小鼠IL-5真核表达质粒的构建及表达

[目的]克隆小鼠白细胞介素-5（mIL-5）cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

新孢子虫NcGRA2基因真核表达质粒的构建及其在293细胞内的表达

[目的]为了构建新孢子虫NcGRA2基因的真核表达载体,探讨重组载体在体外细胞的表达.[方法]从含有NcGRA2基因的重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2中,用限制性内切酶进行酶切获得带有粘性末端的NcGRA2基因片段.经琼脂糖凝胶电泳切胶回收NcGRA2基因片段,与pcDNA3.1载体连接.将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-NcGRA2转染到293细胞中表达.[结果]经酶切分析和序列测定,证实了重组质粒的正确连接.经免疫荧光抗体试验验证pcDNA3.1-NcGRA2能在293细胞中表达NcGRA2蛋白.[结论]获得重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2,并能在体外细胞中表达NcGRA2蛋白,为进一步研究核酸疫苗的动物免疫试验奠定了基础.     

高表达牛气管防御素的真核重组载体的构建及其鉴定

根据GeneBank中牛TAP的序列设计了1对特异性引物,采用RT-PCR方法从牛气管组织扩增牛TAP基因,并克隆到pEASY-T3载体。测序结果表明,扩增的片段含有144 bp核苷酸,编码48个氨基酸,与已报道的bTAP有1个氨基酸不同。该基因与真核表达载体FG9重组,经过PCR,酶切和测序鉴定,筛选牛TAP基因重组真核表达载体。使用脂质体法将FG9-TAP重组质粒转染293T细胞,斑点ELISA检测结果表明,成功构建了高表达牛TAP基因的真核表达载体,为抗金黄色葡萄球菌转牛TAP基因奶牛培育研究奠定基础。     

三种鸭防御素真核表达载体的构建及其表达分析

为研究鸭防御素的真核表达,人工合成了鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因,并将其插入到真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N中构建重组表达质粒;重组表达质粒经酶切鉴定正确后,分别转染HEK293细胞进行表达,用RT-PCR和Westem-blot鉴定目的基因的表达情况。结果表明,酶切鉴定证实目的基因成功插入到真核表达质粒中;真核表达质粒转染HEK293细胞24 h后,在荧光显微镜下可见绿荧光蛋白表达;RT-PCR能检测到目的基因mRNA,但Western-blot没有检测到目的蛋白的表达条带。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株GP5基因的克隆及在293T细胞中表达

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCC VR-2332株GP5基因序列设计1对特异性引物,应用RT—PCR方法扩增PRRSVHn／06-1分离株GP5基因片段．将扩增片段克隆到真核表达载体pcDNA3．0中,测序后用DNAstar序列分析,构建的pcDNA—GP5重组质粒瞬时转染293T细胞,48h后用Western-blot检测。证明GP5基因在293T细胞中获得了表达,可与PRRSV阳性血清发生特异性反应．     

人pot1基因cDNA的克隆及其在HeLa细胞中的表达

目的：克隆人端粒保护蛋白（human proteetlon of telomeres 1.pot1）基因cDNA全编码区,构建成真核表达质粒并实现在HeLa细胞中的表达。方法：RT-PCR法扩增出HeLa细胞hpot1基因cDNA编码区全序列,定向克隆至真核表达载体pcDNA3,阳性重组质粒经插入片段测序验证;重组的pcDNA3-hpot1质粒瞬时转染HeLa细胞,RT-PCR和EMSA法（电泳迁移率改变分析）检测hpot1基因的表达水平。结果：来自Hela细胞的hpot1基因cDNA编码区全序列构建成的真核表达质粒pcDNA3-hpot1,经测序分析序列和ORF正确;该重组质粒转染在HeLa细胞48h后,hpot1基因表达水平增高。结论：真核表达载体pcDNA3-hpot1构建成功,并实现了hpot1在Hela细胞中的表达。     

弓形虫AMA1蛋白真核表达载体的构建及免疫活性检测

[目的]构建弓形虫AMA1基因的真核表达质粒,研究其在体外细胞中的表达情况。[方法]运用PCR方法和克隆技术,构建pcD-NA3.1-AMA1重组质粒;利用脂质体介导转染法,将该重组质粒导入HEK-293细胞,用Western blotting法检测其在体外的表达情况。[结果]从弓形虫RH株cDNA中扩增出AMA1基因片段,成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-AMA1,转染AMA1基因的HEK-293细胞表达产物经Western blotting鉴定,其分子量约为70kD,能被特异性免疫血清所识别。[结论]构建的真核表达质粒pcDNA3.1-AMA1能在HEK-293细胞中表达,为下一步弓形虫DNA疫苗的研究奠定了基础。     

鸡IL-18重组真核表达载体的构建及其对ND灭活苗的佐剂作用

从pGEM-ChIL-18克隆质粒扩增获得鸡IL-18(ChIL-18)全基因片段,并将其重组到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ChIL-18(简称pChIL-18).经PCR、酶切和基因测序证实,所获重组质粒含有目的片段,且连接、构建正确.pChIL-18转染Cos7细胞,转染细胞中含ChIL-18基因的mRNA,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用.pChIL-18对ND灭活苗免疫增强作用的研究表明pChIL-18能够提高ND灭活苗诱发的细胞免疫应答,为后续基因疫苗的研究奠定基础.     

猪细小病毒NS1基因真核表达载体pEGFP-N1-NS1的构建与表达

根据Gen Bank上发表的PPV的基因组序列,设计扩增非结构蛋白NS1基因的特异性引物。通过PCR方法克隆NS1基因,经双酶切及与pEGFP-N1载体连接构建了真核表达载体pEGFP-N1-NS1,将双酶切和测序鉴定正确的质粒转染至293T细胞,经过荧光观察和PCR方法鉴定。结果表明,克隆了猪细小病毒NS1基因的全序列1989 bp,成功构建了NS1基因的真核表达载体,并在293T细胞中转染表达。     

结核分枝杆菌TB10.4真核表达质粒的构建及免疫特性鉴定

以卡介苗(BCG)基因组、pEGFP质粒为模板,PCR扩增分别获得TB10.4基因片段、GFP-TB10.4融合基因片段,连接pVAX1真核表达载体,测序和酶切鉴定正确,分别命名为pVAX1-TB10.4和pVAX1-GFP-TB10.4;将重组质粒分别转染COS-7和HEK293T细胞,反转录PCR表明TB10.4基因成功转录,间接免疫荧光试验显示2种蛋白均能瞬时表达;再将重组质粒pVAX1-TB10.4免疫小鼠。结果表明:该质粒能够诱导低水平的抗体应答,同时诱发IFN-γ表达,并且能够加强BCG初次免疫后的免疫应答效果。该研究构建的真核表达质粒pVAX1-TB10.4能够诱导小鼠产生抗TB10.4免疫应答,为后续TB10.4蛋白生物学功能研究提供良好的生物材料。     

脑部特异表达SV40Tag转基因动物模型的建立

将猿猴病毒抗原蛋白(SV40Tag)片段克隆进脑部特异表达载体pMM279中,通过显微注射法制作转基因小鼠。采用PCR和Southern blotting检测目的基因整合,并通过RT-PCR检测目的基因的表达。结果表明:共出生29只仔鼠,经PCR检测出3只阳性,Southern blotting检测出2只阳性。RT-PCR检测到SV40Tag仅在前脑部皮层和海马表达。成功获得的脑部特异表达SV40Tag转基因小鼠模型,为SV40Tag的致病机制及脑肿瘤的治疗等研究提供工具。     

带有组氨酸标签的蛇毒基因在毕赤酵母中的表达

[目的]通过巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达带有组氨酸标签的蛇毒基因。[方法]利用基因重组技术,以海蛇基因为材料,通过PCR技术在N末端添加一个六聚组氨酸纯化标签,并将重组质粒导入菌株GS115,用1%甲醇诱导后,分泌表达了重组蛋白。[结果]测序结果显示该标签已成功插入,SDS-PAGE检测到分子量为28.5 kD的目的蛋白。[结论]成功表达了带有组氨酸标签的蛇毒蛋白,其具有良好的降纤活性。     

芍药栽培品种ISSR反应体系的优化和应用

以栽培芍药为材料,通过对ISSR-PCR反应体系中的Mg~(2 )、dNTP和Tag DNA聚合酶浓度的优化,以改进芍药的ISSR反应体系;从55对引物中筛选出4对有稳定扩增结果的引物;用这4对引物对22个芍药栽培品种的DNA进行扩增,其所得扩增产物与所选芍药性状经过数据处理后,用MATLAB软件分别进行聚类分析,结果表明供试芍药品种皆可分为3个类群,其分子标记与性状的聚类分析间有较强的相关性。     

竹胶合板阻燃性能的研究

以市场上常见的竹胶合板为对象,涂刷自制的膨胀型聚氨酯防火涂料,采用美国阿特拉斯(ATLA S)公司生产的HRR3热释放率系统,配合国产HC-2氧指数测定仪、XSHF-1防火涂料(小室法)等先进阻燃检测设备,按照美国航空标准(FAA)要求测试试样。分析并研究它们的阻燃机理,为发展竹材阻燃技术打下基础。     

阻燃剂用量对马尾松胶合板阻燃性能影响研究

为了提高马尾松胶合板的阻燃性能,以膨涨型聚氨酯防火涂料为研究对象,采用美国阿特拉斯（ATLAS）公司生产的HRR3热释放率系统和配合HC2氧指数测定仪、XSHF1防火涂料（小室法）等先进阻燃检测设备, 按照美国航空标准（FAA）测试试样,研究阻燃剂（成炭剂、脱水炭化催化剂、发泡剂）不同添加量对马尾松胶合板阻燃性能的影响。结果表明当阻燃剂按80%的比例加入时,马尾松胶合板的阻燃性能最好,试件的氧指数值显著增大,最高热释放率、2 min总热释放量和5 min内总热释放量显著降低。西北林学院学报22卷第6期黄晓东阻燃剂用量对马尾松胶合板阻燃性能影响研究     

大豆疫霉ISSR-PCR反应体系的建立

以大豆疫霉F8-6菌株为实验材料,分析了反应体系中的模板DNA、Tag DNA聚合酶、dNTP、M g2+的浓度对ISSR-PCR扩增结果的影响。确定了25滋L大豆疫霉ISSR反应中模板DNA的用量应在20～30ng,M g2+浓度为2m m ol·L-1,dNTP浓度为0.1m m ol·L-1,TagDNA聚合酶用量为1.5U时ISSR-PCR扩增效果最佳。     

南方几种常见树种燃烧热释放率研究

采用美国阿特拉斯公司生产的 HRR3 热释放率系统 ,按照美国航空标准 ( FAA)要求测试马尾松、檫树、米槠、木荷板材燃烧的热释放率 ( HRR) ,为阻燃板材选择合格基材     

苔藓植物SRAP反应体系的优化

以黄灰藓总DNA为材料,对影响SRAP-PCR反应的模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶浓度等因素进行了优化,分析了各因素对SRAP-PCR扩增结果的影响。结果表明,在25μLSRAP-PCR反应体系中,最佳反应条件为:模板DNA40ng;Mg2+浓度2.0mmol/L;dNTP浓度0.2mmol/L;正反引物15pmol;TaqDNA聚合酶2.0U。在此条件下,引物组合Me5/em7对13种苔藓植物扩增的条带清晰、多态性好,表明此反应条件适合于苔藓植物的SRAP-PCR反应体系。     

基因组DNA的提取及RAPD条件优化

提取了木奈基因组 DNA,并以其为模板对影响 RAPD扩增的重要参数进行优化试验 ,以期建立木奈 RAPD反应的优化体系 .结果表明 ,PCR扩增体系最佳条件是 :2 0 μL体积中 ,2 0 0 μmol·L- 1 d NTP、2 .5 mmol· L- 1 Mg Cl2 、0 .2 μmol· L- 1随机引物、2 5 .0 ng·μL- 1 DNA模板、1 -2 U Tag酶     

基于Struts的沙产业协会网站设计与实现

MVC(Model View Controller)是J2EE的一种开发模式,Struts是基于Servlet、JSP以及标签库技术的一个实现良好的MVC框架,可以更快的利用MVC理论进行系统的设计和开发.本文介绍了MVC模式及Struts的基本原理,并在此基础上设计实现了沙产业协会网站,系统层次清晰,结构合理,达到了预期目标.