犬SLAM基因真核表达载体的构建及在MDCK细胞中的稳定表达

为了构建稳定表达犬信号淋巴细胞激活因子(SLAM)的MDCK细胞系,该研究从犬外周血淋巴细胞中克隆了犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)细胞受体SLAM基因,将鉴定正确的SLAM基因插入到高效真核表达载体pcDNA3.1(+)中.采用脂质体转染的方式将重组质粒pcDNA3.1/SLAM转染到MDCK细胞中,采用G418加压筛选及有限稀释法克隆,获取稳定表达SLAM的MDCK细胞株.结果表明,成功构建了SLAM的真核表达载体pcDNA3.1/SLAM,并通过G418筛选获得了稳定表达SLAM的细胞系MDCK.     

重组CYP3A46细胞微粒体体外药物 代谢动力学分析

通过对巴马小型猪CYP3A46 重组细胞微粒体体外药物代谢动力学特征比较分析,为巴马小型猪应用 于临床前药理试验提供科学依据。分析重组CYP3A4、CYP3A46 细胞微粒体药物代谢动力学参数Vmax、Km(S50）、 Clint 及IC50 均表明：CYP3A46 的硝苯地平、睾酮的代谢活性及酮康唑的抑制活性均比较接近CYP3A4(P>0.05）, CYP3A46 是否是CYP3A4 的同源酶需要进一步研究确定。     

稳定表达鸡恒定链基因的P815细胞株的建立与鉴定

[目的]获得稳定表达鸡恒定链基因（Ii）的P815细胞株。[方法]利用PCR方法获取鸡Ii链基因,利用脂质体转染P815细胞,加入G418筛选阳性细胞克隆,最后利用RT-PCR进行鉴定。[结果]通过PCR获得鸡Ii基因,大小为672 bp,进一步定向插入真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-C1-Ii,经双酶切鉴定后转染P815细胞,通过多次克隆获得含鸡Ii链基因并能稳定表达的阳性细胞株,经RT-PCR再次鉴定,并命名为P815-Ii。[结论]获得了稳定表达鸡Ii的P815细胞株,为进一步研究Ii的结构与功能奠定了基础。     

广西巴马小型猪CTGF基因真核表达载体构建 及其相关生物信息学分析

[目的]构建广西巴马小型猪结缔组织生长因子(CTGF)基因真核表达载体并鉴定其活性,为深入研究CT-GF在癌症发生中的作用及其分子机制提供参考,也为构建CTGF转基因广西巴马小型猪及研发基于CTGF的癌症基因治疗策略提供理论依据.[方法]利用RT-PCR从广西巴马小型猪肝脏组织中克隆CTGF基因,并将CTGF基因亚克隆到pDsRed-N1载体上,然后通过脂质体转染小鼠Hep3B细胞,转染48 h后于荧光显微镜下观察细胞是否表达红色荧光蛋白,同时利用在线生物信息学软件对其理化性质进行分析.[结果]成功克隆获得广西巴马小型猪CTGF基因编码区(CDS)序列,序列全长1050 bp,共编码349个氨基酸,与NCBI上已公布普通猪参考序列的同源性为99.5%,有5处碱基突变,且均为同义突变.将广西巴马小型猪CTGF基因亚克隆到pDsRed-N1载体上成功构建了阅读框架正确的广西巴马小型猪CTGF基因真核表达载体,转染小鼠Hep3B细胞48 h后有红色荧光蛋白表达.广西巴马小型猪CTGF蛋白具有较强的亲水性,其二级结构中α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲各占13.18%、5.73%、17.48%和63.61%.[结论]广西巴马小型猪CTGF基因在进化过程中的保守性非常稳定,通过构建的真核表达载体能转染小鼠Hep3B细胞并成功表达,可用于生产转基因广西巴马小型猪及研发与CTGF基因有关的疾病模型.     

丙型肝炎病毒NS4B蛋白调控Hep3B细胞非折叠蛋白质反应研究

研究表达的丙型肝炎病毒(HCV)NS4B对Hep3B细胞非折叠蛋白质反应的影响。NS4B重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)NS4B通过脂质体转染Hep3B细胞,G418筛选和Western blot鉴定稳定转染细胞;RT-PCR检测稳定转染细胞内XBP1 mRNA剪接,Western blot鉴定ATF6蛋白切割,荧光素酶试验检测稳定转染细胞内GRP78和XBP1启动子活性。G418筛选和Western Blot鉴定证实获得稳定表达NS4B的Hep3B细胞;在该细胞内,XBP1 mRNA剪接、ATF6切割、XBP1和Grp78启动子激活均被检测到。NS4B在Hep3B的稳定表达诱导了非折叠蛋白质反应。     

牛myf6基因克隆及在成纤维细胞中的表达

克隆了牛的myf6基因并构建真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6,用脂质体技术转染鲁西黄牛成纤维细胞,通过G418筛选出稳定转染的细胞株,利用Western印记、Real-time PCR技术检测myf6对成纤维细胞的影响。结果表明,与对照组相比,稳定转染后的成纤维细胞myf6蛋白和mRNA的表达量提高(P0.01),肌肉肌酸激酶基因mRNA表达量升高(P0.05),肌球蛋白轻链基因的mRNA表达量也提高(P0.01)。细胞形态观察显示转染后的成纤维细胞未融合为肌管。由此可知,牛myf6基因可以在成纤维细胞中表达并且有促进成纤维细胞向肌肉细胞分化的功能。     

猪Cyclin A和CDK2蛋白对猪细小病毒增殖的调控作用

【目的】探究猪细胞周期素Cyclin A(pCyclinA)及其依赖性激酶2(pCDK2)对猪细小病毒(PPV)增殖的调控作用,为开展PPV复制机制研究提供依据。【方法】采用RT-PCR扩增pCyclinA和pCDK2基因,克隆至真核表达载体pEGFP-C1中构建重组载体,转染猪睾丸细胞(ST),经新霉素(G418)筛选获得pCyclinA或pCDK2过表达的ST细胞株。设计pCyclinA和pCDK2基因特异性干扰片段(shRNA)CycA894和CDK1163,构建干扰表达载体,转染ST细胞,经G418筛选得到pCyclinA和pCDK2低表达的ST细胞株,实时荧光定量PCR检测其干扰效率。流式细胞术分析pCyclinA和pCDK2过表达和低表达对ST细胞周期的影响。将猪细小病毒NY毒株(PPV-NY)接种过表达和低表达的ST细胞,用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒滴度。【结果】pCyclinA和pCDK2基因的开放阅读框(ORF)分别为1 299和897 bp,构建了重组载体pEGFP-pCyclinA和pEGFP-pCDK2。荧光显微镜观察结果显示,融合蛋白EGFP-pCycA和EGFP-pCDK2分别在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中稳定表达。构建了干扰载体pGPU6-GFP/CycA894、pGPU6-GFP/CDK1163和pGPU6-GFP/-shNC(阴性对照);低表达细胞株ST-pGPU6-GFP/CycA894和ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的pCyclinA、pCDK2基因的mRNA表达量均极显著降低(P0.01)。pCyclinA或CDK2过表达分别极显著或显著降低ST细胞S期的比例(P0.01或P0.05)。pCyclinA低表达能极显著降低ST细胞G0/G1期的比例(P0.01)、极显著增加S期和G2/M期的细胞比例(P0.01);pCDK2低表达能显著增加ST细胞G0/G1期的比例(P0.05),但却显著降低S期的细胞比例(P0.05)。PPV在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中的滴度均极显著低于对照细胞(P0.01)。低表达细胞ST-pGPU6-GFP/CycA894中PPV滴度极显著增加(P0.01),而ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的PPV滴度无显著变化(P0.05)。【结论】pCyclinA或pCDK2过表达均能抑制PPV增殖;pCyclinA低表达可促进PPV增殖,pCDK2低表达对PPV增殖无显著影响;pCyclinA低表达极显著降低G0/G1期细胞比例、但极显著增加S期和G2/M期细胞比例。     

猪TOLL样受体2基因在CHO-K1细胞中的表达

将含猪TLR2(猪Toll样受体2,pTLR2)基因的真核表达载体PcDNA3.1/CT-GFP-pTLR2,采用脂质体法转染到CHO-K1细胞,用G418持续筛选获得了阳性细胞克隆.阳性细胞克隆系经PCR和RT-PCR检测表明:pTLR2基因得到稳定整合并能成功地转录.荧光显微镜观察,转染细胞可见绿色荧光,表明获得了表达pTLR2的克隆细胞系.     

稳定表达犬信号淋巴细胞激活因子基因细胞株的建立与鉴定

[目的]构建稳定表达犬瘟热病毒细胞受体———犬信号淋巴细胞激活因子(SLAM)的非洲绿猴肾细胞株(Vero)。[方法]采用RT-PCR方法从犬外周血淋巴细胞中扩增出SLAM基因,将其克隆到哺乳动物真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA3.1/SLAM。采用脂质体将pcDNA3.1/SLAM转染到Vero细胞中,利用G418加压筛选和纯化培养获得稳定表达SLAM的重组Vero细胞株。应用RT-PCR和间接免疫荧光试验检测SLAM的表达。[结果]重组蛋白SLAM在Vero细胞中获得表达,并且在不同代次的阳性细胞株中均能稳定表达目的蛋白。[结论]该研究建立了稳定表达犬SLAM的细胞株Vero/SLAM,为犬瘟热病毒的分离和生物学特性研究提供了平台。     

Nrf2过表达与敲减Hep1-6稳转细胞株的建立

核因子NF-E2相关因子2(Nrf2)是治疗非酒精性脂肪肝(NAFLD)的一个重要靶点分子。为了从体外研究小分子通过靶向Nrf2改善NAFLD的分子机制,首先PCR克隆鼠源Nrf2基因至p Lenti6/V5-D-TOPO空载体得到重组载体p Lenti6/V5-Nrf2,通过测序、酶切鉴定正确后,扩繁质粒,制备慢病毒并将其感染Hep1-6肝癌细胞,用稻瘟醇胚素筛选、鉴定获得稳定表达Nrf2的细胞株。同时,用Nrf2干扰质粒构建慢病毒感染Hep1-6肝癌细胞,通过嘌呤霉素筛选、鉴定Nrf2敲减的细胞株。Q-PCR检测结果显示,过表达稳转株(p Lenti6/V5-Nrf2)中Nrf2基因的表达量为对照组(p Lenti6/V5-Lac Z)的4倍,敲减稳转株中Nrf2基因的表达量大幅度降低。Western blotting显示过表达稳转株的Nrf2表达量明显高于对照组,敲减稳转株的Nrf2表达量明显低于对照稳转株,此结果与Q-PCR结果一致。所克隆的Nrf2基因和敲减基因在Hep1-6小鼠肝癌细胞中得到了正确转录和翻译,稳转细胞株构建成功。     

山羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建及表达

从重组克隆载体pMD18-P32中扩增出山羊痘病毒P32基因,与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-P32.重组质粒pPIC9K-P32用Sal I线性化后,与毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115混合后电转化,使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组.采用G418抗性梯度筛选法得到高拷贝重组菌株,甲醇诱导目的基因表达.SDS-PAGE和Western-blotting分析结果表明,用酵母成功表达出了31kD的重组蛋白,该蛋白具有生物学活性,能被山羊痘阳性血清识别.     

表达含前S的乙肝病毒表面抗原重组CHO细胞株的建立和特性检测

为建立表达含前S基因乙肝病毒表面抗原的细胞株,将笔者所在实验室构建的表达含前S基因乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的真核表达质粒共转染CHO/dhfr 细胞,通过筛选,获得可表达含前S基因乙肝病毒表面抗原的重组CHO细胞,然后进行亚克隆,用氨甲喋呤(MTX)加压选择,以 ELISA 法检测目的蛋白表达量,筛选获得稳定表达目的蛋白的细胞株,并对其进行特性鉴定.最终获得了ClO和A10两株稳定高表达含前S基因乙肝病毒表面抗原的细胞株.     

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶-1基因敲低人肺癌细胞A549构建及其对线粒体功能影响

目的 建立脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶-1(APE1)基因敲低人肺癌细胞A549,并初步观察线粒体功能变化.方法 APE1基因shRNA序列与pSIREN-RetroQ慢病毒载体经酶切连接重组体(pSIREN-RetroQ-shAPE1),再与病毒包装质粒共转染293T细胞;收集病毒液并感染A549细胞,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株A549shAPE1.免疫印迹法检测稳定细胞株中APE1干扰效率.用双氧水处理A549 shCotrol和A549 shAPE1细胞24 h,分析细胞内ATP及活性氧(ROS)变化.结果 经PCR和测序鉴定成功构建重组慢病毒载体pSIREN-RetroQ-sh APE1,免疫印迹法证实A549 shControl和A549 shAPE1稳定细胞株构建成功;双氧水处理后,A549shAPE1细胞中ATP活性明显低于A549shControl细胞(P＜0.05),而ROS明显增加(P＜0.01).结论 APE1干扰可影响肺癌细胞中线粒体功能.     

人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建及转染研究

构建了携带人乳铁蛋白(LTF)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的乳腺特异性表达载体(pEBL),用脂质体法转染泌乳期莎能奶山羊乳腺上皮细胞,转染后于荧光显微镜下观察GFP表达情况。用G 418对转染细胞进行筛选,获得抗性细胞克隆,并对转染细胞进行PCR检测。结果显示,pEBL构建成功,转染6 h后可观察到细胞有GFP表达,PCR检测阳性克隆细胞转有LTF基因。表明pEBL载体已转染山羊乳腺上皮细胞,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了基础。     

G418处理核供体细胞对猪克隆胚胎体外发育效率的影响

【目的】探索G418处理供体细胞对其核移植胚胎发育效率的影响。【方法】利用G418单独处理猪成体成纤维细胞6 d后,收集细胞,利用荧光定量PCR的方法检测处理前后细胞中抗氧化应激、细胞凋亡相关基因的表达水平,运用亚硫酸盐结合测序法分别检测基因组重复序列LINE-1、微卫星的DNA甲基化状态,以及其核移植胚胎体外发育的能力。【结果】经不同质量浓度G418处理的供体细胞的抗氧化应激酶相关基因及细胞凋亡基因表达发生显著变化(P0.05),但其DNA甲基化水平没有发生改变(P0.05);经G418处理的供体细胞的核移植胚胎的体外发育效率显著低于对照组(P0.05)。【结论】G418处理供体细胞可能对其克隆胚胎体外发育效率有抑制作用。     

银杏内生真菌及发酵液粗提物抗肿瘤活性研究

为了筛选有抗肿瘤活性的银杏内生真菌及次生代谢产物,采用MTT法,用105株银杏内生真菌发酵液的乙酸乙酯粗提物分别对A549肺癌细胞与Hep G2肝癌细胞进行抗肿瘤活性的检测。结果显示:有12株内生真菌对A549细胞表现出一定的抑制,有11株内生真菌对Hep G2细胞表现出一定的抑制,经过梯度浓度筛选,其中菌株G-04-05对A549和Hep G2细胞都显现出了较高抑制作用,对其活性成分值得进一步的探索和研究。     

基因打靶载体选择标记盒的构建及表达

为构建山羊乳腺基因打靶载体的选择标记盒,将loxP位点分别引入正、反向引物,以含新霉素磷酸转移酶(neo)基因的质粒pTarget为模板,用高保真聚合酶链反应(PCR)扩增得loxP neo loxP选择标记盒。将PCR产物克隆到pGEM T载体后进行的序列分析结果显示,引入的loxP位点及扩增后的neo基因序列均是正确的。将此选择标记盒克隆到不含neo基因的真核表达载体ΔpTarget后转染COS 1细胞,经过G418筛选获得药物抗性细胞克隆。再将此选择标记盒克隆到山羊β 乳球蛋白基因打靶载体并转染山羊成纤维细胞,经过G418选择后也获得抗性细胞克隆。结果表明:克隆的loxP neo loxP选择标记盒可用于基因打靶载体的构建。     

Pin1真核表达载体的构建及鼻咽癌稳定表达细胞的鉴定

目的 构建Pin1真核表达载体并筛选鼻咽癌稳定表达细胞株.方法 提取HEK293细胞RNA行逆转录,扩增Pin1基因编码区,将其克隆到真核表达载体pcDNA6B中,菌液PCR鉴定并测序;将成功克隆的质粒转染至CNE1细胞,杀稻瘟素筛选和Western Blot鉴定稳定表达Pinl细胞.结果 成功扩增Pin1编码区,并克隆至真核表达载体pcDNA6B中;Pin1过表达载体转染至CNE1细胞并筛选稳定表达细胞后,Western Blotting检测结果显示Pinl表达水平明显增加.结论 成功构建Pin1过表达载体并筛选出鼻咽癌稳定表达细胞,可用于后续研究.     

鲤鱼春季病毒血症病毒磷蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆鲤鱼春季病毒血症病毒（SVCV）的磷蛋白（P蛋白）基因,并对其进行原核表达,为进一步制备SVCV-P蛋白单克隆抗体及建立新的SVCV诊断方法奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增SVCV P蛋白基因,将其克隆入pET-28a(＋)载体中,获得原核重组表达质粒pET28-P,进行原核表达。将该重组原核表达质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,用0.4 mmol/L IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析试剂盒对表达产物进行纯化,分别用SDS-PAGE和Western Blotting方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了SVCV-P蛋白基因,该基因长度为933 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET28-P,其诱导表达产物分子质量约为37 ku;表达的重组P蛋白可被SVCV阳性血清所识别。【结论】成功克隆了SVCV P蛋白基因,获得了分子质量约为37 ku的重组P蛋白。     

逆转录病毒载体RNAi技术抑制猪瘟病毒在猪胚胎成纤维细胞的增殖

利用针对猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CsFV)石门株Npro基因mRNA的shRNA逆转录病毒表达载体,转导猪胚胎成纤维细胞,在G418的筛选压力下,获得7个稳定整合shRNA表达构件的猪胚胎成纤维细胞株.以100TCID50的CSFV分别感染96孔板内的上述细胞克隆,72h后以对感染细胞克隆进行间接免疫荧光分析及子代病毒滴度检测,结果显示,在所获得的7个抗性细胞株中,有3株细胞上猪瘟病毒的增殖显著降低,表明所构建的针对猪瘟病毒Npro基因mRNA的shRNA逆转录病毒整合细胞基因组后转录产生的siRNA可以有效抑制CSFV的复制.