疫原性良好的重组AcrV蛋白。  相似文献   

3.
蓝舌病病毒(Bluetounge virus,BTV)非结构蛋白4(Non-structural protein 4,NS4)拮抗干扰素的产生,在BTV逃避宿主天然免疫的过程中发挥重要作用。利用PCR扩增得到 NS4 基因,与空载体pET-32a双酶切后连接,构建pET-32a- NS4原核表达载体;将pET-32a- NS4转化至E.coli BL21感受态细胞,以IPTG诱导表达;利用SDS-PAGE确定IPTG的最佳诱导浓度、时间与重组蛋白的表达形式;利用Western blot分析重组蛋白的表达情况。结果表明,成功构建pET-32a- NS4原核表达载体;IPTG最佳诱导浓度为 0.8 mmol/L,时间为6 h,蛋白主要以包涵体形式表达;Western blot在27 ku处可见目的条带,与预期相符。本研究成功构建pET-32a- NS4原核表达载体,实现NS4蛋白的大量、高效表达,为进一步探究NS4蛋白在BTV拮抗宿主天然免疫中的作用机制提供材料。  相似文献   

4.
【目的】克隆马泰勒虫新疆株棒状体颈部蛋白4基因(RON4)并原核表达RON4蛋白。【方法】参考美国马泰勒虫WA株基因组数据及其他顶复门原虫RON4基因信息,设计特异性引物,以马泰勒虫新疆株DNA为模板克隆RON4基因片段,构建pET-32a-RON4原核表达载体后进行原核表达与鉴定,并对RON4基因编码蛋白进行生物信息学分析。【结果】获得马泰勒虫新疆株RON4基因(NCBI登录号为:ON254212)。马泰勒虫新疆株与马泰勒虫WA株亲缘关系最近,RON4基因的核苷酸和氨基酸相似性分别为 99.4%和 99.0%;RON4基因在种间高度保守,其氨基酸序列与其他顶复门原虫具有高度相似的保守区域。成功构建了RON4蛋白原核表达载体,诱导表达获得分子质量为50 ku的重组包涵体蛋白;重组蛋白可与马泰勒虫阳性马血清特异性反应。生物信息学分析表明,马泰勒虫新疆株RON4蛋白的亲水性、柔韧性以及表面可及性较弱,B细胞表面抗原表位区域较少,形成表面抗原表位的结构基础条件不足。【结论】克隆获得了马泰勒虫新疆株RON4基因,并完成了原核表达及鉴定,该基因高度保守,在不同物种间可能具有相似的功能。  相似文献   

5.
为分析鸡印度刺猬因子(Indian hedgehog,IHH)基因生物信息学及IHH基因在不同组织中特异性表达规律,选取体重相近、健康强健的6只鸡,借助生物信息学手段,对IHH基因结构、启动子和CpG岛进行分析,并通过实时荧光定量PCR检测IHH基因在鸡心、肝、脾、肺、肾、软骨、下丘脑、胸肌、十二指肠和胸腺组织中的特异性表达规律,同时对IHH蛋白进行相似性比较,并利用生物信息学分析IHH蛋白的理化和结构特性。结果表明,1)鸡IHH基因开放阅读框长度为1 227 bp,可编码408个氨基酸,具有3个外显子、4个核心启动子区和1个CpG岛。2)成功扩增IHH基因,IHH基因在鸡各组织中均有不同水平的mRNA表达,在软骨组织中相对表达量最高,在心、脾和胸腺组织中的表达量相对较低。3)鸡IHH蛋白在禽类中保守性较高,IHH蛋白大小为44.829 36 ku,属于偏碱性蛋白,具有1个跨膜端和1个信号肽;IHH蛋白二级结构中无规则卷曲的比例最高(44.12%),只含有1个 HH-Signal功能域,内含大部分丝氨酸磷酸化位点,该蛋白还有14个苏氨酸磷酸化位点和5个酪氨酸磷酸化位点,鸡IHH蛋白存在1处N型糖基化位点和6处O型糖基化位点。综上,鸡IHH基因有3个外显子,有多个启动子区,在软骨组织中极显著高表达,鸡IHH蛋白是具有偏碱性、强热稳性和低亲水性的分泌型蛋白,IHH氨基酸序列在物种进化过程中比较保守,本研究为深入研究鸡IHH基因对软骨发育的调控作用提供依据。  相似文献   

6.
目的 探究宁夏地方品种静原鸡前期转录组测序筛选出的AK1基因编码蛋白的结构与功能,构建其真核表达载体。方法 根据GenBank上已公布的原鸡AK1基因序列,针对其CDS区设计特异性引物,通过克隆测序对AK1基因CDS区SNPs进行快速筛查,构建AK1基因的真核表达载体,并进行编码区生物信息学功能分析。结果 AK1基因编码区全长585 bp,编码194个氨基酸;AK1蛋白无跨膜结构域,存在2个CpG岛,18个磷酸化位点,10个抗原表位,为稳定的水溶性蛋白,空间结构以α–螺旋和无规则卷曲为主。亚细胞定位结果显示,AK1蛋白主要位于细胞质内;GO富集分析发现,AK1基因同样富集在细胞质中,与亚细胞定位结果一致。基因共表达分析发现,在与AK1互作的基因中,AK1AMPD1PKM2基因存在共表达,共表达系数分别为0.116和0.063。成功构建出AK1-pEGFP-N1载体。结论 该研究结果为后续AK1蛋白功能以及AK1作为肌苷酸相关基因的深入研究提供了科学依据。  相似文献   

7.
【目的】制备大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfAorfC的多克隆抗体,并用其检测酵母和肿瘤细胞中目的蛋白的表达。【方法】以WDSV基因组序列为模板,PCR扩增WDSV orfAorfC基因,分别构建其原核表达载体,转化Rosseta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白后,采用皮下多点注射结合耳静脉加强免疫的方法免疫新西兰白兔,制备抗orfA和抗orfC的多克隆抗体,用Western blot法检测抗体的特异性。用制备的多克隆抗体检测orfA和orfC融合蛋白在酵母和HeLa299、SPC-A-1肿瘤细胞中的表达。【结果】PCR扩增获得了WDSV orfAorfC基因。成功构建了orfAorfC基因的原核表达载体并进行了诱导表达,orfA和orfC重组融合蛋白以包涵体形式存在;采用皮下注射结合耳静脉加强免疫有效地提高了抗体效价,成功制备得到了兔抗orfA和兔抗orfC血清,抗体效价达1∶8 000~1∶10 000;通过Western blot法,利用上述抗血清分别检测到了原核表达的目的蛋白及酵母和肿瘤细胞中表达的目的蛋白。【结论】制备得到的抗orfA和抗orfC多克隆抗体具有很好的特异性,能够用于原核表达、酵母和肿瘤细胞中表达的目的蛋白的Western blot检测。  相似文献   

8.
【目的】制备具有免疫活性的奶山羊白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)与转移生长因子-β1(Transfer growth factor-β1,TGF-β1)融合蛋白。【方法】采集奶山羊外周血,分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMCs),将PBMCs用刀豆蛋白A(ConA)刺激后提取其总RNA,RT-PCR扩增IL-6与TGF-β1基因,构建其克隆载体及原核表达载体pET-32a TGF-β1和pET-32a-IL-6,然后进行PCR和测序鉴定。将原核表达载体pET-32a-TGF-β1和pET-32a-IL-6转化至大肠杆菌 BL21(DE3) 中,用 IPTG诱导表达,以镍柱纯化试剂盒纯化IL-6与TGF-β1重组蛋白,对表达产物和纯化后的蛋白进行SDS-PAGE。用纯化的IL-6、TGF-β1蛋白刺激PBMCs,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH基因为内参,采用qRT-PCR法检测PBMCs -IL-17 mRNA的表达量。【结果】RT-PCR扩增获得了627 bp的IL-6基因片段和1 137 bp的TGF-β1基因片段,成功构建了IL-6和TGF-β1基因的克隆载体及pET-32a-TGF-β1和pET-32a-IL-6原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中得到成功表达;获得了纯化的奶山羊IL-6与TGF-β1融合蛋白,该融合蛋白联合刺激能使PBMCs的IL-17 mRNA表达水平显著升高。【结论】获得了具有免疫活性的奶山羊IL-6与TGF-β1重组蛋白。  相似文献   

9.
海藻糖-6-磷酸合酶(Trehalose-6-phosphate synthase, TPS)在植物非生物胁迫响应中起着重要的调控作用。以辣椒品种‘强丰101’为材料,对 CaTPS8 基因进行克隆和表达分析。结果表明,该基因CDS的完整开放阅读框为2 553 bp,编码850个氨基酸。生物信息学分析发现,CaTPS8蛋白的分子质量为96 ku,理论等电点为5.65,不稳定系数为48.09,推测为不稳定蛋白。蛋白结构预测显示CaTPS8蛋白包含Glyco_transf_20和 GT20_TPS两个保守结构域,属于亲水性蛋白,没有跨膜结构和信号肽序列。二级、三级结构预测表明该蛋白的结构主要为α-螺旋和无规则卷曲。系统进化关系分析表明, CaTPS8蛋白与马铃薯和番茄的同源性最高,其相似度分别为87.78%和86.92%,与高粱的同源序列相似度最低,为64.76%。实时荧光定量PCR分析表明, CaTPS8 基因在辣椒花中表达量最高。同时, CaTPS8 基因的表达受到低温的诱导,在处理 3 h时相对表达量最高,约为对照的25倍。此外,IAA、ABA、SA、GA3和MeJA处理能够抑制 CaTPS8 基因的表达。研究结果为进一步阐明 CaTPS8 基因响应辣椒非生物胁迫的分子机理奠定基础。  相似文献   

10.
根据GenBank的羊Fas细胞凋亡因子序列设计1对特异性引物,将EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点引入到引物两端,同时加上保护性碱基。利用RT-PCR技术,从新疆卡拉库尔羊外周血淋巴细胞总RNA中扩增出特异性基因片段。将分离纯化后的PCR产物与pMD-18T载体进行连接,利用双酶切反应与菌液PCR对阳性重组克隆进行鉴定筛选,然后进行序列测定。使用原核表达载体pET28a来完成Fas的定向克隆,成功构建重组融合表达质粒pET-28a-Fas,然后将质粒转化至E.coli BL21感受态,设置不同IPTG浓度和诱导温度,选择最佳的表达条件,然后初步纯化重组融合蛋白。结果表明,在pET28a表达载体中,Fas基因的插入方向和读码框均正确;同时Fas基因也完成在E.coli BL21融合表达的目的,融合蛋白分子质量为39.7 ku。  相似文献   

11.
稳定性是一个评价群落结构与功能的指标,一直是生态学研究的热点。本文依据林分地上部分指标建立稳定体系,对苏州近郊4种人工林分,应用数学生态学方法,分析冬青针阔混交林、栎树针阔叶混交林、湿地松林和木荷林的林分稳定性。结果表明,多样性并不完全能够代表稳定性;4种林分群落稳定性主要因林分密度不同而异;稳定性依次为湿地松林>冬青湿地松林>栎树湿地松林>木荷林。其中湿地松林可能会发展成为针阔混交林;木荷林中在生长过程中会因竞争产生限制,可能演替形成栎树—木荷混交林;2种针阔混交林在未来演替也可能向落叶阔叶、常绿阔叶混交林发展;该地区木荷林密度过大,稳定性较弱,应采取适当的抚育措施,提高其林分稳定性。  相似文献   

12.
为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。  相似文献   

13.
为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明:1)在7H染色体的84.30—86.00 cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2)该基因长1 033 bp,其完整开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14 kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域(分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸)。3)同源比对与系统进化分析表明:青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具有2个高度保守的2个SANT结构域;与大麦的亲缘关系最近,其次是与乌拉尔图小麦,与水稻最远。4)亚细胞定位结果表明,该基因定位在细胞核内。5)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:与籽粒颜色形成的乳熟早期和乳熟晚期相比,软面团期的HvnANT1基因在‘涅如姆扎’中表达量极显著上调,而在‘昆仑10号’中各时期的表达量较低且差异不显著;且软面团期的‘涅如姆扎’籽粒HvnANT1基因的表达量极显著高于‘昆仑10号’(P<0.01)。花青素合成相关的结构基因HvnCHI、HvnANSHvnDFR与该基因表达量模式相似。综上,青稞HvnANT1蛋白结构中的SANT结构域在物种进化过程中比较保守;该基因定位在细胞核内,符合转录因子特性;HvnANT1基因表达模式与结构基因HvnCHI、HvnANSHvnDFR相似,在籽粒颜色形成的软面团期表达量极显著升高。  相似文献   

14.
采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)对干旱胁迫下脂质转移蛋白基因(TaLTP1)、膨胀素基因(TaEXPB23)、水通道蛋白基因(TaAQP7)和果聚糖6-果糖基转移酶基因(Ta6-SFT)在4种小麦叶片中的表达情况进行分析;通过测定相对水分质量分数和果聚糖质量分数来判断小麦生长发育状况。结果显示:干旱胁迫48h内,4种基因在不同抗旱性小麦叶片中的表达模式不同,干旱敏感型小麦中4种基因的相对表达量先上升后下降,恢复到正常水平;干旱耐受型小麦中4种基因的相对表达量先上升后下降,但仍维持较高表达水平;干旱耐受型小麦具有较高的相对水分质量分数和果聚糖累积量。以上结果表明,4种基因参与小麦干旱胁迫应答,4种基因的表达模式可以作为鉴定小麦抗旱的分子指标。本研究可为准确快速地鉴定小麦品种抗旱性提供重要分子依据。  相似文献   

15.
利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。  相似文献   

16.
采用组织分离法,以PDA培养基为分离培养基,从绣线菊的根、茎和叶中分离获得39株内生真菌。平板对峙结果表明, 21株活性菌株对6种植物病原菌(辣椒疫霉病原菌、番茄枯萎病原菌、苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、葡萄灰霉病原菌、小麦赤霉病原菌)有不同程度的抑制作用,其中菌株XXT10对苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、番茄枯萎病原菌、小麦赤霉病原菌的抑制率分别达到73.2%、72.5%、39.5%和42.7%。通过测得的ITS rDNA 序列与GenBank数据库中已知序列比对后该菌为链格孢属菌。生物学特性试验表明,该菌株在28~32℃时,选择PDA培养基,分别以乳糖和蛋白胨作为碳、氮源,酸碱度中性的条件下,菌落的生长状况最佳。  相似文献   

17.
必需脂肪酸亚油酸(18∶2)和亚麻酸(18∶3)在植物中的合成过程一直备受研究者的关注。本研究利用旱金莲中合成亚油酸的油酸脱饱和酶基因TmFAD2及甘蓝型油菜中合成亚麻酸的亚油酸脱饱和酶基因BnFAD3,在pRD400骨架载体的基础上,构建同时表达TmFAD2和BnFAD3的串联双价载体pSFF。通过农杆菌介导的花序浸蘸法完成pSFF对拟南芥哥伦比亚野生型的转化,观察发现转基因植株的第1对真叶有不同程度的畸形。按照畸形程度将其划分为4个等级,气相色谱分析4个等级叶片及其后代种子中脂肪酸的组成及含量,发现随着畸形程度的增高,叶片和种子中亚麻酸C18∶3含量都呈现降低的趋势。  相似文献   

18.
LBD(Lateral organ boundaries domain)是植物中特有的基因家族.前期研究发现灰霉菌处理小立碗藓导致配子体中的PpLBD20上调表达,但PpLBD20的功能尚不明确.因此提取小立碗藓DNA,PCR扩增PpLBD20基因的上下游片段,依次插入PTN182载体,利用同源重组原理构建敲除表达载体,酶切和测序验证插入序列的正确性.通过工作浓度为20%的PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选鉴定得到敲除PpLBD20后的突变体植株,观察到敲除后小立碗藓不形成茎叶体结构且配子体成丝状.结果为深入探究PpLBD20在小立碗藓的形态建成调控病原菌侵染的抗性作用奠定基础.  相似文献   

19.
为探究结球甘蓝类钙调蛋白(CMLs)响应不同胁迫时的功能,丰富CMLs参与钙信号网络调控,为CMLs参与植物逆境途径及其功能的研究提供依据。以结球甘蓝ZG为材料,克隆得到 CML48 CML50基因,序列分析表明 CML48开放阅读框(ORF)为672 bp,含4个内含子,编码223 aa,分子量为25.28 ku; CML50开放阅读框ORF为1 095 bp,编码364 aa,分子量为38.06 ku,含3个内含子;均为亲水蛋白,均含有2个EF-hand结构域;系统发育树表明 CML48 CML50均与甘蓝处于同一进化枝,与白菜、油菜的亲缘关系最近。qPCR表明 CML48 CML50在干旱(PEG6000)、盐胁迫(NaCl)、低温(4 ℃)、高温(37 ℃)、H2O2、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)等不同胁迫处理下,在叶和根中的表达均有上调,且 CML50的表达量均显著高于 CML48, CML48在茎尖中高度响应高温胁迫,而在根中不响应高温和H2O2胁迫。初步说明 CML48 CML50在根和叶中均可响应上述8种非生物胁迫。  相似文献   

20.
为明确新疆野生樱桃李PsoRPM2基因引起植株的早开花现象,本研究通过形态学、转基因以及酵母双杂等试验对PsoRPM2基因进行了分析。结果显示:新疆野生樱桃李极早花、早花、中花、晚花和极晚花的比率分别为11%、24%、44%、18%和3%。早花类型的花芽分化明显快于晚花类型,早花花芽中的PsoLFYPsoFT基因表达高于晚花,而PsoFLC基因则在晚花中表达较高。转PsoRPM2基因烟草表现为早花,并且NtLFY基因表达明显升高。在新疆野生樱桃李早花花芽中,PsoRPM2基因表达高于晚花,同一时期的PsoLFY基因表达也较高。酵母双杂试验显示,PsoRPM2与PsoLFY可以互作。综上,新疆野生樱桃李之所以早花是通过PsoRPM2与PsoLFY互作,提高花芽中PsoLFYPsoFT基因表达,从而加快花芽分化进程,导致植株提前开花。  相似文献   

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