大豆铁结合蛋白基因在旱稻中的表达及铁含量分析

【目的】尝试利用转基因方法提高旱稻铁含量。【方法】采用基因枪和农杆菌转化法，将水稻胚乳特异表达的谷蛋白基因启动子GluB-1驱动下的大豆铁结合蛋白基因转入2个优良旱稻品种“旱稻297”和“旱稻277”。利用PCR、Southern杂交分析方法验证转化结果。【结果】转基因植株T1代RT-PCR证明，外源基因在种子中特异表达。T1～T3代的PCR检测证明铁结合蛋白基因已经稳定遗传。多数转基因植株T0～T3代种子中铁含量高于未转化植株，最高达到未转化对照的2倍以上。【结论】利用基因枪和农杆菌转化法可将大豆铁结合蛋白基因导入旱稻基因组中，并使转基因稻米铁含量增高。     

大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1的克隆及功能分析

【目的】获得大豆疫霉根腐病抗性相关基因,为培育大豆抗病品种提供理论依据。【方法】在以大豆抗病品种绥农10构建的受疫霉菌诱导后差异表达的cDNA消减文库的基础上,选取文库中一条与其它植物的DR1基因具有较高同源性且上调表达的EST序列。通过RT-PCR方法从绥农10中克隆该基因,并构建到植物表达载体pCAMBIA3301上,以感病品种东农50的子叶节为外植体通过根癌农杆菌介导的方法进行大豆遗传转化。【结果】该基因全长805 bp,开放读码框为471 bp,编码156个氨基酸,在此命名为SDR1。遗传转化获得转基因PCR鉴定阳性植株5株,Real-time PCR检测T1转基因植株较非转基因植株SDR1表达量提高20倍以上的有3株,经Southern杂交分析表明,出现杂交信号的有3株。经离体叶片接种大豆疫霉菌,转基因大豆的抗性较非转基因大豆明显提高。【结论】成功克隆了大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1,并通过对过量表达的大豆转基因植株的抗病性鉴定初步确定了SDR1的抗病功能。     

大豆凝集素和脂肪氧化酶双价RNAi表达载体的构建及其遗传转化

【目的】应用RNA干扰技术,同时抑制大豆凝集素(Soybean agglutinin,SBA)和脂肪氧化酶(Lipoxygenase,Lox)基因在种子中的表达,改良大豆营养品质,为培育优质大豆材料奠定基础。【方法】根据RNAi原理,酶切获得Lox目的片段,构建以除草剂Bar基因为筛选标记、种子特异性启动子P7αP启动SBA和Lox双干扰的pCAMBIA3301-SBA-Lox(pSBA-Lox)干扰表达载体,并通过农杆菌介导法转化大豆(品种为吉农28),采用PCR、Southern杂交和实时荧光定量PCR对转基因植株进行检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定结果表明,双价RNAi植物表达载体pSBA-Lox构建成功。将其转入到大豆中,对转化植株进行PCR、Southern杂交检测,结果显示,外源基因以单拷贝形式整合到植物基因组中,并能遗传给后代。T1代转基因植株的实时荧光定量PCR分析显示,转基因植株中SBA基因和Lox基因在籽粒中的表达量比未转化受体植株均明显降低,SBA基因表达量降低了35.9%~47.2%,Lox基因表达量降低了32.8%~56.1%,而在幼嫩叶片中的表达量相比对照植株变化不大。【结论】获得了大豆凝集素和脂肪氧化酶表达量均明显降低的T1代转基因大豆。     

大豆铁结合蛋白基因在早稻中的表达及铁含量分析

【目的]尝试利用转基因方法提高早稻铁含量。【方法]采用基因枪和农杆菌转化法，将水稻胚乳特异表达的谷蛋白基因启动子GluB-1驱动下的大豆铁结合蛋白基因转入2个优良早稻品种“旱稻297”和“早稻277”。利用PCR、Southern杂交分析方法验证转化结果。【结果】转基因植株T1代RT-PCR证明，外源基因在种子中特异表达。T1～T3代的PCR检测证明铁结合蛋白基因已经稳定遗传。多数转基因植株R～T。代种子中铁含量高于未转化植株，最高达到未转化对照的2倍以上。【结论】利用基因枪和农杆菌转化法可将大豆铁结合蛋白基因导入旱稻基因组中，并使转基因稻米铁含量增高。     

hrpZPsg12转基因烟草及其抗性评价

【目的】将来源于大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)Psg12菌株的hrpZPsg12基因导入烟草"云烟87",对转化植株进行烟草普通花叶病毒(TMV)、烟草马铃薯Y病毒(PVY)和烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)的抗病性鉴定,为培育多抗烟草新品系奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法,将hrpZPsg12基因转入烟草"云烟87"中,对T0和T1代转基因植株进行PCR检测、Southern杂交,并对T1代转基因植株的抗病性进行评价。【结果】hrpZPsg12基因成功转入"云烟87"中,PCR检测表明共获得7株T0代阳性植株、35株T1代阳性植株。对T1代PCR阳性植株进行Southern检测,表明外源目的基因hrpZPsg12已经整合进烟草基因组中,并可在转基因后代植株中稳定遗传。抗病性测定表明,T1代转基因烟草对TMV和PVY表现高抗,对烟草野火病表现中抗。【结论】获得了高抗TMV和PVY及中抗烟草野火病菌的转hrpZPsg12基因植株20和15株。     

转TaDREB3a基因大豆材料抗旱性鉴定

研究通过分子生物学方法证明TaDREB3a基因已整合至大豆基因组中,对T1～T3连续3代大豆植株作筛选鉴定并分析遗传稳定性,初步评价室内和田间抗旱表现。通过除草剂筛选获得T1代135株抗性植株,经PCR检测其中96株扩增出基因目的条带,获得15个阳性TaDREB3a过表达大豆T1代株系;T2代转基因大豆株系经PEG模拟干旱处理和PCR鉴定获得阳性TaDREB3a过表达大豆T2代株系共10个;T3代转基因大豆株系经PCR鉴定、半定量PCR鉴定、Bar基因试纸条检测、Southern blot分析、Western blot分析,获得6个转基因阳性株系,证实TaDREB3a基因已整合于大豆基因组,可转录完整目的mRNA,其中4个株系检测到目的蛋白表达。盆栽干旱试验显示,TaDREB3a过表达可改善转基因大豆干旱条件下生长状况,转基因植株株高和荚数明显优于对照组植株;大田干旱试验结果显示,TaDREB3a过表达株系提高大豆抗旱性、改善干旱条件下地上形态,减少产量损失。     

大豆查尔酮还原酶1基因的克隆及转化

【目的】克隆大豆查尔酮还原酶1(CHR1)基因,以构建的过表达载体pCAMBIA3301-CHR1转化大豆,获得含有CHR1基因的阳性植株,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】以大豆基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆CHR1基因,构建植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,对其进行PCR及双酶切鉴定。采用农杆菌介导法将该载体转入大豆"吉农28"中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,对CHR1基因mRNA相对表达量进行荧光定量PCR检测。【结果】克隆得到的CHR1基因大小为1 100bp。成功构建了植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,将其转化大豆后,通过PCR检测获得T1代转基因大豆植株12株;Southern杂交检测结果显示,CHR1基因以单拷贝形式整合入大豆基因组中;荧光定量PCR检测结果显示,转基因植株的CHR1mRNA相对表达量高于非转基因大豆植株。【结论】成功构建了过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,并获得了CHR1基因表达量高的转基因大豆。     

大豆胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶基因双价RNAi表达载体的改造及转化

【目的】应用RNA干扰技术同时抑制大豆脂肪氧化酶(Lox)和胰蛋白酶抑制剂(KTi)基因的表达,改良大豆品质,培育缺失Lox和KTi的大豆新材料。【方法】应用RNAi原理,以双价RNAi植物表达载体pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi为基础,以植物表达载体pCAMBIA3301的质粒DNA为模板,利用CaMV35S启动子的上游引物和CaMV35S终止子的下游引物,PCR扩增含有除草剂抗性基因bar的整个表达原件,然后将其插入到pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi中,构建以除草剂为筛选标记的双价RNAi表达载体,并通过花粉管通道法转化至大豆吉农18、吉农28和吉农27 3个品种中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交、RT-PCR分子水平检测和除草剂抗性检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定以及测序结果表明,双价RNAi植物表达载体pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar构建成功。将其转入到大豆中,分别获得吉农18、吉农28、吉农27T1代籽粒47,25和86粒,以及T2代转基因植株50株。RT-PCR结果表明,转基因株系中脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂mRNA积累受到明显抑制。【结论】获得了转pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar的T2代转基因大豆。     

转基因玉米的脉冲电泳技术检测及遗传分析

采用脉冲电泳技术将外源Bar基因和 B.t基因转化玉米种胚并直接成苗,对T0代、T1代经除草剂筛选的抗性植株进行PCR检测.结果表明,T1代转基因植株频率明显低于T0代PCR阳性植株率,T0代植株的PCR阳性率与T1代转基因植株频率呈显著正相关(r =0.9874).T1代表现为PCR阳性的植株Southern杂交结果显示脉冲电泳法介导的外源基因在受体中多为单拷贝,且能从T1代遗传到T2代,外源基因在T2代呈典型的孟德尔分离方式.     

转cry1Ab13基因玉米新种质的创制

【目的】构建包含抗鳞翅目害虫基因cry1Ab13的重组植物表达载体,并利用其创制对玉米螟Ostrinia furnacalis具有优良抗性的转基因玉米Zea may L.新种质。【方法】利用同源重组法将cry1Ab13基因连接到表达载体pCAMBIA3300-Bar上,获得以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar。通过农杆菌介导法转化玉米自交系H99幼胚,对再生植株进行逐代除草剂筛选、PCR检测及T2代植株的Southern blotting检测、实时荧光定量PCR检测,并对转基因植株进行田间及室内抗虫性鉴定。【结果】构建了cry1Ab13基因的植物表达载体,转化玉米获得3株高抗玉米螟和1株抗玉米螟的T2代转基因植株。Southern blotting证明cry1Ab13基因已经整合到玉米基因组中,实时荧光定量PCR结果表明cry1Ab13基因已经在玉米植株内表达。抗虫性鉴定结果表明,与对照相比转基因植株对玉米螟的抗性显著提高。【结论】将cry1Ab13基因导入玉米并成功表达,显著提高了转基因玉米对玉米螟的抗性,为抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

1株抑制镰刀菌生长及产生伏马菌素链霉菌的分离和鉴定

【目的】从采自深圳近海红树林泥土中分离筛选到抑制再育镰刀菌生长和产生伏马菌素B1(FB1)的菌株,并对其进行鉴定,为控制食品中真菌毒素污染提供新途径。【方法】采用镰刀菌产毒素试验及生长对峙法,从采自红树林泥土中分离筛选目标菌株;根据菌株形态和培养特征、生理生化特性及16SrDNA序列分析,对目标菌株进行鉴定。【结果】从红树林泥土中分离到1株可抑制再育镰刀菌产生FB1和生长的菌株SZ1-6,初步确定该菌株属于卡伍尔链霉菌。菌株SZ1-6发酵液可显著抑制再育镰刀菌产生FB1,产毒抑制率达67%以上;菌株对再育镰刀菌生长也具有一定的抑制效果。【结论】筛选到1株对再育镰刀菌产FB1和生长均有抑制效果的链霉菌菌株SZ1-6,说明从海洋资源中寻找产抗生素的天然放线菌是可行的。     

沙地植物长柄扁桃抗寒性的研究

【目的】通过试验确定长柄扁桃的抗寒程度,筛选出其抗寒鉴定指标,为长柄扁桃在北方的生产推广区域提供重要理论参考。【方法】以沙地濒危植物长柄扁桃1年生枝条为试验材料,以从美国引进的抗性较强的扁桃品种"先锋"1年生枝条为对照,研究了不同冷冻处理条件下扁桃枝条的相对电导率、超氧化物歧化酶(SOD)活性、游离脯氨酸和丙二醛(MDA)含量,利用Logistic方程计算出2个扁桃品种的低温半致死温度(LT50),并对测定结果进行了抗寒性分析。【结果】长柄扁桃1年生枝条的低温半致死温度(LT50)为-31.05℃,对照品种为-21.03℃,两者的抗寒性差异明显,这与实际观察结果一致。2个扁桃品种的游离脯氨酸和MDA含量均随着处理温度的逐渐降低而呈现上升趋势,耐寒性强的长柄扁桃在低温时能保持较高的SOD活性和游离脯氨酸含量以及较低的MDA含量。说明除相对电导率外,SOD活性、游离脯氨酸和MDA含量在一定程度上也能反映长柄扁桃抗寒性的大小,可作为其抗寒性评价指标。【结论】长柄扁桃可在"先锋"栽培的区域和陕北部分地区顺利越冬,温度可能不是造成其冬季在沙地自然死亡的惟一原因。     

五谷虫蛋白粗提液对牛源致病性Escherichia coli O_1和E.coli O_(78)体外抑菌作用

为研究五谷虫蛋白粗提液对Escherichia coli O_1和E.coli O_(78)的体外抑菌作用,采用试剂盒测定五谷虫粗提液蛋白含量;牛津杯法测定蛋白粗提液对牛源病源性E.coli O_1和E.coli O_(78)的抑菌圈直径;通过二倍稀释法测定蛋白粗提液对2种细菌的最低抑菌浓度(MIC);平板法测定最低杀菌浓度(MBC);酶标比浊法测定粗提液对2种细菌的24h生长曲线、细胞膜通透性以及碱性磷酸酶(AKP)的含量。研究表明:1)五谷虫蛋白粗提液蛋白质量浓度为0.680mg/mL;粗提液对E.coli O_1和E.coli O_(78)的抑菌圈直径分别为(25.09±0.62)和(20.96±0.48)mm,MIC分别为15.625和31.250mg/mL,MBC为62.5和125mg/mL,传统中药水煎剂和提取缓冲液没有体外抑菌效果。2)粗提液能影响E.coli O_1和E.coli O_(78)的生长曲线,增加细菌细胞膜和细胞壁通透性。由此可见,蛋白粗提液对E.coli O_1和E.coli O_(78)均有体外抑菌效果,且对E.coli O_1的体外抑菌效果优于E.coli O_(78)。     

尖叶胡枝子总黄酮含量测定方法(比色法)的优化

采用NaOH-Al(NO3)3-NaNO2比色法对尖叶胡枝子的总黄酮含量进行测定。以芦丁为对照品,检测波长为510nm。结果表明,在0~1g·L-1范围内,芦丁吸光度与其质量浓度呈良好的线性关系(r2=0.999 8),对测定方法的稳定性、精密度、重现性及回收率进行试验,相对标准偏差(RSD)为0.199%~1.023%。根据拟合的线性回归方程对尖叶胡枝子不同提取液中总黄酮进行定量,所得测定数据分别为0.029 0、0.024 0、0.315 0、0.379 0和0.012 4g·L-1。该方法简便、快速、准确,可作为尖叶胡枝子中总黄酮含量的测定方法。     

阿特拉津胁迫下外源磷对香蒲磷吸收和抗氧化酶系统的影响

为探明阿特拉津和外源磷对水生植物磷吸收及抗氧化酶系统影响的复合效应,选取典型的湿地植物香蒲(Typha angustifolia L.)为供试植物,采用水培实验,研究阿特拉津(0、0.5、2 mg·L~(-1)和5 mg·L~(-1))和外源磷(0.5、4 mg·L~(-1)和10 mg·L~(-1))交互作用对香蒲体内磷含量、叶绿素含量以及抗氧化酶活性的影响。结果表明:阿特拉津胁迫下,外源磷相较于对照显著提高了香蒲地上(310.47%)和地下部(165.81%)平均磷含量;中低浓度(0.5 mg·L~(-1)与2 mg·L~(-1))阿特拉津处理下,随着外源磷浓度增加,叶绿素a、叶绿素b含量升高,过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽(GSH)活性增强,丙二醛(MDA)含量则显著降低;高浓度阿特拉津(5 mg·L~(-1))处理下,外源磷降低了叶绿素a、叶绿素b含量及超氧化物歧化酶(SOD)、CAT、GSH活性,却提高了MDA的积累。因此,中低浓度阿特拉津胁迫下外源磷能够提高香蒲体内磷含量、叶绿素含量及抗氧化酶系统活性,而高浓度阿特拉津与外源磷的复合效应表现为协同抑制,研究结果有助于理解阿特拉津胁迫与外源磷交互作用下水生植物响应的生理生化机制。     

翘嘴红鲌（♀）×团头鲂（♂）杂种F1的SRAP标记分析

相关序列扩增多态性(sequencerelated amplified polymorphism,SRAP)是基于PCR技术的一种新型分子标记技术。运用SRAP分子标记技术对翘嘴红鲌（♀）×团头鲂（♂）杂种F₁及其父母本的遗传变异进行了分析。从24个SRAP引物组合中筛选到21个多态性引物组合,共得到136条清晰稳定的扩增位点,其中124个扩增位点具有多态性,平均每个引物组合产生6.48个多态性条带,显示了较高的多态性比率。杂种F1的SRAP扩增条带均能在亲本中找到,未发现杂种F1特异性条带,直观显示杂种F₁确为杂交种。翘嘴红鲌、团头鲂及其杂种F₁的Nei’s多样性指数（H）分别为0.194 5、0.172 2、0.198 4,Shannon’s信息指数（I）分别为0.289 1、0.254 7、0.290 5,表明杂种F1比其父母本有更高的遗传多样性水平。翘嘴红鲌与团头鲂间的遗传距离为0.420 6,两者基因组有较大的相似性。杂种F₁与翘嘴红鲌和团头鲂间的遗传相似性分别为0.767 1、0.751 2,两者相差甚微,显示杂种F₁与双亲的相似程度没有明显的倾向性,表明属间杂种F₁整合了翘嘴红鲌和团头鲂的遗传信息。研究结果也表明SRAP分子标记技术是比较稳定可靠的标记系统,可有效用于鱼类杂种真实性的鉴定和遗传变异分析。     

Comparative analysis of genomes in Oryza sativa, O. officinalis and O. meyeriana with C 0 t-1 DNA and genomic DNA of cultivated rice

Fluorescence in situ hybridization (FISH) and comparative genomic hybridization (CGH) were applied to somatic chromosome preparations of Oryza sativa, O. officinalis and O. meyeriana with labeled probes of C ₀ t-1 DNA and genomic DNA from cultivated rice. The coverage percentage (%) and size (Mb) of C ₀ t-1 DNA in O. sativa, O. officinalis and O. meyeriana were 47.1 ± 0.16, 38.61 ± 0.13, 44.38 ± 0.13 and 212.33 ± 1.21, 269.42 ± 0.89, 532.56 ± 1.68, respectively. The coverage percentage and size of probe signals with genomic DNA from O. sativa in O. officinalis and O. meyeriana were 91.0%, 93.6% and 634 Mb, 1 123 Mb respectively, in which there were 365 and 591 Mb in O. officinalis and O. meyeriana which came from O. sativa genomic DNA not from repetitive sequences of O. sativa, and the uncovered genome size in O. officinalis and O. meyeriana was 64 and 78 Mb, respectively. In addition, karyotype analysis was conducted based on the signal bands of C ₀ t-1 DNA in O. sativa, O. officinalis and O. meyeriana. The results showed that highly and moderately repetitive sequences in Oryza genus were conserved as the functional genes during the evolution process. The repetitive sequence reduplication might be one of the important causes of genome enlargement in O. officinalis and O. meyeriana; the O. officinalis genome enlarged more slowly compared with O. meyeriana. Based on the above results, it is concluded that O. officinalis and O. meyeriana formed by reduplication, rearrangement and gene selective loss during the evolution process. Translated from Scientia Agricultura Sinica, 2006, 39(6): 1083–1090 [译自: 中国农业科学]     

5种设施农业常用农药对2种熊蜂的毒效评价

为合理保护和利用熊蜂,采用连续饲喂法测定5种常用农药对小峰熊蜂和红光熊蜂的毒力。小峰熊蜂48 h生物测定结果表明,毒死蜱的毒性最强,其LC₅₀值为1.982 mg/L,其次为代森锰锌(3.167 mg/L)、百菌清(263.319 mg/L)、氟虫脲(297.480 mg/L)和甲基托布津(745.357 mg/L)。红光熊蜂48 h生物测定结果表明,毒力最强的是代森锰锌(1.039 mg/L),其次是氟虫脲(137.780 mg/L)、毒死蜱(177.992 mg/L)和百菌清(224.256 mg/L),甲基托布津(707.915 mg/L)最低。借鉴中国现行农药对蜜蜂的毒力划分标准可知：代森锰锌对两种熊蜂均为高毒;毒死蜱对小峰熊蜂为高毒,对红光熊蜂为中等毒性;氟虫脲对红光熊蜂为中等毒性,其他药剂对两种熊蜂均为低毒。这说明不同药剂对不同熊蜂的毒力并不一致,杀虫剂对熊蜂的急性毒性不一定强于杀菌剂。     

蝴蝶兰与火焰兰远缘杂交育种初探

选择蝴蝶兰(Phalaenopsis)与火焰兰(Renanthera)进行正反远缘杂交,共计杂交组合48个,获得441株杂交后代。结果表明:1)在48个杂交组合中,有30个组合座果,仅有6个组合的种子在诱导培养基M1、M2和M3上萌发,其中M2的诱导时间最短,而多数组合能座果但蒴果内棉絮状、无种子,可能是胚发育不全或败育所致;2)火焰兰与二倍体、非整倍体蝴蝶兰杂交共有20个组合座果,但蒴果内均没有种子;与四倍体蝴蝶兰属间正反杂交有10个组合座果,其中6个经无菌播种后均获得杂种后代。因此,选择大花型四倍体蝴蝶兰与火焰兰属间杂交较易成功;3)采用组织培养无菌播种的方法进行胚抢救是提高远缘杂交成功率的有效手段,蝴蝶兰与火焰兰属间杂交成功的6个组合经无菌播种后均获得杂种后代;4)杂种F_1代遗传了双亲的特性,植株及开花性状总体上趋向蝴蝶兰,但叶端明显比蝴蝶兰下弯,叶片革质和较硬。     

草莓枯萎病菌的分离鉴定及防治药剂筛选

草莓枯萎病是目前危害北京草莓产业的主要病害,为筛选出安全有效的杀菌剂,采用组织分离法从北京昌平地区采集的草莓枯萎病株中分离到引起草莓枯萎病的病原菌。经形态学和分子生物学手段鉴定该病原菌为尖孢镰刀菌草莓专化型(Fusarium oxysporum Schlecht f.sp.fragariae Winks et Williams)。采用菌丝生长速率法对14种杀菌剂进行筛选,其中,206.7g/L噁酮·氟硅唑、寡雄腐霉、φ=25%腈菌唑、w=60%嘧菌酯、w=70%代森锰锌、w=75%百菌清、w=50%异菌脲7种杀菌剂对草莓枯萎病具有显著的抑菌效果,其EC50值分别为0.003、0.63、0.73、5.91、8.90、78.54、229.09mg/L;另外,206.7g/L噁酮·氟硅唑、寡雄腐霉、w=70%代森锰锌和w=75%百菌清4种杀菌剂的药效可持续96h以上,其他3种药剂处理48h后对草莓枯萎病的抑制效果显著下降。因此,206.7g/L噁酮·氟硅唑、寡雄腐霉、w=70%代森锰锌和w=75%百菌清是草莓枯萎病防治的优先选择。