5-Aza-CdR 联合TSA对牛核移植胚胎体外发育及表观遗传状态的影响

【目的】探讨5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2-′Deoxycytidine,5-Aza-CdR)联合曲古抑菌素A(Trichosta-tin A,TSA)对牛核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响。【方法】以体外受精胚胎作为对照组,将部分体细胞、核移植胚胎以及体细胞联合核移植胚胎用5-Aza-CdR+TSA(5-Aza-CdR:20 nmol/L,72 h;TSA:50 nmol/L,12 h)进行处理,统计核移植胚胎体外发育率,并对2-细胞、8-细胞和囊胚阶段胚胎进行DNA甲基化和组蛋白乙酰化检测,研究5-Aza-CdR+TSA处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响。【结果】与对照组相比,5-Aza-CdR+TSA单独处理供体细胞和核移植胚胎均可以显著提高克隆胚胎的囊胚发育率和囊胚细胞数(P<0.05);供体细胞和核移植胚胎均用5-Aza-CdR+TSA处理后,核移植胚胎体外发育能力进一步提高,囊胚发育率显著高于单独处理供体细胞或核移植胚胎组(P<0.05)。免疫荧光检测发现,体细胞和核移植胚胎均用5-Aza-CdR+TSA处理,不但显著降低了2-细胞和8-细胞阶段DNA甲基化水平,而且也显著增加了组蛋白乙酰化水平(P<0.05),使核移植胚胎附植前各发育阶段的表观遗传状态更接近于体外受精胚胎。【结论】5-Aza-CdR联合TSA处理供体细胞和核移植胚胎可以更明显地提高克隆胚胎的体外发育能力,改变核移植胚胎的DNA甲基化和组蛋白乙酰化水平,使它们的表观遗传状态及体外发育率更接近于体外受精胚胎。     

5-aza—dC联合TSA对不同供体细胞来源牛核移植胚胎体外发育的影响

为研究5-aza—dC和TSA提高核移植胚胎体外发育能力的作用是否有供体细胞特异性,实验选择皮肤成纤维细胞、胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞作为核供体细胞进行核移植,联合使用20nM（72h）5-aza—dc和50nM（12h）TSA处理供体细胞和重构胚,比较5-ttZa—dC＋TSA对不同供体细胞来源核移植胚胎体外发育的影响。实验结果表明,经5-azaLdC＋TSA处理后,极显著提高了3种供体细胞来源核移植胚胎的体外囊胚发育率（P〈0．01）。虽然胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞得到的发育率稍高于皮肤成纤维细胞组,但各对照组之间以及各处理组之间的体外发育率没有明显差异,5-aza—dC和TSA对核移植胚胎体外发育的影响没有供体细胞特异性。     

Roscovitine同期化供核细胞对猴—猪异种核移植胚胎发育的影响

[目的]探讨Roscovitine同期化供核细胞对食蟹猴—猪异种体细胞核移植胚胎体外发育的影响,为提高灵长类的核移植效率奠定基础.[方法]活体采集4岁雄性食蟹猴的耳组织,经组织块培养获得纯化的食蟹猴耳成纤维细胞,细胞经固定、染色后用流式细胞仪分析细胞周期分布.以不同同期化方法处理的食蟹猴耳纤维细胞为供体细胞,以体外成熟、去核的猪卵母细胞为受体细胞,利用电融合法构建食蟹猴—猪异种核移植胚胎,观察异种核移植重构胚胎的体外发育情况.[结果]以15 μmol/L Roscovitine处理食蟹猴耳成纤维细胞24、48、72 h获得的G0/G1期细胞比率分别为76.51％、89.69％和90.49％,其中处理48和72h的G0/G1期细胞比率显著高于对照组（P＜0.05）.血清饥饿、接触抑制72 h同期化获得的G0/G1期细胞比率分别为91.12％和90.46％.Roscovitine同期化处理食蟹猴耳成纤维细胞48 h可有效提高食蟹猴—猪异种核移植重构胚胎的囊胚形成率（15.05％）,显著高于血清饥饿同期化处理和接触抑制同期化处理的效果（P＜0.05）.[结论]Roscovitine可有效同期化食蟹猴耳成纤维细胞在G0/G1期,最终提高食蟹猴—猪异种核移植重构胚胎的囊胚形成率.     

转K2.9基因绒山羊体细胞核移植技术体系的优化研究

【目的】利用体细胞核移植技术制备转毛角蛋白Ⅱ型中间丝K2.9基因的高绒质绒山羊胚胎,为绒山羊优良品种的培育提供一种全新的技术材料。【方法】以含有Neor 基因标记的K2.9 毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得转K2.9基因细胞,将获得的转基因阳性细胞与体外成熟的绒山羊卵母细胞进行核移植,并对生产的重构胚进行了体外培养。本文分别进行了激活方法、供体细胞和卵母细胞来源的筛选,且对获得的囊胚进行了PCR鉴定。【结果】（1）Iono+6-D对成年羊卵母细胞的孤雌激活效果好于A23187+6-D,显著提高了胚胎的卵裂率。（2）羔羊孤雌胚的卵裂率显著低于成年羊,但囊胚率差异不显著。（3）来自2只绒山羊胎儿的转基因成纤维细胞对核移植胚的发育没有显著影响,但2号羊的转基因细胞显著提高了融合率。（4）以羔羊卵进行核移植,显著降低了核移植胚的发育率。（5）对获得的囊胚进行PCR鉴定,成功扩增到目的基因。【结论】将K2.9 毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染的绒山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞,核移植到成年羊卵母细胞中,以Iono+6-D进行激活,首次成功、高效地获得携带K2.9基因的绒山羊囊胚。     

线粒体损伤对山羊-绵羊异种核移植胚早期发育的影响

【目的】研究线粒体损伤对核移植胚早期发育的影响。【方法】用经光敏化染料罗丹明-123损伤的山羊胎儿成纤维细胞和绵羊卵母细胞,构建山羊-绵羊异种体细胞核移植胚,于38.5℃、相对湿度100%、体积分数5%CO2条件下培养,统计其2-细胞期、8-细胞期和囊胚期的发育率。【结果】山羊核供体线粒体损伤并不影响囊胚期前核移植胚的发育率(P0.05);绵羊卵母细胞线粒体损伤,使核移植胚2-细胞期的发育率下降(P0.05),但不影响8-细胞期和囊胚期的发育率(P0.05);核供体和卵母细胞线粒体都损伤的核移植胚发育率的变化规律与卵胞质受体线粒体损伤的核移植胚一致。【结论】在异种核移植胚的早期发育中,核供体线粒体损伤不影响核移植胚的发育,但卵母细胞受体线粒体损伤明显影响核移植胚的发育率。     

山羊胎儿成纤维细胞转染人t-PA指形区缺失基因及其核移植研究

采用阳离子脂质体法将人t-PA指形区缺失基因乳腺特异性表达载体(pEBT)导入山羊胎儿成纤维细胞,以山羊胎儿成纤维细胞和转染的山羊胎儿成纤维细胞作供体,构建核移植胚,对其体外发育情况进行了研究,比较了2种供体细胞(山羊胎儿成纤维细胞和转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞)及转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞饥饿处理与否对核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,早期核移植胚有荧光蛋白(GFP)的表达;以山羊胎儿成纤维细胞作供体细胞时,核移植胚的桑葚胚率(50.3%)及囊胚率(16.0%)均高于以转人t-PA指形区缺失基因胎儿成纤维细胞为供体时的桑葚胚率(48.4%)和囊胚率(10.9%),但差异不显著(P>0.05);转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿处理后,其核移植胚胎的卵裂率(73.6%)与不饥饿时的卵裂率(73.9%)差异不显著;饥饿处理后核移植胚胎的桑葚胚率(48.5%)和囊胚率(11.2%)均高于不饥饿处理的桑葚胚率(39.2%)和囊胚率(9.2%),但差异不显著(P>0.05)。本研究成功地构建了转人t-PA指形区缺失基因的体细胞核移植胚胎,体外囊胚率为11.2%。     

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎研究

[目的]为生产转基因克隆猪奠定基础。[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白（RFP）基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况。[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胞（80.56%）相比无显著差异（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组（6.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体。[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,能够成功克隆出转基因胚胎,并获得转基因囊胚。     

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎（摘要）

[目的]为生产转基因克隆猪奠定基础。[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白（RFP）基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况。[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胸（80.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组（6.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体。[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,并成功地克隆出转基因胚胎。     

SAHA处理供体细胞对山羊克隆胚胎早期发育的影响

为探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂羟肟酸(SAHA)对体细胞和山羊核移植胚胎早期发育的影响,采用不同浓度SAHA处理山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblasts,GEFs),并检测其AcH3K9水平、细胞增殖能力、细胞周期及胚胎发育情况、乙酰化水平、多能性基因的表达水平。结果显示,SAHA处理后GEFs的AcH3K9水平显著上升(P0.05),2.5μmol/L SAHA处理浓度即可显著提高GEFs组蛋白H3K9的乙酰化水平;浓度≤2.5μmol/L时,对细胞增殖能力无明显影响;浓度为5.0μmol/L和10.0μmol/L时,细胞活力显著下降(P0.05)。AcH3K9上调会引起G0/G1和S期的细胞比例下降(P0.05)。因此,选择经2.5μmol/L SAHA处理的供体细胞进行核移植。试验组的胚胎卵裂率和囊胚率显著高于对照组(P0.05),其卵裂率接近于卵胞质单精子注射(ICSI)组。试验组的囊胚率乙酰化水平显著高于对照组,且低于ICSI组(P0.05)。与对照组相比,试验组囊胚的Oct4、Sox2和Nanog的mRNA表达水平均上升(P0.05),且均接近于ICSI组。说明,选用2.5μmol/L SAHA处理供体细胞可提高体细胞核移植效率和胚胎品质。     

PD0325901和CHIR99021促进牛体细胞克隆胚胎体外发育的研究

【目的】选取MAP2K和GSK3的抑制剂PD0325901、CHIR99021(简称2i)对牛体细胞核移植(SCNT)胚胎进行处理,研究这2种小分子物质对胚胎发育及其多能性基因(OCT4、SOX2、KLF4、DPPA3、CDX2、GATA4、NANOG)表达的影响。【方法】以牛皮肤成纤维细胞为供体,牛MⅡ期卵母细胞为受体,构建牛SCNT胚胎,采用添加2i(PD0325901 0.4μmol/L,CHIR99021 3μmol/L)的胚胎培养液体外培养SCNT胚胎72h,以mSOF+DMSO培养液处理的SCNT胚胎及体外受精(IVF)胚胎为对照,统计核移植胚胎体外发育率,并对胚胎多能性相关基因的表达进行实时定量PCR检测。【结果】与对照相比,2i处理能使SCNT胚胎囊胚率和囊胚细胞总数显著增加,凋亡细胞率显著下降,多能性相关基因NANOG和SOX2表达量上调,而细胞分化相关基因GATA4的表达量下调,其他基因表达量变化不显著,从而使SCNT胚胎的发育状态更接近于IVF胚胎。【结论】2i共处理72h可优化SCNT胚胎发育状态。     

印记基因XIST和H19 DNA甲基化水平与猪克隆胚胎发育效率关联分析

目的 体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)在农业、生物医学等领域应用广泛,但是克隆效率太低制约了该技术的应用和推广。本研究的目的在于探究印记基因XIST和H19 DNA甲基化水平与克隆效率的联系。方法 利用同一头猪源耳朵成纤维细胞培养获得14个细胞克隆团,分别作为供体细胞进行SCNT试验,统计比较以各克隆团为供体细胞生产克隆胚胎的囊胚率以及各囊胚的XIST和H19基因调控区的DNA甲基化水平,对XIST和H19基因差异甲基化区域DNA甲基化水平与克隆胚胎的囊胚率进行相关性分析。结果 以1号克隆团为供体细胞得到囊胚的XIST基因DNA甲基化水平最高且囊胚率最低,分别为65.04%、8.6%,以14号克隆团为供体细胞得到XIST基因囊胚的DNA甲基化水平最低但囊胚率最高,分别为16.68%、38.2%;相关性分析表明XIST基因的DNA甲基化水平与囊胚率之间存在高度负相关(|r|=0.8125>0.8)。H19基因A侧甲基化平均水平最高和最低分别为5.12%和0.61%,相关性分析表明H19基因A侧DNA甲基化水平与囊胚率间只有极弱的相关(|r|=0.1647<0.3);H19基因G侧DNA甲基化水平最高和最低分别为90.92%和72.69%,相关性分析表明H19基因G侧DNA甲基化水平与囊胚率间只有低度相关(0.3<|r|=0.3098<0.5)。结论 XIST基因DNA甲基化水平越低,则克隆团囊胚率越高。研究结果对提高猪SCNT胚胎发育效率,改善现有的猪SCNT技术体系提供了基础。     

生产转基因五指山小型猪重构胚条件优化

利用体细胞核移植技术是得到具有优良特征及抗病性五指山小型猪快速有效方法,因此将外源基因安全高效导入到供核细胞至关重要。利用不同转染试剂、转染方法对转染效率进行研究,确定G418筛选浓度。同时利用体细胞核移植技术生产转单体红色荧光蛋白重构胚。结果表明,使用U-023细胞核电转程序能有效介导质粒pCX-mRFP1转染猪耳成纤维细胞,转染率可达到83.33%。确定G418最佳筛选浓度为200μg.mL-1。利用转基因细胞作为核供体生产重构胚卵裂率是83.08%(221/266),囊胚率是11.65%(31/266)。研究结果为生产表达单体红色荧光蛋白五指山小型猪提供参考,从而为人类疾病发病机理研究以及生产人类疾病模型动物奠定了基础。     

cDNA Cloning of Goat DNA Methyltransferase 1,Screening of shRNA Vectors and Influences to Development of Nuclear Transfer Embryos

This study was designed to clone cDNA of goat DNA methyltransferase 1（DNMT1） gene,to screen an effective shRNAproducing vector targeting goat DNA methyltransferase 1 and to improve the developmental competence of goat nuclear transfer embryos by decreasing the DNMT1 expression in donor cells.In this study,PCR primers were designed against regions of high homology between bovine and sheep sequences and then used to amplify the larger portions of the coding regions.Next,3 RNAi oligonucleotides were designed based on the cloned sequences and inserted into pRNAT-U6.1/Neo vector,acquiring 3 new vectors,respectively termed pRNAD1,pRNAD2 and pRNAD3.Then the positive cells were sorted by flow cytometry after transfection and detected by real-time PCR analysis and sodium bisulfite genomic sequencing.Finally,the developmental rates of nuclear transfer（NT） embryos generated using donor cells with and without the effective shRNA vector respectively,as well as in vitro fertilization（IVF） embryos were observed and recorded.The results showed that the coding regions of goat DNA methyltransferase 1 gene was successfully cloned（GenBank no.FJ617538）.Furthermore,an effective interfering shRNA（pRNAD2） was obtained,with its interference effect being 47.88%.Finally,NT embryos with shRNA vector harbored better developmental competence during morula and blastocyst stage compared to controls（P 〈 0.05）,reaching the similar rates to IVF embryos（P 〉 0.05）.In conclusion,goat DNA methyltransferase 1 gene cDNA was cloned and sequenced,an effective shRNA vector responsible for inhibiting DNA methyltransferase 1 expression was developed and the developmental competence of goat nuclear transfer morulae and blastcysts was significantly improved,which provided a feasible pathway for improving goat nuclear transfer embryo development competence by decreasing the methylation level in donor cells through RNAi-mediated manner.     

TSA浓度及处理时间对猪体细胞核移植胚胎体外发育影响

曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂.有研究表明TSA处理可以提高核移植胚胎的发育率.为探讨TSA对猪核移植胚胎发育的作用,试验重点研究了TSA浓度及处理时间对核移植胚胎体外发育的影响,同时也探索了TSA对不同供核细胞构建的重构胚体外发育的影响.结果表明,40 nmol·L-...     

绵羊成熟卵母细胞GMP玻璃化冷冻影响发育因素的研究

利用GMP法(毛细玻璃管法)冷冻成熟的绵羊卵母细胞,旨在探讨冷冻和解冻处理方法对绵羊成熟卵母细胞发育潜力的影响.对比在玻璃化冷冻液中添加0.3 mol/L蔗糖;卵母细胞冷冻前用7.5 μg/ml CB预处理;卵母细胞去掉颗粒细胞冷冻;以及四步法解冻和三步法解冻对卵母细胞形态完整率、孤雌激活胚发育率的影响.结果显示:玻璃化冷冻液中添加蔗糖孤雌激活卵裂率达到56.70%,极显著高于对照25.40%(P<0.01),桑葚胚率(16.49%)比对照(4.76%)有明显提高(P<0.05);冷冻前用CB进行预处理,解冻后形态正常率为78.78%,明显高于对照61.11%(P<0.05),孤雌激活卵裂率(39.39%)也高于对照组(21.11%);去掉颗粒细胞裸卵与保留颗粒细胞成熟卵母细胞解冻后形态正常率、孤雌激活卵裂率及桑葚胚率、囊胚率之间无显著性差异(P>0.05);四步法解冻和三步法解冻后卵母细胞形态恢复及孤雌激活后的发育率,两组之间差异不显著(P>0.05).在玻璃化冷冻液中添加蔗糖及卵母细胞冷冻前用CB预处理有利于卵母细胞冷冻解冻后形态恢复及孤雌激活后的胚胎发育.     

中国南方荷斯坦奶牛TRAPPC9、DGAT1、GHR、ATP1A1基因多态性与产奶性状相关性分析

【目的】研究转运蛋白颗粒复合体9(TRAPPC9)、二酰甘油酰基转移酶(DGAT1)、Na~+,K~+-ATP酶(ATP1A1)和生长激素受体(GHR)基因SNP座位多态性与我国南方荷斯坦奶牛Holstein cattle群体产奶性状的相关性。【方法】利用飞行质谱基因分型技术对SNP座位进行多态性检测,使用SAS软件进行统计分析。【结果】TRAPPC9基因rs110017379座位多态性对乳蛋白率和乳脂率有显著影响(P0.05);DGAT1基因rs109421300座位多态性对乳脂率有显著影响(P0.05);ATP1A1基因rs110256520座位多态性对乳蛋白率有显著影响(P0.05);GHR基因rs41639260座位多态性对乳蛋白率有显著影响(P0.05),对乳脂率有显著影响(P0.05)。【结论】可以考虑将TRAPPC9、DGAT1、ATP1A1和GHR基因相关SNP应用到我国南方荷斯坦奶牛的分子标记辅助选择工作中。     

Vc对猪体细胞克隆胚胎体外及体内发育的影响

[目的]提高克隆猪的大批量生产效率,优化体外与体内培养体系。[方法]将所获得的猪体细胞克隆胚胎用含不同Vc浓度的培养液培养,比较体外囊胚发育力和囊胚细胞数,筛选出合适的培养浓度,然后用此浓度培养后的胚胎进行体内手术移植,统计克隆猪的分娩率和产仔情况。[结果]克隆胚胎在激活后用40μg/m L Vc处理22 h,体外培养未显著增加囊胚率,但显著提高了囊胚细胞数。体内移植结果显示,添加Vc未提高妊娠率,但增加了窝均总仔数,克隆效率差异显著。[结论]Vc处理有利于增强体细胞克隆胚的体内和体外发育能力。     

不同融合液对延边黄牛体细胞核移植效率的影响

[目的]探寻适宜延边黄牛体细胞核移植的最佳融合液。[方法]用延边黄牛颗粒细胞为供体细胞。试验1,比较3种浓度(0.25、0.280、.30 mol/L)3种融合液(蔗糖、D-山梨醇、甘露醇)对核移植胚胎融合率及重组胚体外发育的影响。试验2,比较3种0.28 mol/L融合液对核移植效率的影响。[结果]3种浓度的蔗糖、D-山梨醇、甘露醇融合液的融合率和卵裂率差异均不显著,但0.28 mol/L融合液处理的重组胚后期发育相对较好。3组融合液融合率(88.44%、86.83%、86.85%)差异不显著,蔗糖、甘露醇融合液卵裂率(87.98%、86.06%)差异不显著,在0.05水平上显著高于D-山梨醇融合液(78.64%);蔗糖、甘露醇融合液囊胚发育率(22.16%、19.91%)差异不显著,在0.05水平上显著高于D-山梨醇融合液(10.14%)。[结论]适宜延边黄牛体细胞核移植的最佳融合液为0.28 mol/L蔗糖融合液。     

转甜味蛋白Brazzein基因乳腺特异表达载体的山羊体细胞株筛选

[目的]建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法.[方法]将前期工作中构建的Brazzein基因山羊乳腺特异表达载体STP-pBC1进行线性化,采用脂质体法转染山羊成纤维细胞,以期获得转基因阳性细胞.[结果]采用脂质体法转染山羊成纤维细胞后,通过最适G418浓度（400 μg/ml）筛选获得转基因阳性细胞;转基因阳性细胞形态呈现梭形且核仁清晰,其生长曲线呈现正常的“S”;转基因阳性细胞经冷冻复苏后,仍呈现与冷冻前新鲜转基因细胞相似的形态和生长曲线;PCR鉴定结果表明,STP-pBC1已整合入转基因细胞的基因组中.[结论]成功获得乳腺特异的转甜味蛋白基因Brazzein的山羊成纤维细胞株.     

Factors influencing the somatic cell nuclear transfer efficiency in pigs

Using a data set from our laboratory, we assessed the effects of several factors on pig cloning efficiency. The results demonstrated that cells at high confluence (>90%) used as donor cell resulted in higher pregnancy rate, delivery rate and overall cloning efficiency (number of live offspring born per reconstructed embryo transferred to recipients) compared with the cells at 60% to 79% confluence and 80% to 89% confluence. Cells with four, five and six passages compromised the pregnancy and delivery rates compared with first passage cells. The number of blastocysts transferred by somatic cell nuclear transfer (SCNT) did not significantly affect the cloning efficiency, but transfer of blastocyst derived from in vitro culture 5 d after SCNT achieved a significantly higher pregnancy rate compared with one to two cell SCNT embryos from overnight culture. The highest pregnancy rate, delivery rate and the largest litter size were obtained when Bama Miniature pig fibroblasts were used as donor cells and Landrace/Yorkshire hybrid gilts were used as recipients. Recipients treated with chemicals for estrus synchronization had higher pregnancy rates compared with untreated recipients. Our data might be helpful for improving SCNT efficiency in pigs.