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水稻NBS-LRR类抗稻瘟病蛋白Pik-h的互作蛋白筛选 总被引:1,自引:1,他引:0
【目的】利用酵母双杂交系统,以组成抗稻瘟病基因Pik-h的2个紧密连锁且功能独立的Pikh-1和Pikh-2蛋白为诱饵,在水稻叶片中筛选与之互作的蛋白,以便深入研究抗病基因Pik-h介导的抗病反应途径。【方法】以含抗稻瘟病基因Pik-h的近等基因系IRBL8为材料,取稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193接种12和24 h后的水稻叶片,等量混合后提取总RNA,按照酵母双杂交试剂盒(Make Your Own"MatePlate"Library System)的要求构建水稻叶片靶标c DNA文库。利用快速重组克隆的方法构建p GBKT7-Pikh1和p GBKT7-Pikh2诱饵载体,并分别将它们转化至酵母菌株Y2H Gold,提取细胞总蛋白后利用Western blot检测Pikh1和Pikh2的表达情况,并对这2个诱饵载体自激活和毒性分析后进行酵母双杂交筛选。提取SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His/X-α-Gal筛选平板培养基上呈蓝色的酵母单克隆的质粒,将其分别与对应的诱饵载体共转化酵母菌株Y2H Gold,涂布于筛选平板培养基上进行互作的重复验证,将通过重复验证的质粒测序分析所得的序列比对水稻基因组数据库以确定目的基因,并对这些基因进行gene ontology(GO)注释分析以确定其分子功能、生物过程及细胞组成。【结果】靶标c DNA文库的库容量约为2.2×10~6,插入片段长度均大于400 bp,表明水稻c DNA文库质量高。诱饵载体p GBKT7-Pikh1和p GBKT7-Pikh2均能在酵母细胞中正确表达出对应的Pikh1及Pikh2蛋白,无自激活活性而且对酵母无毒性作用,符合文库筛选的要求。利用含有诱饵载体的酵母菌株Y2H Gold与靶标文库菌株Y187结合(Mating)的方式筛选,获得13个与Pikh-1相互作用的蛋白、5个与Pikh-2相互作用的蛋白,其中有2个与Pikh-1及Pikh-2同时存在相互作用。这些蛋白包括4个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的(辅)转录因子、3个信号蛋白、4个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有U-BOX结构域的蛋白及4个未知功能蛋白。【结论】成功构建了适宜于研究抗病基因(R基因)介导反应途径的酵母双杂交c DNA文库,筛选出Pik-h的互作蛋白,为进一步研究Pik-h或其他抗稻瘟病基因介导的抗病机制打下了基础。 相似文献
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CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑,为作物的遗传育种提供了新的方向。以感病水稻品种丽江为材料,抗病基因OsCOL9为靶基因,探索该系统对水稻内源基因定点编辑效率以及获得有研究意义的突变体。OsCOL9基因CDS序列全长1 266 bp,编码一个422 aa蛋白,分子量大小约为45.6 k Da,蛋白质结构的N端含有B-box结构域,C端含有CCT(CONSTANS、CONSTANS-Like、TOC1)结构域。设计4个长20 nt的guide RNAs(gRNAs)靶点,靶向编辑OsCOL9基因的CDS起始区域以及外显子的末端,分别由U3、U6a、U6b以及U6c启动子驱动,提取T1转基因植株的基因组DNA并对编辑位点附近的DNA片段进行序列分析。结果表明,T1材料中OsCOL9的碱基缺失数最多可达59 bp,突变次数最多可达11次,取得较好的基因编辑效果。同时本试验出现了脱靶效应,因此着重探讨了降低脱靶效应的方法。由于CRISPR/Cas9系统在进行基因编辑时没有外源基因的导入,加上该技术的快捷、简便,对生物技术与传统育种的结合具有重要实践意义。 相似文献
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水稻叶鞘原生质体转化体系的构建及Pik-H4和AvrPik-H4蛋白的瞬时表达 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】探索水稻叶鞘原生质体最佳游离时间以及转化时间,提高瞬时表达效率,在蛋白水平对目的基因进行检测且大批量表达。探索该系统表达抗稻瘟病蛋白Pik1-H4、Pik2-H4及无毒蛋白Avr Pik-H4的可行性,对目的基因的功能进行分析。【方法】以高抗稻瘟病品种H4及对照品种中二软占作为试验材料,利用1/2 MS培养基种植水稻幼苗25℃恒温培养7—10 d。利用纤维素酶及离析酶对水稻叶鞘进行酶解,血球计数板分别统计游离1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12 h的细胞数目获得最佳的酶解时间。将目标基因Pik1-H4、Pik2-H4及Avr Pik-H4分别与GFP融合,构建瞬时表达载体,利用PEG介导转入水稻叶鞘原生质体。设置转化10、12、14、16、18、20、22和24 h,分别提取细胞总RNA,UBQ管家基因为对照,设计GFP特异性扩增引物,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测GFP的相对表达量,探索最佳的转化时间。通过激光共聚焦扫描显微镜对目标基因进行亚细胞定位观察,推测基因功能。提取细胞总蛋白,以Anti-GFP为一抗用Western blot对目标蛋白表达进行验证。【结果】相对室温土壤栽培,营养丰富且均衡的1/2 MS培养基恒温种植的水稻幼苗质量更优质,活力更高。游离时间的长短对游离效率影响较大,游离的最佳时间为4—6 h,在3—4 h细胞游离数目增长速度最快,4—6 h细胞数量趋于平稳,6 h以后细胞总量呈现下降趋势,特别是7 h以后,显微下细胞碎片增多,细胞死亡速度加快。检测GFP的相对表达量,获得最佳转化时间为14—16 h,16 h达到最高值,之后逐渐下降。随着时间的推移,荧光显微镜下观察到GFP蛋白发出的荧光逐渐淬灭。亚细胞定位观察发现Avr Pik-H4蛋白主要被定位于水稻细胞膜上,初步推测是一种膜蛋白,通过某种形式运输到宿主细胞作为激发子触发一系列反应。Pik-H4是高效广谱抗稻瘟病基因,分为Pik1-H4和Pik2-H4两个部分,Pik1-H4主要定位在内质网,Pik2-H4主要定位在质体,从定位结果初步推定Pik1-H4可能主要参与Avr Pik-H4蛋白的识别反应,Pik2-H4主要起到调控下游抗病的作用。Western blot结果显示目标蛋白表达成功,分子大小正确。Pik1-H4和Avr Pik-H4的表达量高于Pik2-H4,说明分子量的大小不是影响转化效率的关键因素。【结论】水稻叶鞘原生质体瞬时表达系统具有高效快速的特点,通过对游离及转化时间的探索为水稻瞬时表达体系的广泛实践应用提供参考。目标基因的成功表达为Pik-H4与无毒蛋白互作机制的研究提供了有价值的理论依据。 相似文献
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Pik2-H4 是从水稻高抗稻瘟病株系H4 中克隆的广谱型抗稻瘟病基因。Pik2-H4 基因的CDS 全长序列
3066 bp,与日本晴中的等位基因相比,其序列存在较大差异。Pik2-H4 属于NBS-LRR 类基因,其蛋白序列含有NBARC
结构域及富亮氨酸重复序列。采用酵母双杂交系统,以Pik2-H4 蛋白为诱饵从水稻cDNA 表达文库中钓取互作
蛋白质,并成功筛选到3 个与Pik2-H4 有相互作用的蛋白质(LOC-Os08g39300、LOC-Os03g25960、LOC-Os09g29130)。
本研究结果有助于进一步了解由Pik2-H4 介导的水稻抗稻瘟病反应机理。 相似文献
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MTL基因是玉米中控制单倍体诱导性状的关键基因,该基因在作物中的功能高度保守。OsMATL是MTL在水稻中的同源基因,已有研究证实该基因的突变可以诱导水稻单倍体产生,但不同遗传背景下,OsMATL基因的突变效应有待明确。本研究以日本晴(粳稻)和华航48(籼稻)为材料,利用CRISPR/Cas9技术对OsMATL基因启动子区和编码区的不同位点进行编辑,成功获得OsMATL基因不同遗传背景系列突变体。分析了不同突变位点对结实率的影响,发现OsMATL基因编码区突变后结实率为2%~15%,且存在不同类型的败育籽粒,而启动子区域的大片段缺失对结实率没有显著影响;此外,籼稻背景突变体的结实率高于粳稻突变体。本研究创制的不同类型OsMATL突变体为进一步研究水稻孤雌生殖单倍体诱导的机制提供了基础材料。 相似文献
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AT-hook基因是能够编码与双链DNA小沟中富含AT碱基的序列特异性结合的一类基因,其所编码的蛋白含有以甘氨酸-精氨酸-脯氨酸(GRP)三个氨基酸残基为中心的DNA结合蛋白基序。笔者通过对AT-hook基因的特点和功能及其在拟南芥及水稻等高等植物开花中的调控作用综述。AT-hook基因不仅参与植物的生长发育及逆境胁迫与激素信号应答,同时在花器官的形成以及植物开花中也起着重要的调控作用。该基因在花器官组织中的表达量最高,影响成花素基因的表达,且其编码蛋白能够通过改变染色质状态或招募蛋白复合体在表观水平上调控植物开花相关基因的转录,从而影响植物开花。该基因可能为植物开花的表观遗传调控提供了新的途径。 相似文献
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利用实验室收集的优良种质资源籼稻亲本B91及B233分析影响粒质量的关键表型性状,挖掘粒质量相关的遗传位点与候选基因,进一步了解多基因调控粒型性状的遗传基础,以期在种质资源改良中加以应用。以2个籼稻亲本B91和B233及杂交繁育的F_2群体为研究材料,对B91和B233籽粒颖壳和胚乳进行扫描电镜观察,测定两亲本灌浆速率;对B91和B233构建的F_2分离群体进行QTL-seq分析,通过注释基因表达位置以及预测功能进一步筛选出粒质量候选基因。结果表明,根据籽粒颖壳和胚乳扫描电镜观察,B233与B91粒长、粒宽、粒厚的差异是由细胞大小和细胞数量共同决定的,且与B91相比B233籽粒饱满度较差。通过灌浆参数的比较,B233起始生长势,活跃灌浆时间,最大灌浆速率等指标均大于B91。QTL-seq分析共得到了430 762个有效SNP位点,发现了位于6条染色体上共8个QTL。主要关注正阈值区内的5个QTL,对正阈值区QTL位点内△(SNP-index)0.7的SNP位点进行了筛选,选出在基因中非同义突变及剪接位点上的SNP突变23个基因,同时挑选出Indel突变基因共11个。根据NCBI网站对注释基因的转录表达分析及基因功能预测筛选出6个可能为调控粒质量性状的候选基因,其中基因Os04g0617600、Os04g0619600编码蛋白起到蛋白激酶或转录调节因子作用,Os04g0624600、Os04g0631000调控碳水化合物的合成与分解,Os04g0653100调控生物大分子的运输,同时也是花粉壁细胞的重要组成成分,Os02g0611450可能调控生物大分子的合成和细胞周期。综上,水稻粒长、粒宽、粒厚及饱满度均直接影响水稻籽粒质量,通过扫描电镜观察,灌浆速率调查从细胞水平和生理水平解释粒质量差异。通过QTL-seq结合注释基因转录表达分析及功能预测等手段可以更高效的筛选出粒质量的候选基因。水稻粒质量可能受到蛋白磷酸化、转录调节相关基因的影响。 相似文献
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[目的]U-box蛋白是一类决定靶标蛋白特异性的E3泛素连接酶(少部分属于泛素链聚集因子-E4),在植物抗病、抗逆和生长发育各阶段都发挥着重要作用。为揭示U-box蛋白家族基因OsPUX2在水稻防御反应中的具体生物学功能,利用CRISPR/Cas9编辑技术对OsPUX2基因进行编辑。[方法]在OsPUX2第1外显子设计1个20 bp的编辑靶点,构建了OsPUX2基因敲除载体pRGEB32-OsPUX2-gRNA载体,并通过农杆菌介导的转化方法侵染水稻Pik-H4 NIL愈伤组织,经潮霉素检测获得转基因阳性植株,并对T0代转基因植株进行靶点区域序列进行PCR和测序分析,分析ospux2的突变类型。[结果]成功获得了ospux2的敲除突变体材料,对突变类型的分析发现,转基因编辑后代共存在7种突变类型,以缺失突变为主,其中一种纯合突变类型在OsPUX2第一个外显子的第115号碱基处缺失了一个C碱基,导致蛋白的翻译在第84个氨基酸处提前终止。[结论]该研究获得ospux2突变株系对进一步研究该基因的功能具有重要意义。 相似文献
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【目的】研究磁性纳米颗粒(MNP)负载质粒DNA形成的纳米载体-基因复合物的生物物理学特性、负载形态与负载机理,为基于磁性纳米载体定向编辑技术的应用奠定基础。【方法】以MNP作为基因载体,与质粒DNA pRGEB32制备纳米载体-基因复合物MNP-pRGEB32,分析MNP负载、保护pRGEB32的能力,并对其粒度分布、Zeta电位、结合形态进行研究。【结果】MNP通过静电作用压缩、吸附、聚集pRGEB32,形成纳米载体-基因复合物。MNP能有效负载并保护pRGEB32。【结论】MNP可作为一种理想的基因转移载体。 相似文献