转PRSV复制酶基因T2代番木瓜植株的抗病性测定

转PRSV复制酶基因的番木瓜植株，其自交及杂交二代植株经PCR检测和Southem-blot杂交的结果表明：目的基因整合在番木瓜的染色体上．人工接种PRSV的Ya、Vb、Sm株系于分子检测阳性的7～8叶期植株，转基因植株均表现高抗．在定植田间的9个月中，转基因植株无一发病，而对照则全部发病．     

VIGS介导的转复制酶基因番木瓜对PRSV的抗性

将PCR检测呈阳性的T4代转复制酶(replicase,Rep)基因番木瓜植株在苗期接种番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)Ys株系,定期采取不同部位的叶片进行Northern blot分析.结果表明:接种PRSV之前,在植株的各部位均能检测到转基因完整的Rep mRNA,但接种后不同时间在接种叶以上部位陆续出现了Rep mRNA的降解;接种后30 d内,接种叶下部第1片叶上始终未出现Rep mRNA的降解;另外,在发生mRNA降解的叶片上都能相继检测到小分子干涉RNA(short interferring RNA,si RNA)的产生.这说明转基因番木瓜的抗病性与mRNA的降解及siRNA的积累有着密切的关系.这种抗性发生在转录后水平上,是由病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)介导产生的.     

番木瓜环斑病毒融合基因植物表达载体的构建

利用PCR重叠延伸技术（gene splicing by overlap extension,SOE）将番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）Vb株系的外壳蛋白（coat protein,CP）基因和Ys株系的复制酶（replicase protein,RP）基因构建成融合基因VY。同时对常规的SOE法进行了改进,并对改进的SOE的反应体系进行了优化,其中以Pyrobest DNA聚合酶和60℃的退火温度为最佳。将融合基因n’构建在植物表达载体pCAMBIA2300上,测序结果表明,该融合基因的序列与设计相符。融合基因VY植物表达载体的构建,可为进一步获得对PRSV广谱抗性的转基因番木瓜奠定基础。     

利用基因枪法获得可遗传的抗除草剂转基因水稻植株

 利用基因枪转化系统，将含有由CaMV35S启动子启动的bar基因的转化质粒pCB1导入水稻幼胚，经筛选、再生得到3株抗除草剂Basta的转基因植株。经PCR及Southern分析，在转基因植株基因组中均检测到了bar基因的整合；经RNA点杂交分析，检测到了bar基因在转基因植株中RNA水平的表达。在转基因植株JY119-2的总计321株T#-1代自交后代中，有274株表现出除草剂抗性，47株敏感。从该274株抗性植株中随机选取8株进行Southern分析，结果均检测到了bar基因的整合，表明bar基因已遗传到了T#-1代植株中。     

hrpZPsg12转基因烟草及其抗性评价

【目的】将来源于大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)Psg12菌株的hrpZPsg12基因导入烟草"云烟87",对转化植株进行烟草普通花叶病毒(TMV)、烟草马铃薯Y病毒(PVY)和烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)的抗病性鉴定,为培育多抗烟草新品系奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法,将hrpZPsg12基因转入烟草"云烟87"中,对T0和T1代转基因植株进行PCR检测、Southern杂交,并对T1代转基因植株的抗病性进行评价。【结果】hrpZPsg12基因成功转入"云烟87"中,PCR检测表明共获得7株T0代阳性植株、35株T1代阳性植株。对T1代PCR阳性植株进行Southern检测,表明外源目的基因hrpZPsg12已经整合进烟草基因组中,并可在转基因后代植株中稳定遗传。抗病性测定表明,T1代转基因烟草对TMV和PVY表现高抗,对烟草野火病表现中抗。【结论】获得了高抗TMV和PVY及中抗烟草野火病菌的转hrpZPsg12基因植株20和15株。     

用花粉管通道法将bar基因导入水稻获得可遗传的转基因植株

利用花粉管通道法将抗Basta除草剂的bar基因导入水稻品系“E32” ,获得转基因植株。抗性鉴定表明 ,转基因植株能充分表达对Basta除草剂的抗性 ;通过对转基因植株后代进行PCR分析 ,证实bar基因已整合到受体植株的基因组中。遗传分析表明 ,bar基因能在有性生殖过程中传递给后代 ,并在T3 代开始分离出抗性一致的稳定株系     

转基因抗虫棉晋棉44号选育研究及高产栽培要点

采用农杆菌介导转化法,将CrylAc3导入受体棉花品系冀合492中,获得再生植株。经PCR扩增分析,得到和预期长度一样大小的743pb目的基因片段,初步证明外源基因已整合到棉花基因组中。进行PCR-Southern杂交检测结果,所有PCR阳性植株产物电泳带均显示出较强信号,进一步说明外源B t基因已整合到棉花体内。生物检测结果,转基因棉花对棉铃虫具有很高抗性,苗期、蕾期、开花期高抗株率分别达80%~96%,说明转化CrylAc3可以使受体棉花具有很高的杀虫活性。通过连续选择和自交纯合及南繁加代,得到综合性状优良的品系2001pb-3。参加山西省中熟棉花区域试验,2005年通过审定,定名为晋棉44号。晋棉44号农艺性状优良,高产优质。     

番木瓜CpTIFY10A-like基因克隆及表达分析

[目的]克隆番木瓜CpTIFY10A-like基因序列,并分析其表达特性,为探索该基因功能和抗番木瓜环斑病毒(PRSV)分子机制提供理论依据.[方法]结合前期研究的抗PRSV转录组数据,利用RACE对上调表达基因Cp-TIFY10A-like进行克隆,获得该基因cDNA全长序列,分析其编码区序列(CDS)及进行生物信息学分析.利用已鉴定的PRSV对3月龄番木瓜植株进行不同处理,以感染PRSV且出现病症的植株(CK+)、1.0 mL/L禾甲安(CTS-N)灌施感染PRSV且出现病症的植株(B)为处理组,以清水灌施(不添加禾甲安)不感染PRSV的植株(CK-)为对照组,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同处理下PRSV基因和CpTIFY10A-like基因在番木瓜叶片中的表达情况.最后将CpTIFY10A-like基因CDS序列连接至pET28a-sumo载体上构建原核表达载体,转化Rosetta(DE3)感受态细胞,通过不同浓度IPTG诱导蛋白表达,利用SDS-PAGE电泳检测原核表达情况.[结果]CpTIFY10A-like基因全长为1352 bp,CDS序列为822 bp,编码273个氨基酸残基;其编码蛋白理论等电点(pI)9.23,不稳定系数62.97,亲水性平均系数-0.458,属于不稳定的亲水性碱性蛋白,定位在细胞核上,其二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,同时含有少量的β-折叠和延伸链.CpTIFY10A-like蛋白与酸枣和白梨TIFY蛋白的氨基酸序列相似性较高,均含有特定的TIFY结构域,属于TIFY蛋白家族,三者在系统发育进化树上聚在同一分支,表明亲缘关系较近.不同处理的番木瓜叶片中,PRSV基因的相对表达量排序为CK+(1.02)>B(0.39)>CK-(0),CpTIFY10A-like基因的相对表达量排序为B(53.12)>CK+(1.15)>CK-(1.02),且CpTIFY10A-like基因在经禾甲安处理的感染PRSV番木瓜叶片中相对表达量显著升高(P<0.05,下同),而PRSV基因的相对表达量显著降低.CpTIFY10A-like基因在原核细胞中表达蛋白的分子量与理论分子量(29.36 kD)相符,且不同浓度IPTG诱导下,IPTG浓度越高,蛋白表达量越多,表明该基因在原核细胞中成功表达.[结论]禾甲安可诱导CpTIFY10A-like基因高效表达,进而通过茉莉酸通路起调节作用以抵抗PRSV感染,即CpTIFY10A-like基因在番木瓜抗PRSV过程中发挥重要调控作用.     

外源基因在不结球白菜转基因植株后代中的表达

应用农杆菌介导法将含有豇豆胰蛋白酶抑制剂基因和新霉素磷酸转移酶基因的重组质粒导入不结球白菜地方品种———“中脚黑叶”和“矮脚黑叶”中 ,获得抗虫转基因植株。卡那霉素抗性和抗虫性在转基因植株自交后代T1代植株中发生分离 ;在T2 代中出现 3种不同类型的株系 :抗性纯合、杂合型和敏感性纯合株系。卡那霉素抗性和抗虫性在转基因植株自交后代中的表现基本符合孟德尔显性单基因的分离规律。从T2 、T3 、T4代中选择出抗虫性纯合株系 ,并获得一批对 1～ 2龄鳞翅目小菜蛾、斜纹夜蛾幼虫的校正死亡率达 6 0 %左右的单株     

转hrpZpsta抗病基因大豆的研究

【目的】将具有广谱抗病性的hrpZpsta基因导入大豆,为培育抗灰斑病的转基因大豆新品系奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法,以大豆子叶节为受体,将具有广谱抗性的hrpZpsta基因转入大豆品种"吉林30"中,以耐盐基因badh作为筛选标记性基因,经过抗性筛选,对转基因植株进行PCR检测、Southern杂交和RT-PCR检测分析。【结果】确定的NaCl筛选浓度为200mmol/L。对T1、T2和T3代转基因植株进行PCR检测,得到T1代阳性植株30株,T2代45株,T3代284株,说明外源hrpZpsta基因在转基因后代中能够遗传。Southern杂交结果表明,外源目的基因hrpZpsta已经整合进大豆基因组中,且整合位点不尽相同。RT-PCR结果表明,hrpZpsta基因在受体大豆中获得表达。【结论】获得了hrpZpsta基因遗传表达的T3代转基因大豆株系。     

东莞大蕉超表达拟南芥CBF1基因及其抗寒性检测

【目的】研究超表达拟南芥CBF1基因（AtCBF1）对大蕉抗寒性的影响,为从大蕉克隆抗寒相关基因奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法转化东莞大蕉的胚性细胞悬浮系,获得转AtCBF1基因的大蕉植株;利用GUS组织染色、PCR、RT-PCR以及RT-qPCR对转基因植株进行鉴定;比较低温处理后的转基因株系和对照的冷害特征以及超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量等生理生化指标,鉴定转基因大蕉植株的抗寒能力。【结果】试验共获得6个抗性再生转化系。GUS组织染色结果表明,除T1外,其余均为阳性;PCR鉴定结果表明,AtCBF1在6个抗性再生转化系均为阳性,而GUS基因在T1转化系中没有检测出;RT-PCR结果表明,AtCBF1在6个转化系均得到表达,对T1、T2和T3 3个转化系进行RT-qPCR检测发现,AtCBF1基因在3个转基因株系表达水平存在差异;在低温处理下,转基因植株的叶片相对电导率、MDA的累积都低于非转基因植株,而SOD总活性高于对照;低温处理条件下,转基因植株叶片的冷害症状明显轻于对照。【结论】AtCBF1在大蕉中超表达,具有增强大蕉SOD活性,降低因低温导致的MDA含量和离子渗漏率,缓解质膜过氧程度,进而改善大蕉植株抗低温胁迫的能力。     

用花粉管通道法将慈姑蛋白酶抑制剂基因(API)导入水稻获得转基因植株

采用花粉管通道法遗传转化技术,将慈姑蛋白酶抑制剂基因(API)导入水稻品系9311中,获得了转基因植株。抗虫性鉴定结果表明:部分转基因植株对水稻螟虫的抗性比对照明显提高;PCR扩增获得了与引物扩增片段长度相同的DNA片段,证实API基因已整合到受体植株的基因组中。遗传分析表明,API基因能在有性生殖过程中传递给后代,并于T4代分离出抗性纯合的株系。     

转G10aroA棉花株系的获得及分子生物学鉴定

【目的】培育具有抗草甘膦除草剂的棉花材料具有极其重要的意义。利用农杆菌介导法在棉花中转入编码EPSPS酶的抗草甘膦除草剂基因G10aroA,通过体细胞愈伤诱导组织培养技术获得能够稳定遗传的转基因棉花株系材料。【方法】首先,利用不同草甘膦抗性筛选条件比较分析不同棉花受体材料的愈伤诱导效率;其次,以R15材料作为受体,利用含有G10aroA的农杆菌侵染下胚轴切段,在进行体细胞愈伤诱导的组织培养过程中通过草甘膦抗性筛选获得棉花再生植株,对获得的棉花再生植株进行纯合繁育。在此基础上,利用PCR扩增检测证实外源G10aroA在转基因植株中能够稳定遗传;利用RT-PCR分析其外源基因在转基因植株不同组织中的转录水平进行研究、并进一步利用Western-blot对转基因植株中外源蛋白的表达进行分析。【结果】在优化的草甘膦筛选条件下,以草甘膦浓度为2.5 mmol•L-1的抗性条件进行棉花愈伤诱导筛选并获得棉花再生植株;利用特异引物进行PCR检测结果表明,在检测的全部再生植株中,扩增得到1.8 kb预期大小目标条带的阳性株系32株,其中,收获的27个株系的外源目标基因能够在T0、T1转基因植株中稳定遗传;对G10aroA在转基因株系L12、L14的不同组织中的转录表达进行定量RT-PCR分析表明,外源G10aroA在转基因棉花植株的不同组织中表达具有差异,相对表达量高低依次为茎、苞叶、叶和花;另外,蛋白检测结果进一步表明,该外源基因能够在转基因株系L7、L12和L14中植株中正常表达为预期46 kD的EPSPS蛋白。【结论】通过农杆菌介导法转化外源抗草甘膦基因G10aroA,在草甘膦抗性条件下进行棉花体细胞诱导的组织培养,成功获得转外源G10aroA的棉花再生株系,并通过分子生物学方法研究证实外源G10aroA能够在T0、T1转基因株系中稳定遗传、转录以及表达。     

几个转基因植株后代的遗传分析

对用农杆菌介导的遗传转化法获得的9个独立转化子进行了遗传分析。结果显示:除转基因植株R1Ab-8外,其他8个转基因植株都出现选择标记基因bar与目标基因cry1Ab进行共整合。单拷贝转基因植株中,除R1Ab-6植株外,其余4个转基因植株均表现3∶1的孟德尔式的遗传规律。双拷贝转基因植株R1Ab-3出现15∶1的分离比,说明两个拷贝的外源基因整合到受体基因组的不同染色体;双拷贝转基因植株R1Ab-7出现3∶1的分离规律,说明两个拷贝的外源基因整合到受体基因组的同一染色体。同时,还发现R0代表现抗性且出现孟德尔分离比的单拷贝转基因植株的纯合体的杂种F1代也能表现抗虫性,表明,利用转基因培育作物新品种时,应选择单拷贝、符合孟德尔遗传且表现目标性状的转基因植株作母本。     

转反义PLDγ基因小麦的获得及其抗白粉病的初步鉴定

利用穗茎注射法将反义PLDγ基因导入烟农15和农大1521两个小麦品种中,旨在获得抗病性增强的转基因植株。结果表明:T3代经PCR及PCR-Southern杂交鉴定,目的基因已经整合到小麦的基因组中,并能在小麦基因组内稳定遗传;烟农15和农大1521的6个转基因株系的抗白粉病的能力明显增强。     

Genetic and agronomic traits stability of marker-free transgenic wheat plants generated from Agrobacterium-mediated co-transformation in T_2 and T_3 generations

Genetically modified wheat has not been commercially utilized in agriculture largely due to regulatory hurdles associated with traditional transformation methods. Development of marker-free transgenic wheat plants will help to facilitate biosafety evaluation and the eventual environmental release of transgenic wheat varieties. In this study, the marker-free transgenic wheat plants previously obtained by Agrobacterium-mediated co-transformation of double T-DNAs vector were identified by fluorescence in situ hybridization(FISH) in the T_1 generation, and their genetic stability and agronomic traits were analyzed in T_2 and T_3 generations. FISH analysis indicated that the transgene often integrated into a position at the distal region of wheat chromosomes. Furthermore, we show that the GUS transgene was stably inherited in the marker-free transgenic plants in T_1 to T_3 generations. No significant differences in agronomic traits or grain characteristics were observed in T_3 generation, with the exception of a small variation in spike length and grains per spike in a few lines. The selection marker of bar gene was not found in the transgenic plants through T_1 to T_3 generations. The results from this investigation lay a solid foundation for the potential application of the marker-free transgenic wheat plants achieved through the co-transformation of double T-DNAs vector by Agrobacterium in agriculture after biosafty evaluation.     

转Bcl和Rip基因小麦的鉴定和遗传分析

 对转Bcl、Rip基因小麦的T1、T2和T3代植株进行了分子检测和抗病性鉴定，并根据检测结果对其遗传行为做了探讨与分析。T1代检测结果表明，选择标记基因nptⅡ的分离符合孟德尔遗传规律；功能基因Rip的分离比2.62∶1，符合孟德尔分离规律；功能基因Bcl的分离比为4.50∶1，偏离了孟德尔遗传规律。T1代植株Southern blot分析结果表明，功能基因Bcl和Rip已经稳定整合到小麦基因组上，多数植株为单拷贝整合。T2代纯合稳定植株Southern blot分析结果表明，功能基因Bcl和Rip在小麦染色体上多为双拷贝整合。白粉病和全蚀病鉴定结果表明，功能基因对白粉病和全蚀病均有一定的抗性。农艺性状调查结果表明，除了株高外转基因植株其它农艺性状与受体品种一致。     

转病毒移动蛋白及复制酶基因烟草的协生和重组风险分析

 对转化番茄花叶病毒 (ToMV)、烟草花叶病毒 (TMV)移动蛋白 (MP)基因和黄瓜花叶病毒P1株系(CMV P1)部分复制酶基因的 3种转基因烟草 ,分别接种马铃薯X病毒 (PVX)、马铃薯Y病毒 (PVY)、CMVRB株系 (CMV RB)和TMV。症状观察和ELISA测定发现 ,各病毒在转基因烟草和非转基因烟草上的症状及病毒浓度没有显著差异 ,表明这些病毒在转基因烟草上没有协生作用发生。对转化ToMVMP基因和转化CMV P1部分复制酶基因的转基因烟草 ,分别接种TMV和CMV RB ,定期进行生物学、ELISA和免疫捕获反转录PCR(IC RT PCR)检测 ,在 16个月的连续测定中未发现病毒重组现象。     

转烟草花叶病毒复制酶基因烟草的病毒抗性研究

对用根瘤农杆菌双质粒法导入烟草花叶病毒复制酶基因的转基因烟草后代的研究表明：转基因烟草抗烟草花叶病毒和马铃薯Ｘ病毒,但感染马铃薯Ｙ病毒,抗病毒的转基因烟草存在某种机制限制着病毒在植株内的转移,转烟草花叶病毒复制酶基因烟草植株内不产生该复制酶,其抗病毒的确切机制有等进一步研究。