表皮蛋白基因TcCP14.6和TcLCPA3A参与介导赤拟谷盗对磷化氢的抗性形成

【目的】 表皮蛋白是昆虫表皮重要的结构物质,大量研究已经证实表皮蛋白基因参与介导昆虫抗药性形成。以赤拟谷盗（Tribolium castaneum）为研究对象,解析表皮蛋白基因TcCP14.6（cuticle protein CP14.6）和TcLCPA3A（larval cuticle protein A3A）在昆虫磷化氢抗性形成过程中的作用。【方法】 采用联合国粮农组织（FAO）推荐的磷化氢熏蒸方法对采自5个省份赤拟谷盗的磷化氢抗性水平进行测定。基于赤拟谷盗基因组数据获得TcCP14.6和TcLCPA3A的cDNA序列,利用在线生物信息学分析软件预测其编码的氨基酸序列、信号肽和保守结构域。分别提取赤拟谷盗不同组织（头、胸、腹的表皮、翅、足、肠道、马氏管和脂肪体）、不同磷化氢抗性水平以及磷化氢胁迫后试虫的总RNA。以TcRPS和TcRPL为内参基因,运用RT-qPCR技术分析TcCP14.6和TcLCPA3A在赤拟谷盗不同组织、不同磷化氢抗性水平和药剂胁迫下的表达模式。最后,通过RNA干扰技术结合生物测定方法分析TcCP14.6和TcLCPA3A与赤拟谷盗磷化氢抗性的关系。【结果】 生物测定结果表明,江苏（JS,RR=1.7）和云南（YN,RR=3.0）种群对磷化氢保持敏感,湖南种群（HN,RR=20.2）表现为中等抗性,四川（SC,RR=395.4）和广东（GD, RR=862.7）种群表现为极高抗。序列分析结果表明TcCP14.6和TcLCPA3A蛋白均包含信号肽和保守的几丁质结合域。RT-qPCR结果显示,TcCP14.6和TcLCPA3A均在赤拟谷盗表皮组织中高表达,而在内部器官（脂肪体、肠道、马氏管）中的表达量相对较低。此外,TcCP14.6表达量随磷化氢抗性水平的增加呈上调趋势,而TcLCPA3A表达量则呈下降趋势;赤拟谷盗经磷化氢熏蒸处理6 h,TcCP14.6和TcLCPA3A的表达量分别呈现上调和下调趋势。注射dsRNA分别干扰抗性（GD）和敏感（YN）种群两个基因的表达后再用LC₃₀的磷化氢浓度处理试虫。与对照相比,TcCP14.6基因沉默后赤拟谷盗的死亡率显著升高,而TcLCPA3A基因沉默后试虫死亡率显著下降。【结论】 表皮蛋白基因TcCP14.6和TcLCPA3A参与介导赤拟谷盗对磷化氢的抗性。     

表皮蛋白基因参与锈赤扁谷盗磷化氢抗性形成

【目的】作为昆虫表皮重要的结构物质,表皮蛋白（cuticle protein,CP）在昆虫对农药表皮穿透抗性形成过程中承担重要作用。锈赤扁谷盗（Cryptolestes ferrugineus）磷化氢抗性问题日益突出,论文旨在揭示表皮蛋白基因在该害虫磷化氢抗性形成过程中的作用。【方法】基于联合国粮农组织（FAO）推荐的生物测定方法解析5个地理种群（张家港、湘阴、淮安、怀化和太仓种群)锈赤扁谷盗磷化氢敏感性差异。首先通过锈赤扁谷盗转录组数据鉴定获得4个表皮蛋白基因,进而构建系统发育树,并对相应氨基酸序列进行分析。利用基因定量技术（RT-qPCR）解析上述4个锈赤扁谷盗表皮蛋白基因时空（不同发育阶段和成虫不同组织）和不同磷化氢抗性水平下的表达模式,以及表皮蛋白基因对磷化氢胁迫响应的表达模式。使用RNAi(RNA interference)技术对特定的表皮蛋白基因（CfRR2-1）进行沉默,并研究CfRR2-1被有效沉默后锈赤扁谷盗磷化氢敏感性变化情况。【结果】磷化氢敏感性测定结果显示,不同地理种群锈赤扁谷盗磷化氢敏感性水平差异显著,药剂抗性倍数（RR）范围为7.2—1 906.8。系统发育...     

环境胁迫对锈赤扁谷盗呼吸速率及线粒体编码基因表达水平的影响

【背景】线粒体是生物体内一种重要细胞器，是细胞消耗氧和产生能量物质三磷酸腺苷(ATP)的主要场所，在生物体抵抗逆境过程中发挥重要作用。锈赤扁谷盗(Cryptolestes ferrugineus)是一种世界性储粮害虫，具有极强的环境适应性。【目的】分析锈赤扁谷盗呼吸速率及线粒体编码基因对不同环境胁迫的响应，探究线粒体在锈赤扁谷盗抗逆境胁迫中的应激反应。【方法】根据锈赤扁谷盗线粒体基因组数据鉴定获得线粒体编码基因，并设计相应实时荧光定量PCR(RT-qPCR)引物。通过生物测定方法得出锈赤扁谷盗对熏蒸剂(甲酸乙酯)、植物源杀虫剂(鱼藤酮)和储粮保护剂(阿维菌素)的毒力回归方程及LC₃₀，并用该浓度对试虫进行后续药剂胁迫处理。利用RT-qPCR技术解析锈赤扁谷盗线粒体编码基因的时空(不同发育阶段和幼虫不同组织)表达模式。最后，使用CO2检测仪和RT-qPCR技术研究锈赤扁谷盗在高温(35和40℃)、甲酸乙酯、鱼藤酮、阿维菌素、饥饿等逆境胁迫下呼吸速率的变化以及线粒体编码基因的表达模式。【结果】共设计12个线粒体编码基因(除nad6)的定量引物。RT-qPCR结果显示这...     

黄粉甲翅芽生长因子基因的克隆及表达分析

翅芽生长因子(imaginal disc growth factor,IDGF)是一类调节昆虫发育和生长的因子。利用RACE克隆技术,克隆获得黄粉甲(Tenebrio molitor)IDGF基因,其c DNA序列长1 465 bp,开放阅读框为1 296 bp,可编码431个氨基酸,预测理论分子量为48.25 ku,等电点为7.63。氨基酸序列同源比对分析发现,黄粉甲IDGF与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)和蔗根非耳象(Diaprepes abbreviatus)的IDGF相似性分别为89%、71%。系统发育树分析表明,黄粉甲IDGF与赤拟谷盗IDGF进化关系最近。荧光定量PCR分析表明,在不同发育阶段,IDGF基因在幼虫1龄和2龄中的表达量明显高于其他发育阶段。在蛹期不同组织中,IDGF基因在脂肪体中的表达量最高。被管氏肿腿蜂(Scleroderma guani)寄生后,IDGF基因的转录水平未受影响,表明寄生不能调控该基因的转录表达。     

松墨天牛NCOA7基因的克隆及分析

【目的】本文探究了松墨天牛核受体共激活因子7基因的功能和作用方式。【方法】采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法获得了松墨天牛NCOA7基因的cDNA全长序列,命名为MaNCOA7(GenBank登录号:KU240004);通过RT-qPCR分析得出松墨天牛MaNCOA7基因在卵、幼虫、蛹、成虫4个虫态、幼虫脂肪体等6个组织和成虫鞘翅等10个部位的表达模式。【结果】MaNCOA7基因的cDNA序列全长为3345 bp,其中开放阅读框(ORF)长2970 bp,编码989个氨基酸,由此推测的蛋白分子质量为111 220.4ku,等电点为5.11。MaNCOA7的氨基酸序列与赤拟谷盗相似性最高,为83.6%,与赤拟谷盗处在系统发育树的同一个分支上;没有信号肽和跨膜区,属于亲水性氨基酸,含有丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)磷酸化位点数分别为62、21、11个。MaNCOA7基因在幼虫虫态表达量最高,在卵虫态表达量最低;在幼虫6个组织中均有表达,且有显著差异(P0.05),其中在幼虫脂肪体中表达量最高,在幼虫马氏管中表达量最低;在成虫10个部位中均有表达,且有显著差异(P0.05),其中在成虫鞘翅的表达量最高,在成虫马氏管的表达量最低。【结论】推测MaNCOA7基因在松墨天牛幼虫脂肪体中参与调控某些代谢过程或组织器官的生理功能,并可能参与了松墨天牛羽化过程中鞘翅和前胸背板的骨化过程。     

华山松大小蠹β-肌动蛋白基因的克隆与组织表达

【目的】获得华山松大小蠹β-肌动蛋白基因序列,探讨其作为内参基因的可行性。【方法】通过比对其他昆虫β-肌动蛋白的氨基酸序列设计简并引物,用PCR的方法获得华山松大小蠹β-肌动蛋白基因片段,进一步通过RT-PCR和qRT-PCR的方法,研究β-肌动蛋白基因在华山松大小蠹不同发育阶段和成虫不同组织的表达情况。【结果】获得了1 461bp的华山松大小蠹β-肌动蛋白基因cDNA序列,与其他昆虫肌动蛋白基因核苷酸序列的相似性在86%以上,且该基因在华山松大小蠹幼虫、蛹、成虫3个发育阶段以及成虫的头、胸、腹、足、翅等组织中表达稳定,且表达量无明显差异。【结论】成功获得了华山松大小蠹β-肌动蛋白基因片段,且该基因片段可以作为基因表达差异性研究的内参基因。     

马铃薯甲虫3个烟碱型乙酰胆碱受体α亚基基因的克隆及表达分析

通过克隆马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)基因的全长序列并分析其时空表达量差异,为马铃薯甲虫nAChR亚基功能以及对新烟碱类药剂靶标抗性机制的研究提供重要基础。根据马铃薯甲虫转录组数据,采用RACE克隆技术获得3个马铃薯甲虫nAChRα基因的cDNA全长序列;通过相似性和进化树分析验证这3个基因的亲缘关系;利用实时荧光定量PCR技术分析这些基因在马铃薯甲虫不同发育阶段和成虫不同部位的表达情况。本试验验证并获得3条nAChRα亚基片段序列,经BLAST比对得出其分别属于nAChRα4、nAChRα7和nAChRα9亚基,进一步克隆得到这些基因的全长序列,分别命名为Ldα4、Ldα7和Ldα9。3个亚基基因编码的氨基酸序列与已知的昆虫同源序列有较高的相似性。其中Ldα4、Ldα7和Ldα9与赤拟谷盗的相似性最高,分别为87%、89%和47%;Ldα4、Ldα7和Ldα9亚基基因在马铃薯甲虫成虫中主要集中于头部和胸部,在蛹期、幼虫和成虫中均有表达,但表达量有明显差异,Ldα4、Ldα7和Ldα9分别在成虫、3龄幼虫和蛹期阶段的表达量最高。克隆获得的3个基因Ldα4、Ldα7和Ldα9具备nAChRα基因的典型结构特征,且与赤拟谷盗的相应基因位于同一分支,进一步验证了同为鞘翅目昆虫的亲缘关系。Ldα4、Ldα7和Ldα9亚基基因在马铃薯甲虫不同生长阶段的表达量有差异,推测这些亚基基因在马铃薯甲虫的不同生长发育中发挥特定作用。     

拟黑多刺蚁5-HT2A受体基因cDNA的克隆及表达

【目的】克隆拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger)5-HT2A受体基因的cDNA序列,并对其核苷酸序列和系统进化进行分析,检测其在拟黑多刺蚁不同发育阶段幼虫和不同品级成虫mRNA的表达情况,为探究5-HT2A受体基因对拟黑多刺蚁生长发育的调控规律提供证据。【方法】从拟黑多刺蚁中提取总RNA,RT-PCR扩增并克隆Pv5-HT2A受体基因;用ProtParam预测蛋白质序列,Blast比较蛋白质序列同源性,用Clustal X进行核酸和氨基酸序列比对,MEGA 6.0比邻法生成系统进化树。利用荧光实时定量PCR检测Pv5-HT2A受体基因在拟黑多刺蚁不同发育阶段幼虫及不同品级成虫mRNA的表达水平。【结果】克隆得到Pv5-HT2A受体基因的cDNA序列,全长2 965bp,开放阅读框长1 926bp,编码641个氨基酸。疏水性分析显示,Pv5-HT2A受体氨基酸具有7个跨膜疏水区,属于典型的G蛋白偶联受体类型。系统发育分析表明,拟黑多刺蚁与红收获蚁的亲缘关系最近,相似度达69%。荧光实时定量PCR结果显示,拟黑多刺蚁5-HT2A mRNA在不同发育阶段和不同品级成虫中均有表达,其中卵、3龄幼虫及蛹期的表达量较高;成虫中,雄蚁表达量最高,雌蚁的表达量最低。【结论】拟黑多刺蚁与其他昆虫的5-HT2A受体基因存在相关性,推测5-HT2A受体基因对拟黑多刺蚁的生长发育具有一定调节作用。     

松墨天牛dynamin-1-like protein基因的鉴定及表达分析

为了探讨GTP酶超基因家族中dynamin-1-like protein基因在昆虫中的表达特性,以松墨天牛为研究对象,从已构建的cDNA文库中筛选到松墨天牛dynamin-1-like protein基因,命名为Ma DLP1(Gen Bank:KU245763)。该序列长为2 133 bp,编码710个氨基酸。由此预测的蛋白质二级结构主要由α螺旋与无规则卷曲组成,其次是β片层与β转角;Ma DLP1基因编码蛋白质,定位于细胞核。通过DNAMAN软件比对发现Ma DLP1与赤拟谷盗的DLP1同源性最高,为82%,且存在3个保守酶域;用Clustal X和MEGA4.0构建系统发育树,显示松墨天牛与赤拟谷盗处在同一分支。RT-qPCR分析结果显示,Ma DLP1在各虫态不间断表达,幼虫期在5龄幼虫中表达量最高,化蛹期间表达量先上升后下降,羽化期间表达量表现为先上升后下降,并在初羽化的成虫中表达量达到最大值;Ma DLP1在幼虫和成虫头部表达量较高,且在幼虫脂肪体中表达最高;成虫的足、翅、触角和卵巢中也都有表达。说明Ma DLP1的表达与松墨天牛的完全变态发育相关。     

玉米大斑病菌MAPK基因St IME2的基因组定位、蛋白质结构预测及表达分析

【目的】确定玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)MAPK基因St IME2在基因组中的位置;系统解析目的蛋白质St Ime2的结构特征;分析玉米大斑病菌St IME2在不同发育时期及不同胁迫条件下(温度、氧胁迫、高渗胁迫)的表达,为深入研究该基因的功能奠定基础。【方法】通过本地Blast搜索玉米大斑病菌基因组数据库,确定St IME2在基因组的精确位置;利用Prot Param在线分析St Ime2蛋白的理化性质,利用SOMPA在线软件预测St Ime2蛋白的二级结构。通过PHYRE2在线服务器对St Ime2蛋白的三维结构进行预测。利用半定量RT-PCR方法分析不同发育时期及不同胁迫条件下St IME2的表达。【结果】玉米大斑病菌St IME2为一类与酿酒酵母中Sc IME2具有较高同源性的基因,为在植物病原真菌中鲜有报道的MAPK基因。该基因的ID为98 105,位于scaffold_7正链的1 560 184—1 562 574位置,St Ime2蛋白具有MAPK类蛋白激酶的特征性保守结构域,其二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,β-折叠较少且主要存在于N端,其三级结构具有1个较小的N端域和1个较大的C端域;该基因在病菌分生孢子时期表达量最高,附着胞发育时期表达量最低。将病菌置于不同温度条件下处理,发现培养温度为28℃时St IME2表达量达到最高。在高渗胁迫条件下,随Na Cl浓度的增加,St IME2的表达量逐渐增加,但在较高胁迫条件下(0.8 mol·L-1 Na Cl),该基因表达几乎被完全抑制。经H2O2胁迫处理后,St IME2的表达量随H2O2的浓度增加而增强,在10 mmol·L-1 H2O2的处理下表达量最高。【结论】玉米大斑病菌St IME2位于scaffold_7正链的1 560 184—1 562 574位置。St Ime2蛋白具有MAPK激酶的所有特征性保守结构域,为一类功能鲜有报道的MAPK蛋白激酶。该基因在玉米大斑病菌分生孢子时期表达量最高,推测可能在调控病菌分生孢子发育过程中起重要作用。该基因的表达水平可随培养温度的变化而变化,28℃表达量最高。该基因可能参与病菌的高渗胁迫及氧胁迫反应。     

玉米大斑病菌漆酶基因Stlac2结构分析及原核表达

【目的】对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)漆酶基因Stlac2进行生物信息学分析,推测其蛋白功能,探究木质素降解过程中产生的小分子物质对Stlac2表达的影响,并对其进行克隆及原核表达,以便深入研究该基因在病菌生长、发育及致病过程中的作用。【方法】通过NCBI查询获得玉米大斑病菌EOA90070(Stlac2)基因的全序列,通过Clustal X与马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)PbrB(PMAA_082060)基因、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Abr2(AFUA_2G17530)基因、构巢曲菌(Aspergillus nidulans)YA(AN6635)基因等漆酶家族基因进行蛋白序列比对,查看Stlac2中的铜离子结合位点,利用在线软件SOPMA和ProtParam对其二级结构及理化性质进行检测,通过SWISS-MODEL对Stlac2蛋白质的三维结构进行预测,采用SAVES对三维结构进行评价。通过对ABTS的氧化试验确定木质素降解过程中产生的小分子物质对玉米大斑病菌漆酶产量的影响;利用RT-qPCR方法分析小分子物质对Stlac2表达规律的影响;采用原核表达系统,以pET-30a表达载体为框架,对其进行原核表达,并将表达蛋白纯化,以ABTS为底物,420 nm下检测漆酶活性。【结果】Stlac2具有典型的Cu离子结合位点,与漆酶典型的Cu离子结构域相似。其蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为18.59%、25.63%、11.91%和43.86%,分子量为61.64 k D,等电点为5.00,平均疏水性为-0.37,表明其为亲水蛋白。当在PDA中添加0.01 g·L~(-1)香草醛、4-羟基苯甲醛、丁香醛、香草酸、4-羟基苯甲酸和香兰素时,玉米大斑病菌胞外漆酶的产量为香草酸香兰素4-羟基苯甲醛4-羟基苯甲酸丁香醛对照。而在4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸存在时,玉米大斑病菌Stlac2的相对表达量明显升高,约为对照的5—8倍。利用原核表达系统,在67 k D处成功诱导表达出一条特异性蛋白条带,大量表达纯化后,漆酶活性为(40.7±0.3)U·L~(-1)。【结论】阐明了Stlac2的生物信息学特性,初步断定其为漆酶基因;4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸可显著提高Stlac2相对表达量,表明其在木质素降解过程中起到了一定的作用;该基因所编码的蛋白可通过pET-30a原核表达系统表达,体外漆酶活性可达(40.7±0.3)U·L~(-1),该研究结果为后期研究蛋白性质打下了基础。     

桃小食心虫鱼尼丁受体基因克隆及表达模式分析

【目的】二酰胺类杀虫剂的作用靶标鱼尼丁受体（ryanodine receptor, RyR）是目前所知的最大的离子通道蛋白,该受体可控制细胞内Ca²⁺的释放,对细胞内Ca²⁺的稳定起着关键作用。克隆获得桃小食心虫鱼尼丁受体基因（CsRyR）全长序列,进一步解析该基因在桃小食心虫(Carposina sasakii)各发育阶段的表达模式。【方法】通过同源序列比对的方法,利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）获得该基因的全长cDNA序列;应用生物信息学软件对该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列、功能结构域等信息进行预测分析,并基于最大似然法构建该基因与其他昆虫相关基因序列的系统发育树,明确其系统进化关系。分别提取桃小食心虫各发育阶段RNA,以GAPDH为内参基因,应用RT-qPCR技术,解析CsRyR在桃小食心虫各发育阶段（卵、幼虫、蛹和成虫）的表达模式。【结果】桃小食心虫CsRyR的cDNA全序列长度为15 766 bp,开放阅读框15 405 bp,编码5 134个氨基酸。氨基酸序列比对结果显示,CsRyR与脊椎动物RyRs的一致度分别为45%-47%;与秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）RyR的一致度也为46%。在昆虫RyRs中,与鳞翅目一致度为91%-94%,与同翅目、双翅目昆虫一致度均为79%。系统发育树显示该基因编码的蛋白质与鳞翅目夜蛾科和螟蛾科害虫RyRs亲缘关系最近。结构域分析结果显示,CsRyR具有RyR的典型结构域,如位于C-末端的6个跨膜结构域（AA 4 467-5 029）、释放Ca²⁺的通道形成基序GVRAGGGIGD、Ca²⁺结合位点EF-hand和3个ATP结合位点GXGXXG等。二酰胺类杀虫剂可能的作用位点AA 183-290（BmRyR）,AA 4 610-4 655（DmRyR）和4 946G（PxRyR）在CsRyR中无特殊性。此外,CsRyR中存在AA 2 490- 2 496 TQAPRPG和5 131-5 134 SQAK两个基序,在其他物种中均没有发现。RT-qPCR分析结果表明,CsRyR在蛹期表达量最高,分别是1日龄卵、6日龄卵、初孵幼虫、老熟幼虫和成虫的25.19、7.73、6.48、4.74和3.58倍。【结论】克隆了CsRyR基因全长cDNA序列,证明其表达具有发育阶段特异性。     

苹果MdMYB9、MdMYB11表达及其蛋白互作分析

【目的】克隆苹果(Malus domestica)中的TT2同源基因MdMYB9和MdMYB11,分析它们的序列特征,并对这两个基因在不同组织器官及光诱导条件下的表达特性及蛋白互作进行分析,为进一步解析这两个基因的功能奠定基础。【方法】采用同源克隆的方法分离得到MdMYB9和MdMYB11;利用DNAMAN软件对这两个蛋白的分子量、等电点等进行预测及对氨基酸序列进行分析,同时利用MEGA4.0软件构建这两个蛋白与拟南芥R2R3家族MYB蛋白的系统进化树;利用定量PCR检测这两个基因在不同组织器官、不同发育时期苹果果皮及种子和光照处理条件下的表达特性;利用酵母双杂交检测这两个MYB蛋白与花青苷合成相关蛋白MdbHLH33之间的互作关系。【结果】序列分析显示,MdMYB9开放阅读框长度为873 bp,编码290个氨基酸残基,与拟南芥TT2序列同源性为38.13%;MdMYB11开放阅读框为861 bp,编码286个氨基酸残基,与TT2同源性为32.44%;蛋白结构分析显示,MdMYB9和MdMYB11蛋白的N端都含有保守的R2R3功能域;进化树分析显示,这两个MYB蛋白都与拟南芥原花青苷合成相关蛋白TT2聚在同一个分支;荧光定量结果表明,MdMYB9和MdMYB11在苹果根、茎、叶和花中均有表达,但各器官中表达水平存在差异;同时,这两个基因在不同发育时期的种子及果皮中都有表达,其中均在发育中期表达水平最高;此外,光照诱导条件下MdMYB9和MdMYB11的表达变化无明显差异。酵母双杂交结果显示,MdMYB9和MdMYB11均能够与花青苷合成相关蛋白MdbHLH33相互作用。【结论】苹果MdMYB9和MdMYB11属于R2R3类MYB蛋白,在不同组织器官及不同发育时期的果皮和种子中都有表达,并与MdbHLH33蛋白相互作用。     

亚洲璃眼蜱成蜱不同发育期miR-451与MIF表达谱的动态分析

【目的】microRNA （miRNA）作为一类内源性的非编码RNA,仅有18-25 nt,其广泛存在于动植物细胞中,可诱导生物基因沉默,参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。以亚洲璃眼蜱为研究对象,对miR-451及其靶基因（巨噬细胞游走因子, MIF）在相互作用关系进行分析。【方法】参考miR-451成熟体序列（AAA CCG UUA CCA UUA CUG AGU UU）来自研究单元亚洲璃眼蜱高通量测序所获得的结果。根据该成熟体序列设计stem-loop及PCR引物,RT-PCR扩增获得蜱源性miR-451序列;并对不同物种来源的miR-451序列特征进行分析。基因合成方法获得抑制miR-451的dsRNA序列,用于亚洲璃眼蜱饥饿成蜱体内注射。参考美洲钝眼蜱MIF基因（登录号：AF289543.2）,设计亚洲璃眼蜱的特异性实时荧光定量引物,以β-actin作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR方法检测注射dsRNA后亚洲璃眼蜱饥饿成蜱不同发育时间点MIF基因的表达水平,以及miR-451的表达谱特征。【结果】琼脂糖凝胶电泳检测miR-451的PCR产物条带与预期大小一致,为72 nt。不同物种来源的miR-451具有较高的保守性,特别是种子序列极度保守,仅在短尾负鼠miR-451成熟体的19位点处存在A→U的突变。miR-451的RNA干扰实验证实,0-30 h miR-451表达逐渐上调,6 h达到最高值,其拷贝数为1.0×108。随后表达丰度逐渐降低。30 h其表达水平与PBS对照组相同。48-60 h miR-451再次出现一个表达上调微小变化过程。而miR-451抑制后的MIF直到30 h才有表达的上调,42 h达到峰值（拷贝量仅为9.0×103）,此后其表达规模受到抑制,48 h时与PBS对照组水平一致。84 h后表达才逐渐上调,直到90 h达到峰值,并呈现正态分布趋势。【结论】利用RT-PCR获得亚洲璃眼蜱成蜱阶段miR-451序列,生物信息学方法分析了miR-451序列在不同物种间具有较高保守性。miRNA的保守性决定其靶标基因的特异性,因此,以上结果提示miR-451在动物细胞中可能扮演重要的生物学功能,是MIF功能发挥的一个重要调控因子。MIF作为miR-451靶标基因,其功能的实现可能受该miRNA的调控。基于此类推测qPCR及RNA干扰分析表明,miR-451参与了MIF的表达调控。且是一种负调控作用。当miR-451表达量升高时,MIF表达量明显下调。此研究首次证实miR-451在亚洲璃眼蜱成蜱发育阶段的表达是一种普遍现象,且对MIF存在负调控作用。这一研究为后期miR-451参与蜱的免疫应答及miR-451与靶标基因的相互作用机制提供了参考。同时证明,miRNA参与基因功能的调控具有一定的特异性和时序性。     

气味受体基因Orco在中华蜜蜂雄蜂触角中的表达及定位分析

【目的】昆虫气味受体（odorant receptors, Ors）在其发挥嗅觉识别过程中采用的是配体门控离子通道信号传导机制,这一离子通道是由一个特定的共受体与一个普通气味受体结合为异源二聚体而形成的。其中,气味共受体（odorant receptor coreceptor, Orco）是一个十分独特的家族,在不同种类昆虫中高度保守,并在调控昆虫的嗅觉行为方面发挥关键作用。论文在对中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）工蜂Orco研究基础之上,进一步探讨雄蜂Orco的表达特性。【方法】采集中蜂1日龄雄蜂的触角、头（去除触角）、胸、腹、足5部分组织,以及不同发育阶段的幼虫、蛹及成蜂触角。提取各样本的总RNA,利用real-time quantitative PCR（qPCR）技术鉴定Orco在雄蜂不同组织及不同发育时期的表达谱;采集1日龄雄蜂触角制备冰冻切片,合成地高辛标记的寡核苷酸探针,利用原位杂交技术对Orco在雄蜂触角中的表达进行细胞定位分析。【结果】qPCR分析结果表明,Orco转录本在不同组织中的表达量表现为触角>头>足>腹>胸,其中触角表达量约为头部的100倍;Orco在雄蜂不同发育阶段均有表达,其中幼虫期和蛹期表达量较低,羽化后开始逐渐升高,性成熟后维持在一个较高的水平。此外,结合前期工蜂荧光定量试验数据,分析得到Orco在雄蜂触角中的表达量极显著高于工蜂触角表达量（P＜0.01）。原位杂交结果显示,Orco阳性杂交信号大量表达于雄蜂触角的板型感器和毛型感器的神经元细胞中。【结论】气味受体基因Orco在中蜂雄蜂的触角中大量表达,且在性成熟后表达量达到高峰。结合前期研究结果,推测Orco在中蜂中是偏雄性表达的。     

Smads与Hippo通道中YAP1基因在湖羊肌肉组织中时空表达研究及关联分析

【目的】通过在mRNA表达水平检测TGF-β/smad信号通路基因在湖羊肌肉组织中时空表达,来探究各基因的表达规律及内在联系。【方法】利用荧光定量PCR技术对湖羊Smads基因在出生后不同生长阶段（2日龄,2月龄和6月龄）不同性别的两种不同骨骼肌（腓肠肌、趾长伸肌）的相对表达进行分析,以及对湖羊Smad家族（Smad2、Smad3、Smad4、Smad7）基因、YAP1基因的表达相关性分析。【结果】湖羊肌肉TGF-β/smad信号通路中Smads基因时空表达规律研究发现：Smads在不同肌肉组织的表达分析中,Smads在腓肠肌中的表达高于趾长伸肌,可能与这两种骨骼肌分属不同部位有关;Smads在不同月龄的表达分析中,Smad2、Smad3、Smad4在2日龄的表达量均高于其它月龄,而Smad7在2日龄的表达量低于6月龄,2月龄时表达量最低;在不同性别的表达分析中,Smads在2日龄公羊中的表达量高于母羊,Smad2、Smad4、Smad7在2月龄和6月龄则低于母羊;Smad3在不同生长阶段中公羊表达量高于母羊。湖羊肌肉TGF-β/smad信号通路中Smads、YAP1基因表达相关性研究发现：在2日龄腓肠肌中,Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）;在2月龄腓肠肌中,Smad2的表达与YAP1存在显著正相关（P＜0.05）,Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）;在6月龄腓肠肌中,Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）;在腓肠肌的不同生长阶段中,Smad3的表达YAP1存在极显著负相关（P＜0.01）,Smad2、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）。在2日龄趾长伸肌中,Smad3的表达与YAP1存在极显著正相关（P＜0.01）,Smad2、Smad4、Smad7的表达与YAP1存在显著正相关（P＜0.05）;在2月龄趾长伸肌中,Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）;在6月龄趾长伸肌中, Smad7与YAP1存在极显著正相关（P＜0.01）;Smad2、Smad3、Smad4的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）;在趾长伸肌的不同生长阶段中,Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1存在极显著正相关（P＜0.01）。【结论】由此推断不同组织、生长阶段以及性别等因素均可影响Smads在肌肉中的表达;在湖羊这两种不同肌肉组织中,Hippo通道中YAP1基因可通过参与调控TGF-β/smad信号通路而参与肌肉的增殖和分化过程。     

紫花苜蓿不同发育时期次生壁合成调控的转录组分析

【目的】探讨紫花苜蓿次生壁合成的基因网络调控变化和表达模式,确定一些关键候选基因和转录因子,为紫花苜蓿次生壁加厚调控网络的分子机制研究奠定基础。【方法】对‘中苜1号’紫花苜蓿分枝期（S1）、现蕾期（S2）、初花期（S3）和盛花期（S4）的茎进行近红外光谱法测定次生壁主要物质含量和Illumina HiSeq^TM 2500高通量转录组测序。以紫花苜蓿的近缘物种蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）基因组作为参考基因组进行序列比对并组装构建转录本。利用FPKM法计算基因表达量,以Fold change（差异表达倍数）≥2或≤0.5（表达上调或下调）、FDR（false discover rate）≤0.05为筛选条件,在3个相邻时期转录组比较组合中（S2vs S1,S3 vs S2,S4 vs S3）筛选差异表达基因。通过Gene Ontology数据库和KEGG Pathway数据库对紫花苜蓿不同发育时期差异表达基因的功能和参与的代谢途径进行注释。【结果】共获得41 734个基因在紫花苜蓿不同发育时期的转录表达情况,27个功能注释与紫花苜蓿纤维素、木质素合成密切相关的基因差异表达,其变化趋势与纤维素和木质素含量测定结果基本一致,即随着生长发育时期的变化,表达水平逐渐提高。研究表明,初花期是紫花苜蓿次生壁合成调控的转折期,纤维素和木质素含量与其合成基因表达量在初花期均显著提高。MTR_2g016630（Ces）和MTR_7g103590（Ces A1）等纤维素合成酶基因表达水平在初花期显著上升,木质素合成途径中,MTR_1g064090（PAL1）、MTR_1g111240（C4H）和MTR_2g104960（CCR）基因表达量在初花期或盛花期相比分枝期上调表达倍数达到10倍以上。本研究中27个与植物生长发育相关的转录因子在紫花苜蓿不同发育时期差异性表达,其中NAC家族和MYB家族转录因子有18个,也有少量WRKY、BHLH、ERF、C3H等转录因子。【结论】获得‘中苜1号’紫花苜蓿在4个生长发育时期茎的基因表达谱数据,共获得54个差异表达基因,其中稳定上调基因24个,稳定下调基因30个。这些基因很有可能参与紫花苜蓿次生壁的合成调控。     

棉铃虫磷脂酰乙醇胺结合蛋白的克隆及表达分析

【目的】克隆获得棉铃虫（Helicoverpa armigera）磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein,PEBP)的cDNA序列,分析HaPEBP在棉铃虫体内的表达规律,检测2-十三烷酮处理条件下棉铃虫体内HaPEBP的变化情况,为进一步明确棉铃虫PEBP的功能和选择该基因作为调控棉铃虫种群数量的分子靶标提供依据。【方法】利用RACE技术从棉铃虫6龄幼虫的中肠组织中扩增得到HaPEBP的cDNA序列,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行分析。将HaPEBP的ORF序列连接至pET32a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后检测目的蛋白的表达形式,并通过镍柱的亲和层析纯化融合蛋白。最后通过实时荧光定量PCR检测棉铃虫幼虫不同时期和6龄幼虫不同组织中HaPEBP的表达规律,以及2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后中肠内HaPEBP的变化规律。【结果】获得的HaPEBP cDNA序列长760 bp,其中ORF为588 bp,编码195个氨基酸,蛋白质分子量和等电点分别为21.76 kD和5.93。氨基酸序列分析表明HaPEBP无信号肽、跨膜结构域和二硫键,是一个由4个α螺旋和9个β折叠片组成的胞质单体蛋白。将BL21(DE3)-pET32a-HaPEBP重组菌用1 mmol·L^-1的IPTG在37℃条件下诱导4 h,约40 kD的融合蛋白His-HaPEBP能以可溶的形式存在于重组菌中。按照同样的方法诱导1 L的重组菌,将超声处理后的上清液与Ni-NTA柱结合,进行咪唑缓冲液梯度洗涤,200 mmol·L^-1的咪唑洗涤两次后得到约40 kD的单一蛋白,与融合蛋白的大小一致。将此流出液超滤浓缩,获得183.3 ng·μl^-1的融合蛋白,能被抗His-Tag的单克隆抗体识别发生免疫反应。HaPEBP在棉铃虫幼虫的1-6龄期和预蛹期均表达,且6龄幼虫的表达量最高。该基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠、头部和体壁中也均有表达,且脂肪体内的表达量最高。不同浓度的2-十三烷酮处理后,棉铃虫6龄幼虫中肠内HaPEBP的表达量均有所降低;低浓度(2.5和5 mg·g^-1)在6 h就能降低HaPEBP的表达量,其mRNA含量随着时间的延长逐渐增加;而高浓度(10和15 mg·g^-1)在12 h才会降低HaPEBP的表达量,其mRNA含量随着时间的延长先下降后上升。【结论】克隆分析了HaPEBP,利用大肠杆菌系统表达出可溶的融合蛋白His-HaPEBP,并通过镍柱-咪唑纯化法得到了高纯度的融合蛋白,时空表达分析显示HaPEBP在棉铃虫6龄幼虫和脂肪体中表达量最高,2-十三烷酮处理6龄幼虫后中肠内HaPEBP的表达量显著降低。