番木瓜CpTIFY10A-like基因克隆及表达分析

[目的]克隆番木瓜CpTIFY10A-like基因序列,并分析其表达特性,为探索该基因功能和抗番木瓜环斑病毒(PRSV)分子机制提供理论依据.[方法]结合前期研究的抗PRSV转录组数据,利用RACE对上调表达基因Cp-TIFY10A-like进行克隆,获得该基因cDNA全长序列,分析其编码区序列(CDS)及进行生物信息学分析.利用已鉴定的PRSV对3月龄番木瓜植株进行不同处理,以感染PRSV且出现病症的植株(CK+)、1.0 mL/L禾甲安(CTS-N)灌施感染PRSV且出现病症的植株(B)为处理组,以清水灌施(不添加禾甲安)不感染PRSV的植株(CK-)为对照组,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同处理下PRSV基因和CpTIFY10A-like基因在番木瓜叶片中的表达情况.最后将CpTIFY10A-like基因CDS序列连接至pET28a-sumo载体上构建原核表达载体,转化Rosetta(DE3)感受态细胞,通过不同浓度IPTG诱导蛋白表达,利用SDS-PAGE电泳检测原核表达情况.[结果]CpTIFY10A-like基因全长为1352 bp,CDS序列为822 bp,编码273个氨基酸残基;其编码蛋白理论等电点(pI)9.23,不稳定系数62.97,亲水性平均系数-0.458,属于不稳定的亲水性碱性蛋白,定位在细胞核上,其二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,同时含有少量的β-折叠和延伸链.CpTIFY10A-like蛋白与酸枣和白梨TIFY蛋白的氨基酸序列相似性较高,均含有特定的TIFY结构域,属于TIFY蛋白家族,三者在系统发育进化树上聚在同一分支,表明亲缘关系较近.不同处理的番木瓜叶片中,PRSV基因的相对表达量排序为CK+(1.02)>B(0.39)>CK-(0),CpTIFY10A-like基因的相对表达量排序为B(53.12)>CK+(1.15)>CK-(1.02),且CpTIFY10A-like基因在经禾甲安处理的感染PRSV番木瓜叶片中相对表达量显著升高(P<0.05,下同),而PRSV基因的相对表达量显著降低.CpTIFY10A-like基因在原核细胞中表达蛋白的分子量与理论分子量(29.36 kD)相符,且不同浓度IPTG诱导下,IPTG浓度越高,蛋白表达量越多,表明该基因在原核细胞中成功表达.[结论]禾甲安可诱导CpTIFY10A-like基因高效表达,进而通过茉莉酸通路起调节作用以抵抗PRSV感染,即CpTIFY10A-like基因在番木瓜抗PRSV过程中发挥重要调控作用.     

假地豆响应缺磷胁迫的代谢衍生物分析

为探究假地豆（Desmodium heterocarpon）对缺磷胁迫的生理和代谢响应,本研究通过水培试验,分析了正常供磷（+P处理）和缺磷（-P处理）对假地豆生长及代谢物积累的影响。结果表明：缺磷胁迫降低了假地豆地上部干重和磷含量,但促进了根系生长。随后,代谢组共检测到假地豆叶片和根系的267个代谢物,可被分为12类。其中,叶片和根系的缺磷胁迫差异累积代谢物（DAMs）均为79个。缺磷处理导致假地豆叶片和根系的原花青素、槲皮素及其衍生物的积累显著增加,而2'-脱氧腺苷5'-单磷酸（dAMP）的积累显著减少。此外,缺磷处理使根系的8个有机酸和4个糖及醇类的积累显著增加。综上,假地豆通过促进根系生长和调整代谢物积累来提高对缺磷胁迫的适应性。本研究将为进一步解析假地豆适应缺磷胁迫的机理提供理论参考。     

硝普钠(SNP)对红毛丹采后生理指标的影响

以海南红毛丹"保研7号"为试验材料,分别置于10μmol·L~(-1)、100μmol·L~(-1)、200μmol·L~(-1)的SNP溶液中,对褐变指数、果实硬度等生理指标进行测定,以筛选最适保鲜浓度。结果表明,与对照相比,3种浓度SNP对红毛丹生理指标变化均有明显影响,以浓度200μmol·L~(-1)的SNP处理的保鲜效果最佳。浓度200μmol·L~(-1)的SNP处理可有效延缓果实褐变指数上升,有效延缓果实变软过程,有效延缓果实中丙二醛(MDA)含量增加及可溶性蛋白质蛋白含量下降。其中,贮藏至第7 d时,200μmol·L~(-1)处理的红毛丹可溶性蛋白含量为0.25 mg·g~(-1),较对照高47.2%,而MDA含量活性值为2.18μmol·g~(-1),仅为对照的82.3%。实验表明:浓度200μmol·L~(-1)的SNP溶液处理能较好保持采后红毛丹的各项生理指标,可为红毛丹采后保鲜技术提供理论科学依据和实践指导。     

响应面法优化番木瓜叶总黄酮提取工艺

[目的]利用响应面法优化番木瓜叶总黄酮的超声波辅助提取工艺,为番木瓜叶中黄酮类成分提取及番木瓜叶综合开发利用提供技术支持.[方法]利用超声波提取番木瓜叶片总黄酮,采用氯化铝显色法测定总黄酮含量,选取乙醇体积分数(A)、料液比(B)、超声波时间(C)和超声波温度(D)为试验因素,总黄酮提取率(Y)为响应值,在单因素试验的基础上进行Box-Behnken中心组合试验设计,建立回归方程,优化总黄酮提取工艺.[结果]建立的回归方程:Y=4.54-0.11A+0.29B+0.023C-8.333×10-4D-0.18AB+0.19AC-0.068AD+0.23BC+0.017BD+0.18CD-1.13A2-0.72B2-0.44C2-0.61D2.4个因素对番木瓜叶总黄酮提取率的影响排序为料液比>乙醇体积分数>超声波时间>超声波温度,两因素间的交互作用以料液比与超声波时间的交互作用对总黄酮提取率影响最大,而料液比与超声波温度的交互作用影响最小.最佳提取工艺条件:乙醇体积分数79%、料液比1:72(g/mL)、超声波时间42 min、超声波温度50℃,实际总黄酮提取率为4.15%,与理论预测值(4.18%)接近.[结论]采用响应面法优化超声波辅助提取番木瓜叶总黄酮的工艺条件稳定可行,可在生产实际中推广.