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为了建立奶牛早期妊娠诊断检测方法,试验用GenBank公布的奶牛触珠蛋白(haptoglobin)Hp基因序列设计引物,扩增出Hp基因全长片段,将Hp基因亚克隆至Bac-to-Bac昆虫/杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTb的多克隆位点中,转入含昆虫杆状病毒骨架质粒的E.coli DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑筛选获得穿梭质粒rBacmid-Hp阳性克隆,在脂质体介导下转染昆虫细胞sf_9,获得含Hp基因的重组杆状病毒质粒rBacmid-Hp;用纯化的rBacmid-Hp蛋白免疫Balb/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞和鼠SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA法和有限稀释法筛选杂交瘤细胞;分别用ELISA法、Western-blot检测单克隆抗体腹水效价及特异性。结果表明:在sf_9细胞中成功表达Hp蛋白,该蛋白具有良好的生物学活性;制备了8株单克隆抗体,分别命名为3B_(12)、4F_4、4F_(11)、5D_7、5G_8、7E_5、10C_3和12F_9,腹水效价均在1∶5.12×10~4以上;亚类鉴定显示,除3B_(12)、4F_(11)、10C_3为IgG_(2a)外,其余单克隆抗体均属于IgG_1;筛选出1对配对单克隆抗体,分别为12F_9和4F_(11)。说明Hp蛋白可在Bac-to-Bac昆虫/杆状病毒表达系统中高效表达,并成功筛选出一对配对的高效单克隆抗体。 相似文献
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<正>动物防御素是一类内源性阳离子短肽,广泛分布于包括人类在内的各种哺乳动物体内,具有广谱抗菌活性,又被称为抗菌肽(AMPS)。早在1963年,美国科学家Zeya等人在研究豚鼠白细胞裂解物时就发现该类具有抗菌活性的物质[1]。随后,人们在昆虫、鸟类、鱼类、两栖类、爬行类和哺乳类等动物体内均发现有防御素的存在。到目前为止,已从多种动物和人体内分离出百余种防御素。哺乳动物防御素的抗微生物机理独特,不易产生耐药性,是机体抵抗外来致病性微生物侵袭 相似文献
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为探讨核因子E2相关因子(nuclear factor E2 related factor,Nrf2)基因沉默及激活后对牛子宫内膜上皮细胞的影响,本试验利用小分子干扰(siRNA)技术及Nrf2的激动剂叔丁基对苯二酚(tBHQ),分别从Nrf2基因的下调和上调表达来研究Nrf2对牛子宫内膜上皮细胞中血红素加氧酶-1(HO-1)和Homebox A10(HOXA10)基因表达的影响。结果显示,经实时荧光定量PCR方法检测,在设计的2条siRNA序列(siRNA-1209和siRNA-1672)中,siRNA-1672在终浓度为75 nmol/L、作用时间24 h时抑制效果较好,抑制效率在80%以上;经Western blotting方法检测,Nrf2蛋白表达水平在转染后96 h极显著下降(P0.01),而HO-1和HOXA10的mRNA表达量分别下降了60%和70%(P0.01),蛋白表达量在96 h后极显著或显著下降(P0.01;P0.05)。此外,经CCK8方法检测,Nrf2基因表达沉默后,牛子宫内膜上皮细胞增殖能力减弱。而在tBHQ激活Nrf2试验中,经Western blotting方法检测,tBHQ终浓度为30μmol/L时Nrf2蛋白表达量最高,极显著高于对照组(P0.01),且HO-1和HOXA10的蛋白表达量与对照组相比也明显上升。结果表明,本试验设计的siRNA-1672能特异性地抑制牛子宫内膜上皮细胞Nrf2的表达,而抑制Nrf2的表达会导致牛子宫内膜上皮细胞增殖能力下降,且Nrf2对牛子宫内膜上皮细胞HO-1和HOXA10基因表达存在调控作用。 相似文献
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试验旨在研究精氨酸(Arg)对干扰素-tau(interferon-tau,IFNT)处理的牛子宫内膜上皮细胞的调控作用及其可能的机制。将牛子宫内膜上皮细胞接种至6孔细胞培养板中,当达到70%~80%融合度时,向细胞培养基中加入不同浓度的IFNT(0、100 ng/mL),12 h后收集细胞检测未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)通路相关基因的表达情况;用不同浓度(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mmol/L)Arg处理牛子宫内膜上皮细胞,24 h后用CCK8法检测其对增殖率的影响,筛选出Arg的最佳作用浓度;将子宫内膜上皮细胞随机分为Arg饥饿组、Arg饥饿+IFNT处理组、Arg添加+IFNT处理组,在Arg饥饿或添加处理6 h后加入100 ng/mL IFNT,IFNT处理12 h后检测UPR通路(BiP、PERK、CHOP、ATF6)、凋亡(BAX、Caspase9)和容受性(HOXA10)相关基因表达情况。结果显示,IFNT刺激可诱导牛子宫内膜上皮细胞UPR通路相关基因BiP、PERK、CHOP、ATF6的表达显著上调;0.5 mmol/L Arg可显著提高牛子宫内膜上皮细胞的增殖率(P<0.05);Arg缺失可显著上调IFNT诱导下牛子宫内膜上皮细胞中BiP、PERK、CHOP、ATF6和BAX基因mRNA的表达(P<0.05),并显著下调HOXA10基因mRNA的表达(P<0.05),但对Caspase9基因mRNA表达无显著影响(P>0.05)。结果表明,Arg缺失可导致牛子宫内膜上皮细胞发生内质网应激,并影响子宫内膜宫受性的建立,可为进一步揭示Arg对牛子宫内膜的调控机制及制定减少妊娠早期胚胎丢失的营养调控策略提供参考。 相似文献
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用疑似患猪流行性腹泻病猪肠病料,扩增部分保护性抗原基因(COE基因),通过T4连接酶将COE基因与真核表达载体plRES2-EGFP进行连接,提取纯化重组质粒。通过脂质体转染vero细胞,用SDS-PAGE和westernblot鉴定COE蛋白的表达。用重组质粒对BALB/c小鼠进行免疫,观察免疫效果。结果显示成功构建了pIRES2-EGFP—COE真核表达载体;目的蛋白在vero细胞中得到表达;重组质粒免疫小鼠能够产生相应抗体。结果表明,COE核酸疫苗可在小鼠体内诱导相应的抗体产生,这为进一步研究猪腹泻病毒的核酸疫苗奠定了基础。 相似文献