大豆胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶基因双价RNAi表达载体的改造及转化

【目的】应用RNA干扰技术同时抑制大豆脂肪氧化酶(Lox)和胰蛋白酶抑制剂(KTi)基因的表达,改良大豆品质,培育缺失Lox和KTi的大豆新材料。【方法】应用RNAi原理,以双价RNAi植物表达载体pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi为基础,以植物表达载体pCAMBIA3301的质粒DNA为模板,利用CaMV35S启动子的上游引物和CaMV35S终止子的下游引物,PCR扩增含有除草剂抗性基因bar的整个表达原件,然后将其插入到pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi中,构建以除草剂为筛选标记的双价RNAi表达载体,并通过花粉管通道法转化至大豆吉农18、吉农28和吉农27 3个品种中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交、RT-PCR分子水平检测和除草剂抗性检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定以及测序结果表明,双价RNAi植物表达载体pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar构建成功。将其转入到大豆中,分别获得吉农18、吉农28、吉农27T1代籽粒47,25和86粒,以及T2代转基因植株50株。RT-PCR结果表明,转基因株系中脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂mRNA积累受到明显抑制。【结论】获得了转pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar的T2代转基因大豆。     

应用RNA干扰技术创造低脂肪氧化酶活性大豆新种质

 【目的】通过RNA干扰技术抑制大豆籽粒中脂肪氧化酶基因表达,改良大豆品质,创造优良大豆新种质,探索大豆品质育种新途径。【方法】采用RT-PCR技术克隆大豆籽粒脂肪氧化酶基因（Lx1、Lx2、Lx3）核心保守序列357 bp片段,通过重组PCR构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体,利用花粉管通道法转化大豆品种吉农18。【结果】获得了12个转基因株系,其中10个株系发生明显变化,SDS-PAGE电泳和脂肪氧化酶活性测定表明转基因植株籽粒中脂肪氧化酶活性明显降低,平均减低64.2%;经近红外谷物分析仪测定,转基因植株脂肪含量平均提高0.8%～1.5%,总蛋白含量降低1.2%～3.0%;RT-PCR结果表明转基因株系中脂肪氧化酶mRNA积累受到明显抑制。转基因植株2代及3代检测结果表明,转基因植株脂肪氧化酶活性均明显降低,脂肪含量均有所提高。【结论】应用RNA干扰技术可有效的抑制大豆籽粒中脂肪氧化酶基因表达,降低脂肪氧化酶活性,提高大豆油份含量,改良大豆品质,创造优良大豆种质。     

β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体的构建

【目的】构建β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因具有功能性间隔序列的发夹结构（Intron-hairpin RNAi,ihp-RNA）的RNA干扰(ihp-RNAi)表达载体并转化大豆,为通过RNA干扰技术改良大豆的营养品质奠定基础。【方法】以大豆总RNA反转录获得的cDNA为模板,通过PCR扩增克隆了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的核心保守序列(400 bp),并将该片段的反义和正义片段插入到重组植物表达载体p3301P的种子特异性启动子7αp下游,将功能性间隔序列intron-SSR插入反义片段与正义片段之间,构建α′-亚基基因ihp-RNAi安全型表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,并进行PCR及双酶切鉴定。利用农杆菌介导法将带有p3301-PFNZ-α′-BADH 的菌株转化“吉农27”大豆植株,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,并对转基因植株α′-亚基基因的表达量进行RT-PCR。【结果】成功构建了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,利用农杆菌介导法转化大豆得到7株阳性转化植株;Southern杂交结果显示,外源基因以1～2个拷贝整合于大豆基因组中;RT-PCR检测表明,β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的表达被明显抑制。【结论】成功构建了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体,获得了α′-亚基基因被明显抑制的转基因大豆植株,为应用基因工程技术进行大豆品质改良奠定了基础。     

大豆查尔酮还原酶1基因的克隆及转化

【目的】克隆大豆查尔酮还原酶1(CHR1)基因,以构建的过表达载体pCAMBIA3301-CHR1转化大豆,获得含有CHR1基因的阳性植株,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】以大豆基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆CHR1基因,构建植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,对其进行PCR及双酶切鉴定。采用农杆菌介导法将该载体转入大豆"吉农28"中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,对CHR1基因mRNA相对表达量进行荧光定量PCR检测。【结果】克隆得到的CHR1基因大小为1 100bp。成功构建了植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,将其转化大豆后,通过PCR检测获得T1代转基因大豆植株12株;Southern杂交检测结果显示,CHR1基因以单拷贝形式整合入大豆基因组中;荧光定量PCR检测结果显示,转基因植株的CHR1mRNA相对表达量高于非转基因大豆植株。【结论】成功构建了过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,并获得了CHR1基因表达量高的转基因大豆。     

油菜基因BnWRI1的克隆及RNAi对种子含油量的影响

 【目的】阐明油菜基因BnWRI1对其种子含油量的影响。【方法】采用RT-PCR技术从油菜中克隆到BnWRI1基因编码区内384 bp的片段,将该片段正反向插入干扰载体pGΩ4ARi中,构建成RNAi表达载体pGΩ4ARi-WRI1,通过花粉管通道法将其转入油菜受体品种中双9号中,【结果】获得3棵转基因植株,PCR扩增和基因组Southern杂交证实外源片段已整合在受体油菜基因组中。利用半定量RT-PCR和改进的索氏提取法分别检测转基因T1代植株的BnWRI1基因表达量和种子含油量,结果表明：与非转基因对照相比,转基因植株的BnWRI1基因均受抑制,种子含油量有所降低。【结论】采用RNAi技术可使油菜内源基因BnWRI1沉默,表明油菜基因BnWRI1能有效调控种子含油量。     

大豆铁结合蛋白基因在旱稻中的表达及铁含量分析

【目的】尝试利用转基因方法提高旱稻铁含量。【方法】采用基因枪和农杆菌转化法，将水稻胚乳特异表达的谷蛋白基因启动子GluB-1驱动下的大豆铁结合蛋白基因转入2个优良旱稻品种“旱稻297”和“旱稻277”。利用PCR、Southern杂交分析方法验证转化结果。【结果】转基因植株T1代RT-PCR证明，外源基因在种子中特异表达。T1～T3代的PCR检测证明铁结合蛋白基因已经稳定遗传。多数转基因植株T0～T3代种子中铁含量高于未转化植株，最高达到未转化对照的2倍以上。【结论】利用基因枪和农杆菌转化法可将大豆铁结合蛋白基因导入旱稻基因组中，并使转基因稻米铁含量增高。     

大豆铁结合蛋白基因在早稻中的表达及铁含量分析

【目的]尝试利用转基因方法提高早稻铁含量。【方法]采用基因枪和农杆菌转化法，将水稻胚乳特异表达的谷蛋白基因启动子GluB-1驱动下的大豆铁结合蛋白基因转入2个优良早稻品种“旱稻297”和“早稻277”。利用PCR、Southern杂交分析方法验证转化结果。【结果】转基因植株T1代RT-PCR证明，外源基因在种子中特异表达。T1～T3代的PCR检测证明铁结合蛋白基因已经稳定遗传。多数转基因植株R～T。代种子中铁含量高于未转化植株，最高达到未转化对照的2倍以上。【结论】利用基因枪和农杆菌转化法可将大豆铁结合蛋白基因导入旱稻基因组中，并使转基因稻米铁含量增高。     

基于花粉介导法转化的玉米自交系抗病植株的获得

【研究目的】将几丁质酶基因导入玉米自交系,获得抗玉米丝黑穗病的转基因植株。【方法】采用花粉介导法进行转化,获得的种子及后代植株检测方法包括：潮霉素抗性筛选、PCR扩增、Southern blot杂交分析以及田间抗病鉴定。【结果】通过转化获得种子43粒,对种子进行潮霉素抗性筛选得到9株抗潮霉素植株;经PCR检测,Southern blot杂交分析得到5株转基因植株。田间抗病鉴定结果显示,转基因植株或株系的丝黑穗病抗性提高1～2级。【结论】花粉介导法转化玉米自交系是获得抗病育种材料的一条快捷、有效的途径。     

大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1的克隆及功能分析

【目的】获得大豆疫霉根腐病抗性相关基因,为培育大豆抗病品种提供理论依据。【方法】在以大豆抗病品种绥农10构建的受疫霉菌诱导后差异表达的cDNA消减文库的基础上,选取文库中一条与其它植物的DR1基因具有较高同源性且上调表达的EST序列。通过RT-PCR方法从绥农10中克隆该基因,并构建到植物表达载体pCAMBIA3301上,以感病品种东农50的子叶节为外植体通过根癌农杆菌介导的方法进行大豆遗传转化。【结果】该基因全长805 bp,开放读码框为471 bp,编码156个氨基酸,在此命名为SDR1。遗传转化获得转基因PCR鉴定阳性植株5株,Real-time PCR检测T1转基因植株较非转基因植株SDR1表达量提高20倍以上的有3株,经Southern杂交分析表明,出现杂交信号的有3株。经离体叶片接种大豆疫霉菌,转基因大豆的抗性较非转基因大豆明显提高。【结论】成功克隆了大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1,并通过对过量表达的大豆转基因植株的抗病性鉴定初步确定了SDR1的抗病功能。     

转hrpZpsta抗病基因大豆的研究

【目的】将具有广谱抗病性的hrpZpsta基因导入大豆,为培育抗灰斑病的转基因大豆新品系奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法,以大豆子叶节为受体,将具有广谱抗性的hrpZpsta基因转入大豆品种"吉林30"中,以耐盐基因badh作为筛选标记性基因,经过抗性筛选,对转基因植株进行PCR检测、Southern杂交和RT-PCR检测分析。【结果】确定的NaCl筛选浓度为200mmol/L。对T1、T2和T3代转基因植株进行PCR检测,得到T1代阳性植株30株,T2代45株,T3代284株,说明外源hrpZpsta基因在转基因后代中能够遗传。Southern杂交结果表明,外源目的基因hrpZpsta已经整合进大豆基因组中,且整合位点不尽相同。RT-PCR结果表明,hrpZpsta基因在受体大豆中获得表达。【结论】获得了hrpZpsta基因遗传表达的T3代转基因大豆株系。     

几种豆制品中异黄酮含量的测定和分析

选取超市出售的几种豆制品,测定其异黄酮含量,了解豆制品中异黄酮的基本情况。结果表明,从豆制品干物质分析,豆腐丝中异黄酮含量最高、其次是内酯豆腐,再者为北豆腐,豆腐干较少,豆腐皮和豆腐泡依次更少,总体在129.19~770.99μg/g之间。豆制品的制作工艺可能是造成异黄酮含量差异的原因之一。多数豆制品中染料木素含量高出大豆苷元含量数倍,推测大豆苷元在加工过程中,比染料木素更容易损失。     

大豆品种抗病虫性评价及多抗性抗源筛选

通过人工接菌和田间自然鉴定的方法,对大豆食心虫、大豆蚜和大豆菌核病进行了品种抗性鉴定。从92个品种和品系中,鉴定出高抗大豆食心虫6个,抗16个,中抗36个,感虫34个。从112个品种(系)中,鉴定出高抗大豆菌核病1个,抗12个,中抗17个,感57个,高感25个。从34个初选品种(系)中,鉴定出中抗大豆蚜12个,感22个。综合选出抗2虫1病、抗倒伏及高产的多抗品种6个。     

我国大豆产业回顾、现状与发展对策

新中国成立以来,我国逐渐由传统的大豆出口大国转变为净进口国,继而转变为世界上最大的进口国,大豆产业发展道路曲折。目前,国内大豆消费量持续快速增长,食用和压榨需求强劲,这与大豆生产不景气形成了鲜明对比。针对我国大豆产业面临的机遇和挑战,我国应充分利用国产大豆的非转基因优势,依靠政策支持和科技支撑提高国内大豆综合生产能力和综合竞争力,重新振兴我国大豆产业。     

大豆多肽研究与开发:现状·问题·建议

阐述了大豆多肽的特性和应用,分析了大豆多肽的研究现状和进展,针对大豆多肽在研究和开发方面存在的问题,提出了大豆多肽的研究与开发建议。     

大豆与早熟马铃薯间作防治大豆蚜虫初探

为探索出安全有效地防控大豆蚜虫的方法,试验共设6个处理,各处理不喷施任何杀虫剂,研究了不同间作比例对大豆蚜虫数量及大豆产量的影响。结果表明：大豆与早熟马铃薯以8：8比例间作对大豆蚜具有良好的防控效果且增产14．2％,其产量极显著高于其它处理。     

黑河地区大豆重茬种植存在的问题及解决途迳

大豆重茬造成的危害,一直是大豆生产中的主要问题。大豆重茬造成大豆病虫害加重,土壤养分偏耗,土壤中有益微生物种群数量减少,土壤环境恶化,导致大豆产量和商品质量下降,严重影响广大农民的经济效益。     

大豆孢囊线虫病研究进展及其抗病育种展望

综述了国内外大豆孢囊线虫的分布与危害、寄主范围、抗源筛选与利用、生化抗性机制;论述了研究该病的意义。在综述了抗病育种进展的同时,也指出了抗病育种中存在的问题;指出注意综合农艺性状改进,合理组配杂交,加强抗性鉴定,注重抗病性持久性等问题;还提出了深化抗病分子研究,开展基因转移和分子辅助育种等抗病育种工作的建议。     

几丁质酶活性与大豆对胞囊线虫抗性的关系

为了明确几丁质酶在大豆抗大豆胞囊线虫中的作用,测定了不同抗性大豆品种被大豆胞囊线虫侵染前后以及供试诱导剂诱导被大豆胞囊线虫侵染后不同抗性大豆品种根内几丁质酶活性变化。结果表明,正常生长情况下,不同抗性大豆品种根内几丁质酶活性无明显差异。接种大豆胞囊线虫后,无论是抗病品种还是感病品种几丁质酶活性均增高。经过几丁质、壳聚糖和低聚糖诱导处理大豆胞囊线虫侵染的大豆后,均能在一定程度上诱导几丁质酶活性进一步增强,并随着时间的延长,酶活性表现出一定的消长趋势;与其他两个诱导剂处理相比,几丁质诱导处理大豆后几丁质酶活性高峰提前,酶活性增加幅度大。     

宝清县大豆主栽品种及栽培技术

在介绍宝清县大豆主栽品种合丰47、垦丰16、合丰42、合丰55,合丰50、黑农44、黑农46和合丰56的产量表现的基础土,进一步阐述了宝清县垄三栽培、小垄窄行密植和大垄窄行密植3种大豆高产栽培模式及其选地与整地、平衡施肥、除草和病虫防治等田间管理措施,以期为大豆优质高产栽培提供理依据.     

大豆黄浆水处理过程中超滤膜的选择

通过实验研究了不同截留分子量和膜材料的超滤膜在超滤大豆黄浆水时的渗透通量、膜衰减系数、蛋白质截留率和总糖透过率,结果表明:PS-10膜是分离大豆黄浆水的适宜用膜。