甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)克隆及其在转基因烟草中的表达特性分析

[目的]克隆甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)并分析其在转基因烟草植株中的表达特性,为研究CIN1基因功能提供参考.[方法]克隆SoCIN1基因,利用基因重组技术构建植物正义表达载体pBI121-SoCIN1,采用叶盘法经农杆菌EHA105介导将其转化烟草品种K346.经抗性筛选和PCR扩增验证后获得转SoCIN1基因烟草植株,采用半定量PCR检测叶片SoCIN1基因的表达量,并测定叶片可溶性糖含量、CIN活性及株高(以野生型烟草为对照).[结果]克隆获得的SoCIN1基因长度为1731 bp,与GenBank已公布的SoCIN1基因(JQ312298)核苷酸序列同源性达100%,并通过构建其植物正义表达载体转化烟草.PCR扩增鉴定结果表明,SoCIN1基因已整合至烟草基因组DNA.对F0和F1代进行转基因烟草连续筛选,获得4个转SoCIN1基因烟草株系(T-1、T-2、T-3和T-4).在4个株系的叶片中均检测到SoCIN1基因的表达,其中以在T-1株系叶片中SoCIN1基因表达量最高,其次是T-3株系,最低的是T-4株系.4个株系叶片的可溶性糖含量、CIN活性及株高均高于野生型烟草,其中CIN活性显著高于野生型烟草(P<0.05,下同),且T-1株系CIN活性高于其他3株系;T-1、T-2和T-3株系叶片可溶性糖含量分别显著高于野生型烟草39.68%、19.95%和31.15%;T-1、T-2、T-3和T-4株系的株高较野生型烟草分别提高了15.57%、2.90%、5.74%和5.22%,但仅T-1株系与野生型烟草存在极显著差异(P<0.01).[结论]转SoCIN1基因烟草叶片过表达SoCIN1基因,能提高烟草的CIN活性和可溶性糖含量,促进植株生长,由此推测该基因在甘蔗生长发育和蔗糖积累过程发挥作用.     

固氮链霉菌Streptomyces chartreusi WZS021接合转移系统的建立及优化

[目的]建立和优化固氮链霉菌Streptomyceschartreusi WZS021(简称菌株WZS021,下同)的接合转移体系,以丰富固氮链霉菌基因片段转移技术.[方法]以大肠杆菌Escherichiacoli ET12567(pUZ8002)为供体菌,携带整合型质粒pSET152的菌株WZS021为受体菌,进行菌株WZS021接合转移.[结果]选择高氏一号培养基为菌株WZS021接合转移培养基,50℃热激10 min,供受比为1:10,涂布20.0 mg/L安普霉素、接合转移12 h后覆盖抗生素,添加MgCl2终浓度为5.0 mmol/L时接合转移效率最高,达3.24×10-6.[结论]通过确定适用于菌株WZS021接合转移条件建立的菌株WZS021遗传转化体系,有助于今后插入标记基因确定该菌的固氮定殖位点及导入外源基因的操作.     

甘蔗△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因转化烟草的抗旱性分析

为了分析甘蔗P5CS(sugrcane△~1-pyrroline-5-carboxylate synthetase gene,SoP5CS)基因的抗旱性能,利用农杆菌介导的叶盘转化法对烟草进行遗传转化,对拷贝数较低的4个转基因株系(T_1、T_4、T_6和T_9)进行抗旱性分析。结果显示:在干旱胁迫下,T_9株系中SoP5CS及其编码的蛋白的相对表达量都是最低的,T_1、T_4、T_6中SoP5CS的相对表达量分别是T_9的9.02、3.93和8.51倍,SoP5CS蛋白则分别是T_9的2.22、3.91和1.36倍;进一步分析发现T_1和T_6叶片脯氨酸和ABA含量相对较高,且4个株系均显著高于对照;MDA含量则是对照显著高于转基因植株,其中T_1的MDA累积量最低;P5CR和P5CS活性在对照和转基因植株间表现不一,在T_1和T_4中,2种酶活性均与对照相当,T_6和T_9则是显著高于对照;对于CAT活性,表现为T_6最高,T_1、T_4、T_9也显著高于对照;对于SOD活性,转基因株系均显著比对照高,其中T_4和T_6的相对较高;转基因株系的叶片相对含水量明显高于对照,叶绿素减少量则低于对照。综合分析发现,T_6株系的抗旱性表现最好,T_1株系较好,表明SoP5CS基因确实具有较强的抗旱功能。     

甘蔗应答黑穗病菌侵染相关酶活性和内源激素含量的变化

[目的]研究不同甘蔗品种与黑穗病菌长期互作过程中相关酶活性及内源激素含量的变化,为甘蔗应答黑穗病菌侵染的抗性机制提供理论依据.[方法]选用抗黑穗病品种桂糖29号和感黑穗病品种崖城71-374,用浸渍法接种黑穗病菌,对照组用无菌水模拟接菌.在接菌后30、60、90和180 d取甘蔗+1位叶为样品,分析几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和过氧化氢酶(CAT)活性及生长素(IAA)、细胞分裂素(CTK)和乙烯(ETH)含量的变化.[结果]在整个侵染期间,两个甘蔗品种叶片的几丁质酶活性、β-1,3-葡聚糖酶活性及IAA、CTK含量呈逐步降低或波动下降趋势,均在接种后180 d达最低值,而CAT活性整体上呈上升趋势,在接种后180 d达最高值;其中抗性品种桂糖29号的β-1,3-葡聚糖酶活性和ETH含量在整个浸染过程均高于感病品种崖城71-374.[结论]甘蔗在不同时期应答黑穗病菌胁迫的生理生化反应不同,感病品种与抗病品种的防御机制可能存在差异.     

固氮细菌DX120E的gfp标记及对不同甘蔗品种的接种效应

[目的]研究固氮菌株DX120E在甘蔗幼苗中的侵染定殖及其对不同甘蔗品种生长生理的影响,为进一步分析该固氮菌与甘蔗的相互作用机制提供参考依据.[方法]以3个甘蔗品种ROC22、B8和GT21为试验材料,将DX120E用gfp基因标记后,以浸根法接种甘蔗,观察其在甘蔗中的侵染定殖情况,分别在接菌后60、90和120 d,调查甘蔗的株高、叶绿素含量及鲜重,并测定氮代谢关键酶活性指标.[结果]获得了稳定表达的DX120E-gfp接合子菌株;接种后第7 d ,在3个甘蔗品种的根部和叶片中均检测出nifH基因表达,片段大小约为360 bp.荧光显微镜观察结果表明,接种后第7 d,固氮菌定殖在甘蔗的根毛区、新生侧根处、根断裂伤口处及叶片横切处.盆栽试验结果表明,接种固氮菌DX120E对3个甘蔗品种有明显促生作用,与不接菌对照相比,接菌后120 d,ROC22、B8和GT21的株高分别增加23%、20%和14%,地上部分鲜重分别增加25%、31%和11%,地下部分鲜重分别增加40%、34%和30%.且3个甘蔗品种叶片的谷氨酰胺合成酶和硝酸还原酶活性总体上高于对照.[结论]采用菌液浸根法接种甘蔗,固氮菌DX120E能在甘蔗根部定殖并向地上部分转移定殖.采用该方法处理甘蔗,对甘蔗有明显的促生效应,但不同品种间存在一定差异.     

转SoSUT5基因甘蔗的生长特性

【目的】研究甘蔗蔗糖转运蛋白So SUT5基因对甘蔗主要农艺性状和相关生理生化特性的影响,为评价转基因甘蔗的生长情况及验证So SUT5基因的功能提供参考。【方法】通过PCR扩增和测序验证6个转So SUT5基因甘蔗品系(T1、T2、T3、T6、T9和T11),以野生型甘蔗B8植株为对照,在苗期、分蘖期、伸长期和成熟期分别测定甘蔗的株高、茎径、叶绿素相对含量和+1叶叶面积,成熟期时测定蔗茎的可溶性糖含量。【结果】通过PCR扩增测序获得6个转So SUT5基因甘蔗品系的目的基因序列,表明导入的So SUT5基因已整合到甘蔗基因组DNA中。除T6外,其他5个转基因甘蔗品系的株高、茎径和+1叶叶面积均高于对照,其中成熟期时5个转基因甘蔗品系的茎径和+1叶叶面积均显著高于对照(P0.05,下同),T1、T2和T9的株高及T1、T2和T11的叶绿素相对含量显著高于对照。成熟期时6个转So SUT5基因甘蔗品系的可溶性总糖含量均高于对照,其中T2、T9和T11的可溶性总糖含量极显著高于对照(P0.01),分别比对照高40.3%、40.3%和33.4%。【结论】So SUT5基因在甘蔗中过表达可促进甘蔗生长,并可提高蔗茎的可溶性总糖含量。由此推测,该基因可能与甘蔗节间糖分积累有关,且对甘蔗生长起促进作用。     

桂糖11号Rubisco基因克隆、原核表达及纯化

[目的]通过原核表达及纯化获得甘蔗1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大、小亚基融合蛋白,为获得符合抗体制备条件的高纯度融合蛋白提供技术支持.[方法]以甘蔗品种桂糖11号(GT11)+1叶为材料,根据NCBI公布的甘蔗Rubisco大、小亚基基因(rbcL和rbcS)的编码域序列(CDS)设计特异性引物,PCR扩增rbcL和rbcS基因的CDS,然后连接至原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒后转入原核细胞(大肠杆菌Rosetta)中诱导表达,用镍亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,并比较分析桂糖11号与其他甘蔗品种在rbcL和rbcS基因的CDS及编码蛋白序列方面的差异.[结果]rbcL和rbcS基因的CDS长度分别为1431和510bp,其中桂糖11号rbcL基因的CDS与Saccharumhybrid cultivar SP80-3280(GenBank登录号AE009947)、Saccharum hybrid cultivar Q155(GenBank登录号KU214867)的一致,桂糖11号rbcS基因的CDS与Saccharum hybrid cultivar GT28(GenBank登录号JN591757)的存在7个碱基差异,但仅有2个氨基酸发生错义突变.RbcL和RbcS融合蛋白以包涵体形式存在原核细胞中,用镍离子亲和层析纯化及超滤浓缩后其浓度均在1.0 mg/mL以上.[结论]从桂糖11号成功克隆Rubisco大亚基和小亚基基因的CDS,大亚基基因的CDS比小亚基的保守性更高,且均可在原核细胞中高度表达,经纯化浓缩获得的高纯度融合蛋白可用于制备Rubisco单克隆抗体.