过表达及干扰人APE1重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建含过表达及干扰人APE1的重组腺病毒.方法 应用PCR技术扩增人APE1基因序列,设计并合成shRNA序列,分别插入pDC315-EGFP和pDC316-EGFP-U6表达载体,经基因测序鉴定.用重组APE1过表达和shRNA表达穿梭载体与辅助包装质粒pBHGdeltaE11ox3Cre共转染人胚肾细胞HEK293A,进行病毒包装、出毒和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度.用重组腺病毒感染人AC16心肌细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度,Western blot检测APE1蛋白表达.结果 基因测序显示APE1过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符,转染HEK293A细胞包装成功.APE1过表达和shRNA腺病毒明显影响人AC16心肌细胞中APE1蛋白表达水平.结论 成功构建了人APE1过表达及特异性shRNA腺病毒表达载体.     

无机盐对纤维素降解真菌产内切β-1，4葡聚糖酶的影响

系统研究了不同种类无机盐对纤维素降解真菌产内切β-D-1,4-葡聚糖酶的影响,以正交设计的16个组合,包括4因素(四种无机盐)2水平(两种浓度)及其交互作用.选择酶活为指标,通过直观分析和方差分析,评价了各成分影响产酶的显著程度.结果表明,在试验考察范围内,K2HPO4·3H2O对产酶有极显著正影响,而FeSO4·7H2O则相反;得到的优化组合为每升液体培养基中含0.1 g CaCl2、0.1 g FeSO4·7H2O、0.5 g K2HPO4·3H2O和0.5 g MgSO4·7H2O,比未加无机盐培养基酶活提高111.916%;交互作用分析显示高浓度CaCl2、低浓度FeSO4·7H2O、高浓度K2HPO4·3H2O和高浓度MgSO4·7H2O可望实现葡聚糖酶生产的最大化.     

砂梨2个内切-β-1,4-葡聚糖酶基因cDNA的克隆及其在果实贮藏过程中的表达分析

为从分子水平上揭示EG基因在早熟砂梨软化过程中的作用机制,该研究以早熟砂梨品种翠冠果肉cDNA为模板,根据NCBI上登录的其他植物内切-β-1,4-葡聚糖酶(Endo-1,4-β-glucanas,EGases)基因编码区设计引物,利用RT-PCR技术,克隆内切-β-1,4-葡聚糖酶基因家族中的2个成员PpEG1和PpEG2的编码区序列,并在此基础上,利用半定量RT-PCR技术,探讨两基因在夏季货架期1-MCP处理条件下翠冠果肉软化过程中的表达情况。结果表明:PpEG1编码区包含1 869个核苷酸,编码1个由622位氨基酸组成的多肽,PpEG2编码区包含1 863个核苷酸,编码1个由620位氨基酸组成的多肽;PpEG1和PpEG2都含有糖基水解酶家族-9(Glycosyl-hydrolases-family-9)活性位点,但PpEG2比PpEG1的C端多1个碳水化合物结合组件(Carbohydrate-binding module,CBM);PpEG1与PpEG2分别位于分子进化树的2个不同发育分枝上;在室温货架期间,翠冠果肉中PpEG1的表达量先上升,贮藏4 d时其表达量最高,后缓慢下降,而PpEG2的表达量开始缓慢上升,在贮藏12 d时出现mRNA的积累高峰;1-MCP对PpEG1和PpEG2的表达不起延缓或促进作用。PpEG1与PpEG2在翠冠果实软化过程中的不同表达规律显示,PpEG1与PpEG2作用于不同的β-1,4-葡聚糖多聚分子底物,且PpEG1和PpEG2的表达均不受乙烯调控。     

口虾蛄乙酸乙酯提取物体对人肺癌A549细胞的抑制作用

目的观察口虾蛄乙酸乙酯提取物（EOS）对人肺癌A549细胞的抑制作用。方法观察不同浓度EOS对肺癌A549细胞生长曲线和集落形成能力的影响,荧光双染法检测细胞凋亡情况。结果 EOS明显抑制肺癌A549细胞的生长和集落形成,呈剂量-时间依赖性;EOS作用48 h后肺癌A549细胞生长延缓并萎缩,胞核固缩;荧光双染实验可见细胞凋亡增多。结论 EOS可明显抑制人肺癌A549细胞的生长和增殖,并具有诱导凋亡作用。     

中和血小板源性生长因子对A549人肺癌细胞生长及迁移的影响

目的 探讨中和血小板源性生长因子(platelet-derived growth factors,PDGFs)对A549人肺癌细胞生长和迁移的影响.方法 PDGF中和性抗体作用A549细胞后,MTT法及乳酸脱氢酶释放试验检测细胞增殖;丹单酰磺尸胺及吖啶橙染色检测细胞自噬;DAPI染色及caspase 3活性试验检测细胞凋亡;划痕试验及Transwell试验分析细胞迁移;免疫印迹及酶联免疫吸附试验检测整合素αv和基质金属蛋白酶9的表达.结果 PDGFs抗体明显抑制A549细胞体外增殖,诱导细胞发生自噬和凋亡,但同时增强肿瘤细胞迁移能力及整合素αv和MMP9的表达水平,整合素抑制剂西仑吉肽可部分逆转该现象.结论 中和PDGFs可抑制A549肿瘤细胞体外生长但促进其迁移.     

谷胱甘肽与顺铂联用对肺癌A549细胞增殖的影响

目的探讨谷胱甘肽与顺铂联用对肺癌A549细胞增殖的影响。方法应用MTT法及细胞计数评价细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡及活性氧(ROS)水平,Western blot检测P53表达。结果 0.3、0.9g/L谷胱甘肽与3mg/L顺铂联用72h,1、3、9g/L谷胱甘肽与9mg/L顺铂联用30h,均可显著降低顺铂对A549细胞增殖的抑制作用(P<0.01)。9g/L谷胱甘肽与9mg/L顺铂联用,可减少A549细胞ROS产生和早期凋亡(P<0.01)。谷胱甘肽、顺铂单独或联用对P53蛋白表达无影响。结论谷胱甘肽与顺铂联用对A549增殖的影响取决于谷胱甘肽剂量。     

奥曲肽对脂多糖诱导人肺腺癌上皮细胞A549炎症反应及其信号通路的影响

目的 检测奥曲肽(OQT)对人肺腺癌上皮细胞A549受脂多糖(LPS)诱导后的抗炎保护及其信号通路发生的变化.方法 体外培养人肺腺癌上皮细胞A549,根据给予不同药物处理,将实验分为空白对照组(不加任何药物),LPS组(加上脂多糖200 μg/L)、OQT组(加上奥曲肽1 500 μg/L),LPS+OQT组(加上脂多糖200 μg/L与奥曲肽1 500μg/L),电子显微镜观察细胞的形态,RT-PCR方法和western杂交检测IL-1β、IL-6、PI3K、ERK、p-ERK等细胞炎症反应及相关信号通路,并分析奥曲肽对A549细胞炎症反应相关通路的影响及分子机制.结果 IL-6表达量中,LPS组高于对照组(P＜0.05),OQT组低于LPS组(P＜0.05),LPS+OQT组低于对照组、LPS组(P＜0.05);IL-1β表达量中,LPS组、OQT组与LPS+OQT组均高于对照组(均P＜0.05),且以LPS组增高最为显著(P＜0.01),LPS+OQT组均低于单独用药的LPS组、OQT组(P＜0.05);PI3K表达量中,LPS组高于对照组(P＜0.05),OQT组、LPS+OQT组均低于对照组、LPS组(均P＜0.05);在p-ERK表达量中,LPS组与OQT组均高于对照组(均P＜0.05),而LPS+OQT组较LPS组、OQT组减少(均P＜0.05).结论 LPS能促进A549细胞炎症因子IL-1β和IL-6的显著升高;OQT对LPS诱导的A549细胞炎症反应均具有强烈的抑制作用,能逆转LPS对细胞炎症损伤的影响;奥曲肽可能通过磷酸化ERK的方式介导PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路实现对细胞抗炎保护的调控作用.     

4-氨基吡啶抑制耐顺铂肺癌细胞系A549/DDP侵袭转移

目的 探讨4-氨基吡啶(4-AP)对耐顺铂肺癌细胞系A549/DDP侵袭转移的影响及分子机制.方法 将不同浓度4-AP处理A549/DDP细胞48 h,Transwell和Boyden法观察肺癌细胞迁移侵袭能力,Western blot检测细胞侵袭转移相关的调控上皮-间质转化(EMT)蛋白.结果 5 mmol/L、7 mmol/L 4-AP组细胞迁移、侵袭数明显少于对照组(P＜0.01或0.05),其中7 rnmol/L组更显著.与对照组比较,4-AP组细胞上皮型钙粘附蛋白(E-cadherin)表达上调,神经型钙粘附蛋白(N-cadherin)和Snail表达下调.结论 4-AP可能通过调控EMT蛋白的表达抑制耐顺铂肺癌细胞A549/DDP侵袭转移.     

亚砷酸对人胰腺癌PANC-1细胞增殖及RASSF1A基因甲基化的影响

目的 探讨亚砷酸对人胰腺癌PANC-1细胞增殖及RAS相关结构域家族基因1A(RASSF1A)甲基化的影响.方法 PANC-1细胞用不同浓度亚砷酸处理,采用MTT法检测细胞增殖,甲基化特异性PCR(MSP)法检测RASSF1A基因甲基化情况.结果 随着亚砷酸浓度增加(1.2～4.8μmol/L)和作用时间延长,PANC-1细胞抑制率逐渐增加(P<0.05).PANC1细胞中RASSF1A基因表现为高甲基化状态,但其甲基化随亚砷酸浓度增加而逐渐减弱.结论 亚砷酸对PANC-1细胞增殖的抑制作用具有时间和剂量依赖性,并通过RASSF1A基因的去甲基化起作用.     

亚砷酸对人胰腺癌PANC-1细胞增殖及RASSFIA基因甲基化的影响

目的探讨亚砷酸对人胰腺癌PANC-1细胞增殖及RAS相关结构域家族基因1A（RASSHA）甲基化的影响。方法PANC-1细胞用不同浓度亚砷酸处理,采用MTT法检测细胞增殖,甲基化特异性PCR（MSV）法检测RASSFlA基因甲基化情况。结果随着亚砷酸浓度增加（1．2～4．8μmol／L）和作用时间延长,PANC-1细胞抑制率逐渐增加（P〈0．05）。PANC－1细胞中RASSFlA基因表现为高甲基化状态,但其甲基化随亚砷酸浓度增加而逐渐减弱。结论亚砷酸对PANC－1细胞增殖的抑制作用具有时间和剂量依赖性,并通过RASSFlA基因的去甲基化起作用。     

不同菱角壳提取物抑制肺癌A549细胞生长的研究

目的研究不同菱壳水和乙醇提取物的抗癌活性。方法采用Folin比色法测定不同品种菱壳提取物中多酚的含量,通过MTT法测定二角菱壳、四角菱壳的水提取物、醇提取物对肺癌A549细胞生长抑制作用。结果四角菱壳多酚含量高于二角菱壳,醇提物多酚含量高于水提物;二角菱壳醇提取物对肺癌A549细胞的抑制率高于水提物,差异具有统计学意义(P<0.01);四角菱壳水提物对抑制率高于二角菱壳水提物肺癌A549细胞的生长,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论菱角壳提取物对肺癌A549细胞生长具有较强的抑制作用,且菱角壳的醇提取物优于水提取物,四菱角壳优于二角菱壳。     

鸭ChREBP基因表达载体构建及其对原代肝细胞和PC3细胞脂质性状的影响

[目的]探究鸭原代肝细胞脂质含量与碳水化合物反应元件结合蛋白基因(ChREBP)表达的关联性,为深入研究ChREBP基因对畜禽脂质代谢的遗传调控机制提供参考依据.[方法]采用Ⅳ型胶原酶消化法分离孵化21 d的鸭胚原代肝细胞,以DMEM高糖培养基进行培养.利用RT-PCR扩增鸭ChREBP基因编码区(CDS)序列,构建携带His标签的真核表达载体pEGFP-N3-ChREBP-His,通过脂质体法分别转染鸭胚原代肝细胞和人前列腺癌细胞(PC3);采用His标签检测试剂盒检测ChREBP基因的表达量,以脂质指标测定试剂盒测定甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的含量,并分析鸭胚原代肝细胞和PC3细胞中ChREBP基因表达与脂质指标含量的相关性.[结果]以构建的真核表达载体pEGFP-N3-ChREBP-His转染鸭原代肝细胞和PC3细胞均能发出绿色荧光,表明携带His标签的ChREBP基因能在鸭原代肝细胞和PC3细胞中表达.ChREBP基因表达量与鸭原代肝细胞和PC3细胞中的TG、TC和HDL含量均呈极显著正相关(P<0.01,下同),与LDL含量呈极显著负相关.[结论]以构建的真核表达载体pEGFP-N3-ChREBP-His转染鸭原代肝细胞和PC3细胞后均能发出绿色荧光,说明ChREBP基因表达对鸭原代肝细胞和PC3细胞中的脂质代谢作用机理相似,可促进细胞脂质累积.