桂糖11号Rubisco基因克隆、原核表达及纯化

[目的]通过原核表达及纯化获得甘蔗1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大、小亚基融合蛋白,为获得符合抗体制备条件的高纯度融合蛋白提供技术支持.[方法]以甘蔗品种桂糖11号(GT11)+1叶为材料,根据NCBI公布的甘蔗Rubisco大、小亚基基因(rbcL和rbcS)的编码域序列(CDS)设计特异性引物,PCR扩增rbcL和rbcS基因的CDS,然后连接至原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒后转入原核细胞(大肠杆菌Rosetta)中诱导表达,用镍亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,并比较分析桂糖11号与其他甘蔗品种在rbcL和rbcS基因的CDS及编码蛋白序列方面的差异.[结果]rbcL和rbcS基因的CDS长度分别为1431和510bp,其中桂糖11号rbcL基因的CDS与Saccharumhybrid cultivar SP80-3280(GenBank登录号AE009947)、Saccharum hybrid cultivar Q155(GenBank登录号KU214867)的一致,桂糖11号rbcS基因的CDS与Saccharum hybrid cultivar GT28(GenBank登录号JN591757)的存在7个碱基差异,但仅有2个氨基酸发生错义突变.RbcL和RbcS融合蛋白以包涵体形式存在原核细胞中,用镍离子亲和层析纯化及超滤浓缩后其浓度均在1.0 mg/mL以上.[结论]从桂糖11号成功克隆Rubisco大亚基和小亚基基因的CDS,大亚基基因的CDS比小亚基的保守性更高,且均可在原核细胞中高度表达,经纯化浓缩获得的高纯度融合蛋白可用于制备Rubisco单克隆抗体.     

木薯SCARECROW-LIKE(SCL)基因克隆、生物信息学及非生物胁迫下表达分析

[目的]克隆木薯SCARECROW-LIKE(MeSCL)基因,对其进行生物信息学分析,并检测其在非生物胁迫下的表达情况,为深入研究木薯MeSCL基因响应非生物胁迫的调控机制提供理论参考.[方法]以木薯品种D346为材料,采用RT-PCR克隆MeSCL基因编码区(CDS)序列,并利用生物信息学分析软件进行序列特征分析,采用实时荧光定量PCR检测其在干旱、盐、氧化和低温胁迫下木薯叶片中的表达情况.[结果]克隆获得的MeSCL基因编码区(CDS)序列全长1655 bp,与参考序列(GenBank登录号LOC110627921)仅存在2个碱基的差异,开放阅读框(ORF)的长度为1560 bp,编码519个氨基酸,编码蛋白分子量为57.84 kD,等电点(pI)为6.08,脂肪系数为80.46%,总平均亲水性指数为-0.195,为亲水性蛋白,含有1个信号肽、6个从内部到外部的跨膜螺旋区和5个从外部到内部的跨膜螺旋区,定位于细胞核和内质网中,属于GRAS蛋白家族成员,具有该家族的保守结构域.MeSCL蛋白三级结构模型显示,该蛋白含有14个典型的α螺旋、10个β-折叠和36个β-转角.MeSCL蛋白与橡树HbSCL蛋白的相似性最高,为90.80%,与蓖麻RcSCR、胡杨PeSCL、毛果杨PtSCR、可可树TcSCR和哥伦比亚锦葵HuSCL蛋白的相似性在80.00%左右.MeSCL基因受干旱、盐、氧化和低温胁迫诱导表达量整体呈升高趋势,但在不同处理时间的表达量存在明显差异,其中,干旱和氧化胁迫下,MeSCL基因均在处理24 h时表达量最高,分别是对照的6.05和11.17倍,而盐和低温胁迫下,MeSCL基因均在处理6 h时表达量最高,分别是对照的11.76和3.80倍.[结论]MeSCL基因参与木薯植株的非生物胁迫响应,正向调控其抗非生物胁迫能力.     

人工合成靶序列快速构建多靶标RNAi 表达载体…

番木瓜环斑病毒(PRSV)正引起番木瓜毁灭性严重病害,番木瓜叶扭曲花叶病毒(PLDMV)也在威胁着目前转基因番木瓜的推广和应用。通过人工合成包含PRSV和PLDMV两种病毒的NIb和HcPro基因多个保守区域的靶序列作为模板,扩增两条长短不同但大部分重叠的靶序列,并通过引物设计时添加的特定酶切位点两个靶序列反向连接,形成以长靶序列的5’一部分序列作为发夹结构的环,不需要另外插入内含子序列的反向重复发夹结构的RNAi表达载体pPTN-LS。该方法构建的RNAi表达载体,不仅具有快速、稳定性高等优点,还能同时靶标PRSV和PLDMV两种病毒的NIb和Hc-Pro基因多个保守区域的靶序列,能有效提高沉默效率,为利用RNAi技术培育广谱、高效、稳定且安全性高,同时抗PRSV和PLDMV病毒病的转基因番木瓜新种质的奠定基础。     

木薯ETR1基因克隆及表达分析

[目的]克隆木薯乙烯受体基因(MeETR1)并检测其在木薯采后生理性变质(PPD)过程中的表达情况,为研究ETR基因家族在木薯PPD过程中的功能作用提供参考依据.[方法]以木薯品种华南8号为材料,应用PCR扩增MeETR1基因编码区(CDS)序列,采用生物信息学分析方法对其编码蛋白的理化性质、亲/疏水性、保守结构域及二、三级结构等进行预测分析,通过亚细胞定位确定MeETR1蛋白在植物细胞中的表达分布,并利用实时荧光定量PCR检测MeETR1基因在木薯采后PPD过程的表达情况.[结果]克隆获得MeETR1基因CDS序列全长2220 bp,共编码739个氨基酸,蛋白分子量为82.88 kD,理论等电点(pI)为6.76;MeETR1基因编码蛋白属于疏水蛋白,含有ETR1家族4个典型模块,即GAF结构域、HisKA结构域、HATPase_c结构域和REC结构域;其二级结构中α-螺旋占47.43%、延伸链占14.46%、无规则卷曲占38.11%.MeETR1氨基酸序列(XP_021625986.1)与同属大戟科的蓖麻(Ricinus communis)ETR1氨基酸序列(XP_002533252.1)相似性为92.42%,亲缘关系较近;MeETR1蛋白定位在细胞质中.与0 h(PPD前)相比,MeETR1基因的相对表达量在木薯采后PPD过程中(12、24、48和96 h)均呈显著下降趋势(P<0.05),即MeETR1基因表达受木薯采后PPD过程的抑制.[结论]MeETR1基因编码蛋白含有GAF、HisKA、HATPase_c和REC等4个典型的结构域,与其他植物ETR1在生物学功能上具有一致性;MeETR1基因表达在木薯采后PPD过程中受抑制,可能在此过程中发挥负调控作用.     

番木瓜感染畸形花叶病毒后的生理变化及扫描电镜观察

[目的]阐明番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV)的侵染机理及侵染后番木瓜自身防御体系对抗病毒的作用机制,为番木瓜病毒病防治提供参考.[方法]以台农二号番木瓜为材料,通过RT-PCR检测接种PLDMV处理组(T)与健康空白对照组(CK)的病毒感染情况,采用分光光度法测定PLDMV侵染对番木瓜相关生理指标的影响,运用扫描电镜法观察两组番木瓜叶片的微观结构差异.[结果]通过RT-PCR检测,证明T番木瓜植株已感染PLDMV.T与CK番木瓜叶片在表征、微观解剖结构及生理指标等方面均存在明显差异,与CK番木瓜叶片相比,T番木瓜叶片纵切面栅海比及背部绒毛密度明显小于CK番木瓜,气孔密度大于CK番木瓜;T番木瓜的过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性和脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、超氧阴离子102714 含量均显著高于CK番木瓜(P<0.05,下同),过氧化氢酶(CAT)活性和叶绿素(Chl)含量显著低于CK番木瓜,而超氧化物歧化酶(SOD)和几丁质酶活性两组间无显著差异(P>0.05).[结论]番木瓜受PLDMV侵染后,其叶片结构被破坏,细胞毒害损伤严重,体内代谢紊乱,多种代谢调节平衡被打破,番木瓜的正常生长发育受阻.     

禾生素、病毒必克和病毒A对番木瓜体内PRSV-CP基因表达的抑制作用

为了解禾生素、病毒必克和病毒A对番木瓜植株体内PRSV基因表达的影响,以组织培养的日升番木瓜为研究对象,以β-actin基因为内参基因,应用RT-PCR技术对番木瓜体内的PRSV-CP基因进行半定量分析,建立一个特异、稳定的RT-PCR半定量检测体系,研究了禾生素、病毒必克和病毒A处理对番木瓜体内PRSV基因表达量的影响。初步说明,0.2%的禾生素及4.0g/L和1.0g/L的病毒必克显著抑制了番木瓜体内PRSV-CP基因的表达,而病毒A及其它浓度的禾生素和病毒必克对番木瓜体内的PRSV-CP基因的增殖没有抑制作用。     

猪USP18基因表达规律及其与产仔数性状 的关联分析

[目的]明确泛素特异性蛋白酶18基因(USP18)在猪不同妊娠时期子宫内膜中的表达规律及其与雌激素和孕激素的关系,并分析其多态性与产仔数性状的关联性,为揭示USP18基因在猪妊娠过程中的作用机理提供参考依据.[方法]PCR扩增猪USP18基因编码区(CDS)序列及开展相关生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测USP18基因在梅山猪和大白猪妊娠15、26和50 d子宫内膜中的表达水平,通过体外细胞试验检测分析雌二醇和孕酮联合处理对子宫内膜上皮细胞USP18基因表达的影响,并采用PCR-RFLP和SPSS 19.0检测猪USP18基因多态性与产仔数性状的关联性.[结果]猪USP18基因CDS序列为966 bp,共编码322个氨基酸残基,编码蛋白分子量为37 kD,理论等电点(pI)为6.74;猪USP18氨基酸序列与牛USP18氨基酸序列的同源性为82%,二者的遗传距离最近.USP18基因在妊娠15和26 d梅山猪和大白猪子宫内膜中的相对表达量均明显高于妊娠50 d,且在妊娠26和50 d,USP18基因在梅山猪子宫内膜组织中的相对表达量显著高于在大白猪子宫内膜组织中的相对表达量(P<0.05,下同).以10-10 mol/L雌二醇和10-8 mol/L孕酮联合处理子宫内膜上皮细胞,USP18基因在子宫内膜上皮细胞中的相对表达量呈上调趋势,且显著高于激素处理前的相对表达量.在猪USP18基因CDS序列953 bp处存在1个SNP位点(T/G错义突变),其不同基因型与产仔数性状的关联分析结果表明,在经产母猪中,TG基因型母猪产活仔数最多,GG基因型母猪产活仔数最少,且差异显著.[结论]猪USP18基因在附植期子宫内膜中高水平表达,且在子宫内膜上皮细胞中的表达受雌激素和孕激素诱导,表明USP18基因在妊娠早期建立过程中发挥着重要作用.USP18基因在梅山猪和大白猪间的差异表达可能是导致梅山猪产仔数高于大白猪的一个重要因素.     

草菇钙调磷酸酶催化亚基(Vv-CNA)的序列与表达

[目的]分析草菇钙调磷酸酶催化亚基(Vv-CNA)的序列与表达,为进一步探究草菇生长发育及子实体开伞分子调控机理提供参考.[方法]通过生物信息学分析确定Vv-CNA基因的组成及保守结构,将ORF Finder预测的草菇CNA氨基酸序列与从NCBI下载的其他真菌CNA氨基酸序列进行比对,并通过荧光定量PCR检测Vv-CNA基因在草菇不同生长时期的相对表达量.[结果]Vv-CNA基因编码区为2503 bp,包含10个内含子(其中I2、I8、I9和I10存在内含子保留现象),编码610个氨基酸,GenBank登录号KX463514.将Vv-CNA氨基酸序列与动物(人、小鼠)、植物(拟南芥、水稻)和真菌(曲霉、酵母等)的CNA氨基酸序列进行同源比对分析,结果发现Vv-CNA蛋白有3个最保守的结构域,与密褐褶菌(Gloeophyllum trabeum)的亲缘关系最近.Vv-CNA基因在草菇子实体的蛋形期和伸长期高表达,以蛋形期的相对表达量最高.[结论]Vv-CNA基因编码钙调磷酸酶催化亚基,其高表达有利于草菇菌柄的伸长.     

木薯PYL13基因克隆及表达分析

[目的]解析木薯脱落酸(ABA)受体PYR/PYL/RCARs家族基因(MePYL13)在木薯块根采后生理性变质(PPD)过程中的功能作用,为后续探索ABA信号通路在木薯PPD中的功能及作物抗逆育种打下基础.[方法]从木薯品种SC8中克隆MePYL13基因,应用生物信息学分析方法对其编码蛋白的理化性质、亲疏水性、保守结构域及二、三级结构等进行预测,对基因上游启动子进行元件分析,通过亚细胞定位观察MePYL13蛋白在植物细胞中的定位情况,并利用实时荧光定量PCR检测MePYL13基因在木薯PPD过程中的相对表达量.[结果]克隆获得的MePYL13基因编码区(CDS)长度663 bp,编码220个氨基酸,蛋白分子量23.957kD,理论等电点(Ip)为6.74.MePYL13蛋白与巴西橡胶树(XP 021654464.1)PYL家族蛋白的氨基酸序列同源性最高,为91.55%,表明MePYL13蛋白氨基酸序列具有高度保守性.从MePYL13基因启动子鉴定获得与非生物胁迫逆境相关的响应元件,包括厌氧诱导元件(ARE,AAACCA)、光响应元件(ATCT-motif,AATCTAATCC)、干旱MYB元件(MBS,TAACTG)及ABA应答元件(ABRE,AAACAGA)和分生组织表达相关元件(CAT-box,GCCACT)等;MePYL13蛋白在木薯细胞的细胞核和细胞质上均有表达.随着PPD进程的推移,MeP YL13基因相对表达量整体上呈上升趋势,至PPD后期(48 h)其相对表达量是0h时(PPD前)的16倍,即MePYL13基因受木薯块根PPD的显著诱导.[结论]MePYL13基因是PYR/PYL/RCARs家族成员,可能在木薯块根PPD过程中发挥正向调控作用,为培育木薯PPD改良品种提供了潜在基因资源.     

番木瓜环斑病毒融合基因植物表达载体的构建

利用PCR重叠延伸技术（gene splicing by overlap extension,SOE）将番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）Vb株系的外壳蛋白（coat protein,CP）基因和Ys株系的复制酶（replicase protein,RP）基因构建成融合基因VY。同时对常规的SOE法进行了改进,并对改进的SOE的反应体系进行了优化,其中以Pyrobest DNA聚合酶和60℃的退火温度为最佳。将融合基因n’构建在植物表达载体pCAMBIA2300上,测序结果表明,该融合基因的序列与设计相符。融合基因VY植物表达载体的构建,可为进一步获得对PRSV广谱抗性的转基因番木瓜奠定基础。