快速检测猪血凝性脑脊髓炎病毒方法的建立

为研究建立快速检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的PT-PVR方法。结合GenBank中HEV涉及的HE基因及S基因设计1对引物,整理RT-PCR的反应条件,建立(HEV)RT-PCR方法。结果发现,检测猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)的RT-PCR方法存在一定的特异性和敏感性,可以检测到猪体内多个组织内含有该病原。表明检测猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)的RT-PCR方法的建立具有实际意义,可有效检测猪血凝性脑脊髓炎病毒。     

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR诊断方法的建立与应用

为建立一种快速简便的检测猪传染性胃肠炎的RT-PCR方法,根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒N蛋白基因的核苷酸序列设计1对引物,并以合成的cDNA为模板,初步建立了猪传染性胃肠炎病毒的RT-PCR检测方法,进而对对照病毒及采集的病料组织进行了敏感性、特异性和重复性检测。结果表明,该研究建立的RT-PCR方法敏感性高,最低核酸检测值为0.5ng/μL,扩增产物特异性好,重复性稳定,可应用于猪传染性胃肠炎病毒的实验室诊断和流行病学调查。     

猪非典型性瘟病毒与猪流行性腹泻病毒双重PCR方法的建立与应用

为了快速准确地检测出猪非典型性瘟病毒(APPV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV),根据Gen Bank中发布的PEDV S2基因和APPV NS3基因的序列,分别选取PEDV S2基因和APPV NS3基因的保守序列,设计、合成了1对特异性引物。通过对体系进行优化,分别扩增出190 bp和500 bp的特异性片段。建立的双重RT-PCR方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪轮状病毒(RV)的检测均为阴性。对PEDV和APPV的最低检出量分别为1μl 2.65×10~5和1μl 3.56×10~4,对四川遂宁、眉山等地采集到的腹泻、肌肉震颤的病料进行检测,PEDV、APPV阳性病料检出率分别为41. 18%和11. 76%,经分别与特异性检测APPV和PEDV的单一RT-PCR法检测结果进行比较分析,符合率均为100%。与单一RT-PCR检测方法具有相同特异性和重复性,可用于临床检测。     

上海地区生猪屠宰产品中共存基因3型和4戊型肝炎病毒

调查了上海市部分规模化屠宰场生猪屠宰产品中戊型肝炎病毒的携带状况.从4个屠宰场采集60份猪胆汁、60份猪肝脏、印份猪脾脏、60份猪肠系膜淋巴结、160份猪粪便及61份猪血清样品.利用巢式简并引物和RT-PCR技术,检测样品中HEV RNA,并对阳性扩增子进行克隆测序,序列用生物信息学软件分析.结果表明:样品戊型肝炎病毒RNA阳性率为1.08%(5/461).其中胆汁检出率为3.3%(2/60)、粪样为o.6%(1/60)、血清3.2%(2/61)、肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结未检测到HEY RNA.序列系统进化分析结果显示,5株HEV中3株为基因3型HEV,同源性为90.7%-98.6%;2株为基因4型,同源性为94.9%.结果证实屠宰场生猪携带的HEV主要存在于胆汁和血清中.因此提示.屠宰场在屠宰时要妥善处理生猪血清和胆汁以防污染其他屠宰产品.研究在屠宰生猪中检测到基因3型HEV RNA.结果提示,至少在较为局限的群体中基因3型和4型病毒可以共存.     

猪传染性胃肠炎病毒S基因的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank收录的TGEV-Miller毒株的S基因序列,设计合成1对特异性引物,用RT-PCR方法从疫苗株中扩增TGEV S基因的部分保守片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量RT-PCR检测...     

猪流行性腹泻病毒变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法,根据Gen Bank中公布的PEDV变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株的S基因和ORF3基因,设计合成2对特异性扩增引物,用以扩增PEDV S基因和ORF3基因,通过目的片段的数量和片段大小来判断PEDV的毒株类型;通过对退火温度等反应条件的优化,建立了检测不同PEDV毒株类型的多重RT-PCR鉴别检测方法。结果显示,所建立的多重RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分PEDV变异毒株、经典毒株和弱毒疫苗株;PEDV变异毒株扩增出2条目的条带,分别为234 bp的ORF3基因片段和826 bp的S基因片段;PEDV经典毒株扩增出1条目的条带,片段大小为234 bp的ORF3基因片段;而弱毒疫苗株扩增出1条目的条带,片段大小为185 bp的ORF3基因片段;与猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪乙型脑炎病毒、猪细环病毒及猪细小病毒均无交叉反应;敏感性试验显示,该方法能检测到的最低核酸浓度为2.3×10-4ng/μl;且该方法具有良好的重复性。利用该方法对采集自广西部分地区的91份临床腹泻样品进行检测,样品中PEDV阳性样品有64份,其中变异毒株占89.06%(57/64),经典毒株占4.69%(3/64),弱毒疫苗株占6.25%(4/64)。结果表明,该多重RT-PCR鉴别检测方法特异性强、灵敏度高、操作简单,为猪流行性腹泻的流行病学及病原的鉴别诊断研究提供了可供借鉴的技术手段。     

猪库布病毒RT-PCR检测方法的建立及湖北省流行病学初步调查

根据猪库布病毒的3 D基因设计1对引物,建立了两步法RT-PCR检测方法,使用该方法分别对CSFV、PRRSV、JEV、SIV、PEDV、TGEV、GARV阳性模板及包含猪肠道病毒3 D基因和口蹄疫病毒3 D基因的重组质粒进行PCR检测,结果从以上9种常见猪病病原的阳性模板中均不能扩增出323bp大小的PCR产物,说明该检测方法的特异性很好,能够用作临床样品的检测。敏感性试验显示,本试验建立的检测方法能够检测到的模板最低质量浓度为180fg/mL。应用该方法对湖北省各大猪场进行了临床病料检测,在采集的165份病料中有118份样品检测为猪库布病毒阳性。在4个发生腹泻疫情的规模化猪场进行了分群抽样调查,结果显示,猪库布病毒在猪群中集中分布在发生腹泻疫情的猪群,说明猪库布病毒和现阶段的腹泻疫情有紧密的联系。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒HE基因的克隆及真核表达

应用特异性引物,从猪血凝性脑脊髓炎病毒（HEV）中扩增出HE蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pTHE。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pTHE,回收目的基因HE片段并将其定向克隆到pPiCZαA中,构建重组质粒pPiCZαA HE。用BstXⅠ酶切pPICZαA HE使其线性化,并电击转化至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1％甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及westem blot分析。结果在酵母菌培养基上清中检测到相对分子量为43kD的重组蛋白,且该重组蛋白可与HEV多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明HEV的HE蛋白片段在Pichia Pastoris中获得成功表达。     

Porcine kobuvirus RT-PCR detection assay establishment and application in primary epidemiology investigation in Hubei Province

根据猪库布病毒的3D基因设计1对引物,建立了两步法RT-PCR检测方法,使用该方法分别对CSFV、PRRSV、JEV、SIV、PEDV、TGEV、GARV阳性模板及包含猪肠道病毒3D基因和口蹄疫病毒3D基因的重组质粒进行PCR检测,结果从以上9种常见猪病病原的阳性模板中均不能扩增出323bp大小的PCR产物,说明该检测方法的特异性很好,能够用作临床样品的检测.敏感性试验显示,本试验建立的检测方法能够检测到的模板最低质量浓度为180fg/mL.应用该方法对湖北省各大猪场进行了临床病料检测,在采集的165份病料中有118份样品检测为猪库布病毒阳性.在4个发生腹泻疫情的规模化猪场进行了分群抽样调查,结果显示,猪库布病毒在猪群中集中分布在发生腹泻疫情的猪群,说明猪库布病毒和现阶段的腹泻疫情有紧密的联系.     

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鉴别检测方法的建立

【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测后发现,利用该方法可以从中分别检测出CSFV强毒和疫苗毒。【结论】建立了可鉴别检测CSFV强毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR方法,为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供了技术参考。     

不同铵硝比对菠菜有机酸和淀粉含量的影响

【目的】研究不同铵硝比的氮素营养对于菠菜有机酸和淀粉含量的影响。【方法】采用营养液栽培菠菜的方法,营养液中的氮素形态设置硝态氮和铵态氮以一定比例（100﹕0、75﹕25、50﹕50、25﹕75 和 0﹕100）配合。【结果】随着铵硝比的下降,（1）菠菜茎叶丙酮酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸和苹果酸等6种有机酸含量以及淀粉含量都呈上升趋势;同时,有机酸含量与营养液中初始硝态氮浓度之间呈显著的线性正相关关系;（2）菠菜根系丙酮酸、柠檬酸、琥珀酸和苹果酸含量以及淀粉含量也呈上升趋势,但延胡索酸含量的变化不明显;（3）除了柠檬酸外,菠菜根系其它5种有机酸含量与其茎叶中相应有机酸含量的比值都呈现下降的趋势;在全硝营养条件下,根系中只有琥珀酸和延胡索酸的含量低于其在茎叶中的含量;而在全铵营养时,菠菜根系中上述5种有机酸的含量均明显高于茎叶中的相应有机酸的含量。因此,与根系相比,菠菜茎叶中5种有机酸含量随营养液中硝态氮比例增加而增加的幅度更明显。而随着营养液中硝态氮比例的增加,菠菜根系柠檬酸含量与其茎叶柠檬酸含量的比值逐渐升高,则说明根系柠檬酸含量增加的幅度要大于茎叶柠檬酸含量;（4）菠菜的茎叶和根系中的淀粉含量都呈现下降的趋势,且与营养液中硝态氮浓度之间均呈现为显著的负相关关系。【结论】随着营养液中硝态氮比例的增加,菠菜茎叶和根系有机酸代谢均表现为增强的趋势。     

不同氮素形态配比对生菜生长、品质和保护酶活性的影响

研究了4种氮素形态配比(NO3^--N^2NH4^ -N分别为100：0,75：25,50：50和0：100)对生菜(品种为“弘农”和“绿领”)生长、品质和叶片保护酶活性的影响。结果表明,随着氮素中氨态氮比例的增加,地上部和根的鲜重、干重逐渐降低,叶片数、叶长、叶宽、叶片含水量均显著降低,而根冠比则随着氨态氮比例的增加而上升;不同氮素形态配比处理对地上部生长的影响在定植10d后才表现出显著差异。随着氮素中氨态氮比例的增加,SOD和POD活性逐渐增加,完全氨态氮处理下SOD和POD活性最高。定植后13d内各处理叶片中的(MDA含量无显著差异,其后对于完全氨态氮处理和NO3^--N^2NH4^ -N为50：50处理,MDA含量迅速增加。完全硝态氮处理下硝酸盐含量最高,随着氨态氮比例的增加,生菜中硝酸盐含量逐渐降低,NO3^--N^2NH4^ -N为75：25处理下的可溶性糖和可溶性蛋白质的含量最高。     

营养液铵硝比对砂培韭菜生长及硝酸盐含量的影响

[目的]研究不同铵硝比营养液对韭菜生长及硝酸盐含量的影响。[方法]2008～2009年,对日光温室内砂培的2年生韭菜,分别浇施总氮量相同、铵硝比为0∶100,15∶85,30∶70,45∶55和60∶40的营养液。[结果]提高营养液铵硝比不仅大幅度降低了韭菜硝酸盐含量,而且显著地提高了春季韭菜的总产量。铵硝混合营养处理的韭菜硝酸盐含量极显著低于纯硝营养,铵硝比60∶40和45∶55处理的韭菜硝酸盐含量最低,均比纯硝营养降低了59.8%;铵硝比45∶55和30∶70处理的韭菜总产量显著高于纯硝营养,分别增产22.4%和14.0%。铵硝比对单茬韭菜产量的影响因收获时期不同而异,增铵对提高第1茬产量的作用最大、对第3茬无明显作用。[结论]45∶55和30∶70是适合韭菜砂培的营养液铵硝比。     

普通山地红壤可溶性氮不同条件下的提取效率比较(英文)

[目的]针对目前土壤可溶性氮的提取方法在提取剂种类、水土比及土样保存状态(新鲜和风干)等方面的不同,分析普通山地红壤可溶性氮不同条件下的提取效率,以期为土壤可溶性氮提取提供试验依据。[方法]利用常绿阔叶林植被下普通山地红壤,分别以其新鲜土和风干土为试验材料,探讨2mol/LKCl和0.5mol/LK2SO42种提取剂在水土比4:1、6:1和10:1下提取土壤可溶性氮的差异,研究该类型土壤可溶性氮不同提取条件下的提取效率。[结果]KCl比K2SO4更适合用于提取土壤NH4+-N,KCl提取的NH4+-N不仅量大且稳定性好,K2SO4则需在较大水土比下才能充分提取土壤NH4+-N;2种提取剂在NO3--N提取上的差异性很小,但低水土比下KCl提取NO3--N的稳定性高于K2SO4;两者提取的NO2--N性能非常接近;在土壤SON的提取中,2种提取剂的差异较小,KCl提取的SON量少于K2SO4,但稳定性高于K2SO4,二者的SON提取量具有极显著相关性;用K2SO4提取MBN时可以不考虑水土比的影响,但使用KCl则必须慎重选择水土比。提取新鲜样时KCl和K2SO4之间的差异大于提取风干样时的差异,所以在对新鲜样中可溶性氮提取时应更注重提取剂的选择。[结论]该试验结果为提高土壤可溶性氮的提取效率,增加测定结果的可比性奠定了试验基础。     

不同氮形态配比对菠菜生长及氮代谢的影响

[目的]探讨硝态氮和铵态氮在叶菜类蔬菜上的营养特性及联合效应。[方法]采用凯氏定氮法测定总氮含量。[结果]增加铵态氮比例对菠菜地上部的生物量影响很大。在NO3--N/NH4+-N比例为100/0的处理中,菠菜的鲜重、干重均最高,生物量最大。随着NO3--N/NH4+-N比例的减小,菠菜的鲜重、干重和生物量递减,而根冠比升高。增加铵态氮比例对菠菜根和叶中硝酸盐的累积有明显影响,不同配比间差异显著。硝酸盐的累积量随着NO3--N/NH4+-N比例的降低而减小,NO3--N/NH4+-N比例为0/100时,累积量最小,且显著低于25/75比例的处理。[结论]全铵培养对菠菜生长有明显的抑制作用,硝态氮对菠菜生长有促进作用。     

铵态氮/硝态氮配比对豫中烟区烤烟生长及品质调控研究

为明确豫中浓香型烟区施肥适宜的铵态氮/硝态氮配比(即铵硝比),采用大田小区试验,在氮肥、钾肥和磷肥施用量相同的基础上,设计4个不同铵硝比(6∶4、5∶5、4∶6、3∶7)处理,研究了豫中烟区不同铵硝比对烤烟农艺性状、化学成分及香气物质含量的影响。结果表明,在烟株移栽后30、45 d,烟株的叶长、叶宽、茎围和叶面积随硝态氮比例增加呈先增加后降低的趋势,且以铵硝比4∶6处理表现最好。在成熟期(移栽后90 d),各处理间烟株株高和叶宽无明显差异,而叶长和叶面积随硝态氮比例增加呈降低趋势。各生育时期不同铵硝比处理下烟叶氮、磷、钾含量差异表明,铵硝比为4∶6时有利于烟株对氮、磷、钾的吸收。硝态氮不利于烤后烟叶的总糖、还原糖、总氮、氯离子含量的合成或累积,而铵态氮则促进烟叶的碳、氮代谢;烟叶钾含量则随着硝态氮比例的增加呈先增加后降低的趋势,且以铵硝比为4∶6时(钾含量1.34%)显著高于其他处理,说明硝态氮在一定程度上有利于烟叶对钾的吸收。香气成分分析发现,硝态氮有利于烤烟中部叶类胡萝卜素降解产物的合成,过高或过低的铵硝比都不利于西柏烷类致香物质和棕色化反应产物的合成,二者含量均以铵硝比4∶6时最高,且致香物质总量也以铵硝比4∶6时最高。综合考虑烟株的生长情况、烟叶的化学成分和致香物质含量,在河南浓香型烟区推荐以铵硝比4∶6进行氮肥施用。     

氮肥施用量对水浇地覆膜马铃薯土壤矿质氮含量及马铃薯产量的影响

【目的】针对马铃薯生产中存在的氮肥过量施用问题,探索氮素在土壤中的残留情况和马铃薯最佳施氮量,为科学施用氮肥提供参考.【方法】通过田间试验,研究不同氮肥水平(0,75,150,225,300,375Nkg/hm2)对水浇地覆膜马铃薯‘青薯9号’各生育期土壤0~20cm和20~40cm土层矿质氮(铵态氮+硝态氮)含量及马铃薯产量的影响.【结果】随施氮量的增加,土壤铵态氮含量变化较小,但0~20cm和20~40cm土层硝态氮的含量随施氮量增加显著增加,不同氮肥用量T2、T3、T4、T5和T6处理的0~20cm土层中硝态氮含量至收获期时高达57.53,88.53,149.86,185.10mg/kg和240.42mg/kg,比播前增加了40~200mg/kg;20~40cm土层硝态氮含量至收获期时分别为63.90,88.11,156.70,192.13mg/kg和244.51mg/kg,比播前增加了30~200mg/kg;过量施氮(T5和T6)和氮肥施用不足(T1、T2和T3)均降低了马铃薯的块茎产量.【结论】试验条件下,马铃薯的经济最佳施氮量和最高产量施氮量分别为180.99kg/hm2和231.07kg/hm2.不同氮水平主要通过影响‘青薯9号’的平均单株薯质量而影响块茎产量.     

光照强度和氮素配比对葡萄试管苗生长及生理特性的影响

[目的]为葡萄试管苗培养过程中的光照和氮素管理提供理论依据。[方法]以红地球葡萄试管苗为试材,研究了不同光照强度和NH4＋-N、NO3–-N不同配比对葡萄试管苗的生长发育和生理特性的影响。[结果]随氮源中NH4＋-N所占比例增加,葡萄试管苗叶绿素含量也相应增加。在光强为5 000 lx、NH4＋-N∶NO3–-N为5∶5条件下生长的葡萄试管苗,叶绿素含量最高。在相同氮源条件下生长的试管苗,可溶性糖和可溶性蛋白质含量随光照强度的增加而升高。当光照为5 000 lx、NH4＋-N∶NO3–-N为0.8∶9.2（改良B5培养基配方氮素比例）时,葡萄试管苗可溶性糖和可溶性蛋白质含量最高。[结论]在光照为5 000 lx、NH4＋-N∶NO3–-N为0.8∶9.2条件下有利于葡萄试管苗可溶性糖和可溶性蛋白质的积累。     

不同形态氮配施对烤烟碳氮代谢及烟叶产质量的影响

以K326烤烟品种为材料,通过生育期烟株的碳氮代谢主要相关酶活性及其主要代谢产物含量动态变化,从氮素形态调控的角度对烤烟产量和烟株碳氮代谢的影响进行探讨。结果表明,不同配比硝态氮和铵态氮对烤烟品质有明显的影响。随着硝铵比的增加,烤后烟叶的可溶性总糖、还原糖含量明显增加,而烟碱、蛋白质含量明显降低,但是对全氮含量没有影响;硝态氮和铵态氮配合施用有利于烤烟产量和产值的提高。适当的硝铵比可以有效调节烟株碳氮代谢及其产物,有利于生长前期烟株维持较高的硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶活性和水溶性蛋白质、游离氨基酸含量,保持较高的氮代谢,降低生长前期烟株淀粉酶的活性,提高可溶性总糖和淀粉含量,而在烟叶生理成熟期能够适时提高淀粉酶活性,即促进前期碳水化合物的合成和后期碳水化合物的分解。在该试验条件下,以75%～50%硝态氮+25%～50%铵态氮的施用比例最佳。     

大豆共生固氮与叶片全氮含量之间关系的研究

:研究了在不同配比的NO3- -N与NH4 +-N下大豆根瘤的生长及根瘤固氮酶活性和叶片全氮含量的变化。结果表明 :7种配比的NO3- -N与NH4 +-N均降低根瘤鲜重 ,抑制根瘤固氮酶活性 ,但提高叶片全氮含量。叶片全氮含量与根瘤鲜重、根瘤固氮酶活性之间呈显著负相关