非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达和多克隆抗体制备

[目的]非洲猪瘟(african swine fever,ASF)是一种以猪急性发病、高死亡率为典型特征的病毒病,其病原非洲猪瘟病毒(ASF virus,ASFV)在中国的暴发给中国养猪业造成重大损失.p72蛋白是ASFV的主要衣壳蛋白,能够有效诱导机体产生特异性抗体,常被利用于检测试剂盒的备成.[方法]构建了p72全长(pET-28a-ASFV-p72)及1-171aa截短突变体(pET-28a-ASFV-p72-(1-171))原核表达质粒,通过E.coli原核表达系统表达并纯化了p72全长及1-171aa融合蛋白.该2种蛋白经过4次免疫日本大耳白Balb/C兔后,获得效价皆为大于1:819200的多抗血清.[结果]通过间接免疫荧光实验和Western blot检测2种多抗均能与真核表达的p72蛋白发生特异性反应.[结论]制备的针对p72多克隆抗体为后续诊断试剂盒的研发提供依据.     

猪源链球菌的分离鉴定及生物学特性研究

通过生化试验、药敏试验、PCR分型、毒力基因的PCR检测及动物试验对分离的猪源链球菌进行药物敏感性、血清型和分子流行病学初步研究。从不同省份猪链球菌病疑似病例猪的心血、肝、淋巴结、脑和关节液组织分离出97株链球菌,药敏试验结果表明各菌株对13种抗菌素的耐药谱不同,但对先锋霉素V和环丙沙星的耐药率均低于5%。通过对分离菌株进行PCR鉴定和分型,确认26株为猪链球菌,其中1株为1型,16株为2型,4株为7型,没有9型,另5株为其它型。进一步对1型、2型和7型猪链球菌mrp、epf和sly3种毒力基因的分布情况进行了PCR检测。动物试验表明能100%致死小白鼠的猪链球菌基因型均为epf^＋mrp^＋sly^＋2型猪链球菌,1株2型和1株7型猪链球菌均能复制出典型的猪链球菌病例。     

当前新发伪狂犬病的分子流行特点及防控方案

猪伪狂犬病(PR)是由伪狂犬病毒(PRV)引起的一种急性传染病,主要以种猪繁殖障碍、新生仔猪急性死亡、断奶-育肥猪莫名发热和呼吸道症状为主要临床表现,已成为猪场重点防控的病毒性传染病。20世纪80年代,该病在我国大面积暴发流行,给国内养殖业带来严重损失。随着伪狂犬病疫苗的广泛应用,该病得到了很好的控制,在国内一直处于平息状态。但自2011年以来,猪伪狂犬病卷土重来,先后在全国不同地区暴发流行,引起了业界的广泛关注和深刻反思。"伪狂犬病毒是否发生变异或毒力增强"、"猪伪狂犬病防控方案是否出现漏洞"、"传统疫苗还能不能提供有效保护"等种种猜测一直在业内流传,笔者所在实验室近年来进行了大量的研究,并相继从临床分离到三十多株伪狂犬病新变异毒株,一些研究结果和数据分析或许为猪伪狂犬病疫情再发找到了佐证。针对猪伪狂犬病流行新形势和发病新特点,结合临床疫情处理和成功防控案例,及时调整免疫策略,探寻一种更为有效的伪狂犬病免疫方案,在当前变异伪狂犬病阳性感染场或受威胁场推广应用中显得尤为重要。     

猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立及应用

本试验旨在建立一种针对猪圆环病毒2型(PCV2)和猪肺炎支原体(Mhp)的双重PCR检测方法.对猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、沙门菌、大肠杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌基因组模板进行PCR特异性检测,没有任何非特异性扩增.敏感性试验显示,建立的PCR检测方法能够检测到的PCV2和Mhp模板的最低浓度分别为130和180fg·mL-1.同时用单项PCR和双重PCR对湖北省的各大猪场的174份PRDC样品进行检测,PCV2和Mhp的符合率分别达到100％和98.28％.进一步应用双重PCR调查PCV2和Mhp在不同猪场的感染动态,结果显示有一定比例的仔猪在产房就已经感染PCV2和Mhp,大部分猪是在保育和育肥阶段被感染 ;但是不同猪场表现出不同的感染动态.本试验建立了一种针对PCV2和Mhp的双重PCR检测方法,具有良好的特异性、敏感性,为临床疾病检测和疾病流行态势调查提供了有力的支持.     

猪链球菌2型PCR快速检测试剂盒的研制及初步应用

根据猪链球菌2型荚膜多糖抗原编码基因簇中的cps2J基因序列设计1对可扩增560 bp片段的特异性引物,成功地建立了一种检测猪链球菌2型的PCR方法,并通过优化研制出PCR检测试剂盒。进一步的研究结果表明,试剂盒具有很好的特异性、敏感性和稳定性。试剂盒能从病料8 h增菌的混合菌群中快速检测出猪链球菌2型菌株。试剂盒对临床样本的检测结果表明,猪链球菌2型在我国猪群发生的链球菌病例中不占主导地位。     

猪库布病毒RT-PCR检测方法的建立及湖北省流行病学初步调查

根据猪库布病毒的3 D基因设计1对引物,建立了两步法RT-PCR检测方法,使用该方法分别对CSFV、PRRSV、JEV、SIV、PEDV、TGEV、GARV阳性模板及包含猪肠道病毒3 D基因和口蹄疫病毒3 D基因的重组质粒进行PCR检测,结果从以上9种常见猪病病原的阳性模板中均不能扩增出323bp大小的PCR产物,说明该检测方法的特异性很好,能够用作临床样品的检测。敏感性试验显示,本试验建立的检测方法能够检测到的模板最低质量浓度为180fg/mL。应用该方法对湖北省各大猪场进行了临床病料检测,在采集的165份病料中有118份样品检测为猪库布病毒阳性。在4个发生腹泻疫情的规模化猪场进行了分群抽样调查,结果显示,猪库布病毒在猪群中集中分布在发生腹泻疫情的猪群,说明猪库布病毒和现阶段的腹泻疫情有紧密的联系。     

猪博卡病毒PCR检测方法的建立及其初步流行病学调查

猪博卡病毒(PBoV)是一种新出现的病毒,可以导致仔猪急性腹泻。为建立该病毒的检测方法,本实验根据PBoV的NS1基因序列设计一对引物,建立了PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法能够从PBoV阳性样品中特异性的扩增出482 bp的片段,而对猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、沙门氏菌、大肠杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌的核酸样品均无非特异性扩增反应。敏感性试验显示,该PCR方法对PBoV的最低检测量为213.6拷贝。此外,应用该方法对湖北、湖南、河南省的各大猪场进行了流行病学调查,在79个规模化猪场采集的248份病料样品中有172份样品为PBoV阳性。其中,对4个发生腹泻疫情的规模化猪场进行了分群抽样调查,结果显示PBoV在腹泻猪群中的阳性率达到73.95%,并显著高于非腹泻猪群(47.83%)。本研究调查结果显示PBoV在国内猪群中流行广泛而且感染率高。     

翻转课堂在兽医产科学中实践教学探讨

兽医产科学是一门研究动物繁殖生理、繁殖技术和繁殖疾病的临床学科,是动物医学专业的必修专业课之一.近年来,我国的畜牧生产结构发生了显著变化,因此,为了与现代动物的养殖生产结构相适应,其课程教学方式改革也成为了目前亟待解决之需.翻转课堂是一种新型的教学方式,提倡以学生为主体,强调开放性、多样性的现代教学理念.本文结合兽医产科学课程的自身特点,探讨翻转课堂引入兽医产科学教学的实践策略.     

华中地区猪繁殖与呼吸综合征病毒临床流行毒株Nsp2和GP5氨基酸的遗传变异分析

为了解当前猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,本研究对2013-2014年间来源于中国华中地区湖北、河南和湖南3省20个猪场65份疑似PRRSV感染的临床样品开展病毒分离工作,通过RT-PCR及间接免疫荧光试验进行鉴定,结果显示成功分离到4株PRRSV。通过测序获得它们的部分Nsp2氨基酸序列,经比对分析,确定分离毒株皆为变异毒株,并且与JXA1、TJ等高致病性毒株有相同的遗传特点,在Nsp2区域有30个氨基酸的不连续缺失。本研究将从临床样品中测序获得的23株PRRSV的GP5氨基酸序列与GenBank公布的有代表性的毒株序列进行遗传进化分析,结果显示所有毒株均为美洲型毒株,其中21株与高致病性变异毒株(JXA1、TJ和HUN4)同源性较高,同时在主要中和位点和N-糖基化位点存在部分氨基酸突变,另外两株与疫苗毒株RespPRRS MLV同源性较高。本试验结果表明,当前高致病性PRRSV依然是优势毒株,其GP5氨基酸突变频繁,不同地区流行毒株存在一定的遗传差异。     

非洲猪瘟病毒p72重组蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

为了建立一种快速检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的方法，试验利用GenBank中ASFV的p72基因(登录号为MK128995.1)序列构建原核重组表达质粒pGEX-6P-1-p72和真核重组表达质粒pCAGGS-myc-p72,通过大肠杆菌原核表达系统获得p72重组蛋白，将其纯化后免疫小鼠，获得阳性杂交瘤细胞，通过Western-blot和间接免疫荧光鉴定筛选单克隆细胞株，并用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒鉴定各单克隆抗体的亚型。通过对p72兔源多克隆抗体包被浓度及纯化的3株单克隆抗体稀释度进行优化，初步建立检测ASFV的双抗体夹心ELISA方法，并用该方法测试纯化的3株单克隆抗体分别与p72兔源多克隆抗体两两组合后所能检测的p72重组蛋白的灵敏度。结果表明：p72重组蛋白大小为99 ku;以纯化的原核表达的p72重组蛋白作为抗原免疫3只小鼠，抗体效价均大于1∶10 000;经细胞融合、克隆和筛选共获得5株阳性杂交瘤细胞，将其分泌的单克隆抗体分别命名为2C4C8、2C4B8、5C11F11、5C11D12、7D10C9,5株单克隆抗体与真核...