苹果MdMYB32通过自身EAR抑制序列抑制花青苷的生物合成

【目的】研究苹果MYB转录因子家族MdMYB32的生物学信息、表达水平及其在花青苷合成中的功能,旨在为进一步完善花青苷合成代谢机理提供参考。【方法】以新疆红肉苹果杂种一代优系为试材,克隆MdMYB32,分析其进化树和蛋白序列;测定其在不同果实及在不同胁迫处理下的表达水平,通过转基因验证其在花青苷合成中的功能,并通过酵母单杂交分析其互作关系。【结果】qRT-PCR分析表明MdMYB32在花青苷含量高的‘红脆9号’苹果中表达水平较低,而在花青苷含量低的‘红脆6号’苹果中表达水平较高,与花青苷含量呈负相关;且盐胁迫和冷胁迫均能抑制MdMYB32的表达;在进化上,MdMYB32与AtMYB32,MdMYB16和AtMYB4在同一个进化枝上,且MdMYB32蛋白序列在C端含有一个EAR抑制序列;在红肉愈伤中过表达MdMYB32能够抑制ANS的表达水平,降低花青苷含量,而过表达切除EAR抑制序列后的LESMdMYB32后,不能明显改变ANS的表达水平和花青苷含量;酵母单杂交和Chip-PCR分析表明MdMYB32和LESMdMYB32均能够结合ANS的启动子。【结论】MdMYB32能够结合ANS启动子,并通过自身EAR抑制序列抑制花青苷的生物合成。     

红肉苹果分裂素响应基因MdMYB308的克隆与表达分析

【目的】细胞分裂素是调控植物花青苷合成的重要激素,从新疆红肉苹果杂种一代优系‘紫红3号’中克隆得到分裂素响应基因Md MYB308,研究其在细胞分裂素调控苹果花青苷合成中的作用,为进一步完善红肉苹果育种的理论与技术体系提供参考。【方法】以红肉苹果‘紫红3号’(新疆红肉苹果与‘富士’杂交1代)的红色幼嫩叶片为外植体诱导的红色愈伤组织为试材,设计引物利用PCR克隆Md MYB308,对其进行生物信息学分析;并用不同浓度细胞分裂素处理,采用荧光定量PCR分析Md MYB308及花青苷合成相关基因的表达;通过酵母双杂交试验、荧光双分子互补试验验证Md MYB308与Mdb HLH3的互作关系。【结果】在‘紫红3号’中克隆获得Md MYB308全长,其包含768 bp完整的开放阅读框,编码255个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为28.37 kD,等电点为8.94;系统进化树分析表明,Md MYB308与At MYB4、Fa MYB1、At MYBL2在同一个进化枝上,氨基酸序列比对发现,Md MYB308蛋白存在EAR抑制序列;提高6-BA浓度有利于苹果愈伤组织花青苷的累积,与无细胞分裂素处理相比,1 mg·L~(-1) 6-BA处理愈伤花青苷合成结构基因Md CHS、Md DFR、Md UFGT与转录基因Md MYB10、Mdb HLH3的表达量升高,而Md MYB308表达被抑制;酵母双杂交与荧光双分子互补试验表明,Md MYB308与Mdb HLH3能相互作用。【结论】细胞分裂素(6-BA)可能通过抑制Md MYB308的表达影响Md MYB308与Mdb HLH3的结合从而促进花青苷的累积。     

新疆红肉苹果转录因子MsMYB10基因的克隆、序列分析及原核表达

【目的】克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f.neidzwetzkyana(Dieck)Langenf]MYB10转录因子基因,进行序列分析和原核表达研究,为进一步探索红色发育机理及选育新的栽培红肉苹果奠定理论基础。【方法】根据MdMYB10基因编码区设计1对特异引物,以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得1个约700bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该基因片段连接到原核表达载体pET-30a(+)中,构建融合表达质粒,转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长包含完整的cDNA开放读码框732bp,编码244个氨基酸,命名为MsMYB10。MsMYB10分子量为28.56kD,等电点为8.41,GenBank登录号为GQ500894。该蛋白具有R2R3MYB结构域,结构域中有保守的色氨酸残基,在C端有1个富含酸性氨基酸的转录激活区。与已知MdMYB10的氨基酸序列的同源性为98%。另外,MsMYB10没有信号肽,具有核定位信号。进化树分析表明,MsMYB10与调控花青苷合成的转录因子MdMYB10亲缘关系最近,处在同一进化枝。SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】克隆了新疆红肉苹果转录因子MsMYB10基因,并可在大肠杆菌中转化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定了试验基础。     

苹果MdJAZ1基因表达及蛋白互作分析

【目的】克隆苹果茉莉酸信号途径阻遏因子基因MdJAZ1,并对其表达及蛋白互作进行分析,为进一步研究MdJAZ1的功能奠定基础。【方法】以TIFY及Jas功能域为探针,在苹果基因组中进行比对,获得多个同源基因,对其中的一个基因设计引物进行克隆;利用DNAMan软件对该基因编码蛋白的分子量、等电点进行预测;利用SMART在线分析软件对该蛋白的功能域进行分析;利用MEGA5.0对该蛋白与拟南芥JAZ家族蛋白构建系统发育树;利用荧光定量PCR分析该基因在苹果不同组织器官、茉莉酸甲酯及创伤处理下的表达情况;利用PlantCARE在线软件分析该基因启动子区域的顺式作用元件;利用酵母双杂交系统检测MdJAZ1蛋白的二聚化及其与拟南芥AtCOI1蛋白的互作关系。【结果】MdJAZ1开放阅读框为1 149 bp,编码382个氨基酸残基,其蛋白的分子量为40.536 kDa,等电点9。氨基酸序列分析显示,该蛋白包含保守的TIFY及Jas结构域;系统发育树分析显示,MdJAZ1蛋白与拟南芥JAZ家族AtJAZ3、AtJAZ4亲缘关系最近;qPCR结果显示,MdJAZ1在苹果的根、茎、叶、花及果实等组织中都有表达,但表达水平存在明显差异,其中根中的表达量最高,果实中的表达量最低;该基因还能被茉莉酸甲酯及创伤处理诱导表达,均在1 h内达到最高表达水平;启动子分析显示,MdJAZ1启动子中包含多个ABA、乙烯、抗病及逆境胁迫等响应元件,此外,还包含多个MYB结合位点;酵母双杂交结果显示,MdJAZ1蛋白能与其自身相互作用形成同源二聚体,还可与拟南芥中同源性较近的AtJAZ3、AtJAZ4蛋白相互作用形成异源二聚体,并且在冠菌素存在时,MdJAZ1蛋白可与拟南芥F-box蛋白AtCOI1相互作用。【结论】MdJAZ1受茉莉酸甲酯及创伤诱导表达,其蛋白能形成同源及异源二聚体,且在冠菌素存在时可与AtCOI1互作。     

苹果抗性相关的谷胱甘肽转移酶基因MdGSTU1的生物信息学和表达分析

【目的】克隆苹果（Malus domestica Borkh.）中抗苹果轮纹病相关的编码谷胱甘肽转移酶基因MdGSTU1,研究其在不同组织器官及不同逆境处理条件下的表达特性,为解析该基因的抗逆功能奠定基础。【方法】基于抗轮纹病相关的EST序列,通过在NCBI进行比对,得到一个谷胱甘肽转移酶（GST）基因相关的EST片段;然后在苹果基因组数据库中进行比对,获得该GST的编码框序列（coding sequence,CDS）,同时,设计RACE引物,克隆该基因的UTR序列;利用MEGA5.0软件对该GST蛋白与拟南芥GST家族蛋白成员进行系统进化树分析,使用DNAMAN软件对该蛋白的分子量、等电点等进行预测,并对其氨基酸序列进行分析;采用荧光定量PCR检测该基因在不同组织中的表达以及该基因在盐、模拟干旱和苹果斑点落叶病原菌处理条件下的表达特性;克隆该基因的启动子,利用PlantCARE软件在线分析该基因启动子上的顺式作用元件。【结果】进化树分析显示该GST与拟南芥中GST家族的U亚家族成员亲缘关系最近,故被命名为MdGSTU1;MdGSTU1的CDS为666 bp,编码221个氨基酸残基,其蛋白分子量为25.41 kDa,等电点为5.28;RACE结果显示该基因3'UTR区域为135 bp;蛋白序列及结构分析显示,其与拟南芥GST家族蛋白相同,该蛋白也包含保守的谷胱甘肽-S-转移酶的N端及C端结构域;PCR结果显示,MdGSTU1在根、茎、叶、花、果各组织中均有表达,但根中的表达水平最高,同时,该基因能够被150 mmol·L^-1 NaCl和20%的PEG诱导表达,均在1 h时表达量达到最高值;另外,苹果斑点落叶病原菌也能诱导MdGSTU1的表达,表达量在病菌处理8 h时达到最大;启动子分析显示MdGSTU1启动子区域含有多个抗性相关的作用元件,其中包括ABA响应元件、厌氧响应元件、GA响应元件、SA响应元件、JA响应元件以及防御和逆境响应元件;此外,该启动子上还包含多个MYB转录因子结合位点。【结论】MdGSTU1属于植物tau亚家族（GSTU）成员,生物及非生物逆境胁迫均可诱导该基因的表达。     

大豆转录因子基因GmMYB111的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆MYB转录因子基因,进行序列分析和表达模式分析,并对其功能进行鉴定。【方法】通过对盐胁迫相关的数字表达谱（DGEP）数据分析,获得一个MYB转录因子GmMYB111;以盐胁迫处理的cDNA为模板,利用RT-PCR法分离克隆MYB基因cDNA编码序列;根据GmMYB111蛋白序列进行同源性搜索,得到与GmMYB111蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用 MEGA5.05对GmMYB111蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在大豆中受非生物胁迫诱导表达情况及组织特异性表达情况;利用拟南芥原生质体转化体系分析GmMYB111的亚细胞定位情况;通过酵母杂交系统检测其转录激活活性以及体外结合活性。【结果】根据前期江苏省农业科学院农业生物技术研究所盐土农业研究室盐胁迫相关的数字表达谱（DGEP）数据获得盐胁迫响应显著上调（27倍）的GmMYB111,利用RT-PCR方法从栽培大豆根组织中克隆该基因片段,序列比对发现其与已公布的Williams82基因组数据库序列一致,生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有MYB类转录因子的共同特征,其N端具有R2、R3两个MYB结构域,同时其C-端还存在一个富含酸性氨基酸的转录激活区;系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白与GmMYB76、GmMYB12a以及苜蓿MtMYB61的亲缘关系最近; GmMYB111在大豆中的表达受高盐、干旱、冷害和ABA诱导表达,实时荧光定量PCR检测结果显示,在高盐和冷害胁迫下,GmMYB111呈上调表达,在干旱胁迫诱导后呈先上调后下调的表达模式,在ABA诱导下其表达量呈现波动式上调和下调表达;时空表达分析表明,GmMYB111为组成型表达,在大豆幼苗期和成熟期的表达量相对较强,成熟期的表达量相对较低,从不同组织来看,GmMYB111在茎、叶和花中表达量最高,在根中表达量相对较低,在豆荚中不表达;亚细胞定位结果显示GmMYB111定位于细胞核中,为典型的转录因子;酵母杂交系统检测表明,GmMYB111具有转录激活功能,并且能够与顺式作用元件TAACTG基序相结合。【结论】GmMYB111为典型的R2R3-MYB转录因子基因,具有转录激活活性及DNA结合活性,在大豆中的表达可能与大豆的非生物胁迫和ABA信号转导途径有关,推测其可能通过调节下游基因的表达来调控大豆对非生物胁迫的应答。     

白菜硫代葡萄糖甙合成中MAM 的进化分析

【目的】探索硫代葡萄糖甙合成中关键基因-甲基硫代烷烃基苹果酸合成酶（methylthioalkylmalate,MAM）基因在白菜基因组中的进化情况,为研究白菜MAM的功能提供理论指导。【方法】根据白菜数据库BARD信息分析拟南芥、盐芥和白菜MAM的共线性关系,利用MEME在线软件预测MAM序列的高度保守基序（motif）,通过R软件分析93份白菜材料MAM的表达模式,并利用MEGA5.05软件构建MAM的系统进化树。【结果】白菜的3个亚基因组均保留着MAM的同源基因。其中与拟南芥具有共线性的5个同源基因可能源自基因组古三倍化复制,其它两个同源基因可能是由转座扩增产生的;基序分析结果表明,与拟南芥的MAM相比,白菜的MAM同源基因存在基序的缺失,并且大多发生在序列的两端;在93份白菜材料中,白菜MAM同源基因之间的表达量有很大差异,Bra021947与Bra018524只在少数材料中存在极低的表达,并且Bra029356的表达量低于可检测水平;进化树分析发现,除Bra018524外,其他的白菜MAM同源基因与拟南芥的MAM聚集在不同的分支上。【结论】白菜的MAM可能在拟南芥和白菜物种分化之后独立起源并进化出不同的功能。     

新疆红肉苹果转录因子MsMYB10基因的克隆、序列分析及原核表达#br#

【目的】克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f.neidzwetzkyana（Dieck）Langenf]MYB10转录因子基因,进行序列分析和原核表达研究,为进一步探索红色发育机理及选育新的栽培红肉苹果奠定理论基础。【方法】根据MdMYB10基因编码区设计1对特异引物,以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得1个约700 bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该基因片段连接到原核表达载体pET-30a（+）中,构建融合表达质粒,转化到E.coli BL21（DE3）中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR 获得的cDNA 全长包含完整的cDNA开放读码框732 bp,编码244个氨基酸,命名为MsMYB10。MsMYB10分子量为28.56 kD,等电点为8.41,GenBank登录号为GQ500894。该蛋白具有R2R3MYB结构域,结构域中有保守的色氨酸残基,在C端有1个富含酸性氨基酸的转录激活区。与已知MdMYB10的氨基酸序列的同源性为98%。另外,MsMYB10没有信号肽,具有核定位信号。进化树分析表明,MsMYB10与调控花青苷合成的转录因子MdMYB10亲缘关系最近,处在同一进化枝。SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】克隆了新疆红肉苹果转录因子MsMYB10基因, 并可在大肠杆菌中转化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定了试验基础。     

苹果MYB12基因的克隆及生物信息学分析

以野生型苹果"丽江山荆子"果皮为材料,利用对已公布的"金冠"苹果基因组的生物信息学分析,设计1对特异性引物,克隆了MdMYB12转录因子,其基因片段全长为1 042bp,在对其进行生物信息学分析后发现,包含873bp开放阅读框(ORF),编码290个氨基酸。对拟南芥127个MYB基因家族与所克隆的MdMYB12基因构建系统进化树发现,相对于拟南芥中其他MYB基因家族其他基因MdMYB12基因与AtMYB12、AtMYB11及AtMYB111缘关系较近处于同一进化分支上。     

苹果光响应转录因子MdHY5表达及蛋白互作分析

【目的】克隆苹果光响应过程中关键的bZIP（basic-leucine zipper）转录因子MdHY5,并进行表达分析及蛋白互作检测,为阐述苹果中MdHY5在光信号过程中的功能及作用机制奠定基础。【方法】对苹果中具有bZIP保守结构的基因设计半定量引物进行表达分析,筛选具有光响应的bZIP转录因子。对光响应的bZIP家族基因进行BLAST比对,根据同源比对分析将目的蛋白命名为MdHY5,同时对cDNA序列设计引物进行克隆;利用MEGA5软件将MdHY5蛋白与拟南芥基因组中所有的bZIP转录因子家族成员进行聚类分析,同时对蛋白进行保守结构域分析;取苹果各组织材料进行MdHY5时空表达分析;通过对MdHY5启动子序列进行预测分析,并结合拟南芥同源基因芯片数据,进一步利用RT-PCR与半定量PCR检测MdHY5对不同光质的表达响应。将MdHY5连接到原核表达载体PGEX-4T-1上,利用IPTG对转化的大肠杆菌BL21融合蛋白进行诱导表达、蛋白杂交检测,并进行蛋白纯化;利用pull down试验验证MdHY5与MdCOP1蛋白的互作。【结果】通过光响应分析,在苹果中筛选到一个bZip转录因子家族成员,聚类分析显示MdHY5基因与拟南芥AtHY5同源性最高,该基因位于苹果基因组12号染色体上,基因编号为MDP0000586302,与拟南芥AtHY5结构相似,MdHY5也含有4个外显子,3个内含子。该基因cDNA序列长度为1 112 bp,其中5′非编码区长度为214 bp,3′非编码区长度为403 bp,开放阅读框长度为495 bp,编码一个含有164个氨基酸残基的蛋白。蛋白保守域分析显示,MdHY5蛋白C端含有一个典型的亮氨酸拉链结构（bZIP domain）,其中在bZIP结构域的N端含有一个核定位信号区域（NLS domain）。时空表达分析显示MdHY5在各组织中均表达,其中叶片中表达水平最高,花和种子中表达水平较低。利用PLACE对启动子进行了顺式作用元件分析发现,MdHY5启动子上含有G-box、GT-1-box、I-box等多个光响应的作用元件,而定量表达分析显示MdHY5能够被白光、蓝光、紫外光诱导,而红光对MdHY5表达没有明显影响。将构建好的融合蛋白表达载体转化BL21并进行蛋白诱导,菌体经超声波破碎后显示,融合蛋白主要在上清中存在。将诱导的MdHY5-GST蛋白分别与MdCOP1-HIS及pET-HIS蛋白孵育进行pull down试验,结果显示,MdHY5在体外能够与MdCOP1蛋白互作。【结论】MdHY5为光诱导的bZIP转录因子,是拟南芥光形态建成关键转录因子AtHY5的同源基因,与AtHY5具有类似的基因与蛋白结构,在叶中表达量最高,同时对多种光质具有表达响应,能够与MdCOP1互作。     

苦荞全生育期芦丁积累与其生物合成途径相关基因表达分析

【目的】探究苦荞全生育期芦丁含量变化与其合成途径关键酶基因和调控因子MYB基因表达量之间的相关性,以期进一步明确苦荞植株体内芦丁生物合成的分子机制。【方法】以九江苦荞为试验材料,整个生育期分别在萌发期、子叶期、真叶期、盛叶期、现蕾期、盛花期、灌浆期和籽粒成熟期共8个时期取材(S1—S8)。采用RT-PCR方法,克隆获得与黄酮类代谢相关的MYB类转录因子基因。采用T-coffee软件进行氨基酸同源序列比对及保守结构域分析。与拟南芥黄酮类代谢相关的MYB转录因子及荞麦同源MYB转录因子序列比对,基于邻近法构建系统进化树;实时荧光定量PCR技术分析芦丁合成途径中5个关键酶Ft CHS、Ft F3H、Ft4CL、Ft FLS-like和Ft UFGT及上述克隆到的MYB转录因子在不同组织中的表达模式。基于高效液相色谱法(HPLC)测定全生育期取材组织的芦丁含量。同时采用相关性分析方法分析不同组织中芦丁含量变化与基因表达模式的相关性。转换上述数据为矩阵,采用欧式距离法构建共表达层次聚类图谱。【结果】克隆到2个MYB类转录因子,即Ft MYB7和Ft MYB9,其核酸序列长度分别为876和912 bp,分别编码291和303个氨基酸残基。氨基酸序列同源性比对分析结果表明,二者均具有典型的R2R3保守结构域,为R2R3类型的MYB转录因子。结合Nr数据库中17个苦荞和3个拟南芥黄酮类代谢相关MYB转录因子同源氨基酸序列构建系统进化树,结果表明这22个基因分成6大类群,其中Ft MYB7属于第II类群,Ft MYB9属于第IV类群,二者分属于不同类群,暗示这2个MYB转录因子可能涉及调控植物生长发育过程中不同功能类型。荧光定量结果显示,Ft MYB7在S3(真叶期)和S5(现蕾期)基因相对表达量最高,达到501和867倍;Ft MYB9在S1(萌发期)和S2(子叶期)相对表达量最高,分别为34和72倍。上述基因表达量与芦丁含量变化模式相关性分析表明,8个生长时期中,Ft4CL、Ft CHS、Ft F3H、Ft UFGT和Ft MYB7相对表达模式与芦丁含量变化幅度呈正相关,其相关系数分别为0.748、0.683、0.704、0.890和0.862。而Ft FLS-like和Ft MYB9与芦丁含量的变化幅度呈负相关,其相关系数分别为-0.442和-0.501。【结论】Ft MYB7和Ft MYB9转录因子在整个生育时期中表达模式存在明显差异。其中Ft MYB7可能在苦荞芦丁积累的过程中起到正调控作用,而Ft MYB9则为负调控作用。     

甜菜WRKY转录因子全基因组鉴定及其在非生物胁迫下的表达分析

【目的】WRKY转录因子是一类植物响应生物、非生物胁迫,对生长发育都起重要调控作用的转录因子。在甜菜全基因组信息分析的基础上,鉴定WRKY家族基因(Bv WRKYs),解析其组织特异性及盐、热胁迫下的表达情况,为该类基因的功能研究提供参考,为观赏甜菜和石竹目其他观赏植物的基因工程打下基础。【方法】以75条拟南芥WRKY蛋白为参考,根据WRKY保守蛋白序列(PF03106)利用hmm和BLAST同源性搜索对甜菜WRKY家族基因进行鉴定。利用Map Inspect、GSDS2.0、MEGA5.0、DNAMAN5.0、Web Logo 3、MEME生物信息学工具对甜菜WRKY家族基因染色体定位、系统发生关系、基因结构、蛋白质保守结构域、保守元件进行预测和分析。利用RNA-seq和q RT-PCR分析甜菜WRKY组织表达特异性,盐胁迫、热胁迫条件下WRKY表达情况。【结果】甜菜WRKY家族基因包含40个成员,其中39条不均匀地分布在9条染色体上,另外1条定位到随机片段上。根据WRKY保守域特征并与拟南芥WRKY蛋白进化分析,可将40个成员分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3类,Ⅰ类有9个成员,Ⅱ类有26个成员,Ⅲ类有5个成员。根据进化关系Ⅱ类可进一步分为Ⅱa(1个)、Ⅱb(4个)、Ⅱc(9个)、Ⅱd(5个)和Ⅱe(7个)5个亚类。基因结构分析发现,甜菜WRKY外显子和内含子数目具有高变异性(2—7个外显子),即使同一亚类内也都差异较大。保守元件分析显示同一类或亚类内成员具有相同的保守元件。WRKY保守域分析发现2个WRKY七肽域变型:WRKYGKK和WRKYGEK。每个WRKY至少在2个组织中表达,30个WRKY在叶中表达,40个WRKY在花序中均有表达,36个WRKY在幼叶中有表达,38个WRKY在直根中有表达,39个WRKY在幼苗中有表达,36个WRKY在种子中有表达。各WRKY表达量差异较大,可分为低表达、高表达基因两类,如Bv WRKY23、Bv WRKY3、Bv WRKY11、Bv WRKY7、Bv WRKY6、Bv WRKY26、Bv WRKY4、Bv WRKY40、Bv WRKY24、Bv WRKY2和Bv WRKY28在各组织中均有较高表达,而Bv WRKY38、Bv WRKY13、Bv WRKY36、Bv WRKY35、Bv WRKY5和Bv WRKY34在各组织中均表达较低。热胁迫条件下Bv WRKY16、Bv WRKY21、Bv WRKY20、Bv WRKY22、Bv WRKY32、Bv WRKY33和Bv WRKY34上调表达;盐胁迫条件下Bv WRKY1、Bv WRKY6、Bv WRKY19、Bv WRKY31和Bv WRKY33呈现不同程度上调表达;Bv WRKY33对热、盐2种胁迫均有明显响应。【结论】甜菜WRKY蛋白结构高度保守,基因序列长度和内含子数量变化很大,在不同组织中呈现出多种表达模式,部分WRKY响应热或盐胁迫,对甜菜逆境生理调控起重要作用。     

甘蓝型油菜种子和角果皮中硫苷含量的动态变化及转录组关联分析

【目的】探索甘蓝型油菜不同发育时期种子和角果皮硫苷含量的动态变化规律,通过转录组关联分析解析控制硫苷含量变异的遗传机制。【方法】在由113个油菜品种构成的自然群体中,利用高效液相色谱法检测不同发育时期油菜种子及角果皮中的硫苷含量。提取油菜幼嫩叶片mRNA并进行mRNA-Seq测序,开发了355 536个单核苷酸多态性标记（SNP）和116 098个基因表达量标记（GEM）。将开发的SNPs和GEMs分别导入到混合线性模型（MLM）和回归分析模型中进行关联分析,获得与油菜硫苷表型变异显著相关的遗传位点,进一步通过序列比对和功能预测筛选确定候选基因。【结果】授粉后15 d（15 DAP）,油菜种子和角果皮的硫苷含量变异范围分别是1.69-20.45和1.47-25.23 μmol·g^-1。25 DAP种子、25 DAP角果皮以及成熟种子的硫苷变异范围分别是2.17-147.21、0.73-130.77和8.87-111.83 μmol·g^-1。后两个时期（即25 DAP和成熟期）的硫苷含量表现出较大变异,适合进行转录组关联分析。基于mRNA-Seq测序数据,经质量控制后获得256 397个高质量的SNP标记（MAF＞0.01）和53 889个GEM标记（平均基因表达量＞0.4）。利用SNP标记对成熟种子、25 DAP种子和25 DAP角果皮硫苷含量进行关联分析,分别检测到167、158和3个显著关联位点（-log₁₀P＞6.71）。其中,与成熟种子显著关联的SNP标记形成5个明显的关联峰,分别位于A2、A9、C2、C7和C9染色体上。同时,利用GEM标记进行的关联分析中,分别检测到127、16和24个与成熟种子、25 DAP种子、25 DAP角果皮硫苷含量显著关联的位点（-log₁₀P＞6.03）,这些位点主要分布在A2、A8、A9、C2和C9染色体上并形成明显的关联峰。其中,成熟种子和25 DAP角果皮在A9、C2和C9染色体上形成共同的关联峰。通过与公共数据库的基因组序列比对和功能注释,共筛选到295个功能基因,其中25个基因涉及硫苷代谢网路途径,直接参与硫苷的调控。其余基因虽然没有直接参与硫苷代谢过程,但是它们大多属于转录因子基因、刺激响应因子基因,涉及细胞过程或是具有催化活性,因而推测在硫苷积累中同样起到重要作用。【结论】油菜角果皮中的硫苷含量较高,而且与种子硫苷含量显著正相关,是硫苷合成或转运的重要器官。共检测到328个SNP显著标记和144个GEM显著标记,筛选到25个与硫苷合成或者转运有关的功能基因以及73个功能未知的新基因。     

拟南芥硫苷生物合成相关基因的组织和胁迫诱导表达谱的全基因组分析

【目的】分析拟南芥中硫代葡萄糖苷（Glucosinolatcs,简称硫苷）生物合成相关基因在不同组织器官、不同发育时期及不同生物和非生物胁迫处理条件下的表达谱,为筛选控制硫苷合成的关键基因、解析硫苷的生物合成规律及其在植物抗逆胁迫过程中的作用奠定基础。【方法】利用AtGenExpress和PLEXdb中的10组表达谱芯片数据和2组转录组数据分析拟南芥中硫苷生物合成途径82个结构基因和调控基因的时空表达特性及其受生物和非生物胁迫的表达模式;采用Real-time PCR技术对10个硫苷合成途径的关键结构基因和调控基因的表达谱进行验证;并利用STRING v10软件分析硫苷生物合成途径相关基因的表达模式的相关性。【结果】组织表达特性分析结果表明,拟南芥硫苷生物合成相关基因在营养器官和生殖器官中的表达模式差异较大,相关基因在营养器官中具有较高的表达量,在生殖器官中的表达量则较低,表明硫苷主要在营养组织中合成;其中脂肪族硫苷合成相关基因在茎、叶等地上营养组织中的表达量较高,而吲哚族硫苷合成相关基因则在根、茎、叶等地上和地下组织中均有较高的表达,且基因在同一组织的不同发育时期的表达量通常具有差异,表明基因的表达还具有时空特异性;荧光定量PCR分析结果证明10个硫苷合成途径代表基因的表达谱与芯片数据的结果保持一致;胁迫表达分析结果表明,脂肪族和吲哚族硫苷合成相关基因的表达均受到部分生物和非生物胁迫因子的诱导表达,其中吲哚族硫苷合成相关基因更易受到丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae）、甘蓝链格孢菌（Alternaria brassicicola）、桃蚜（Myzus persicae）等生物和低温（4℃）、高盐、高温（38℃）等非生物胁迫因子的诱导表达;共表达分析结果表明,脂肪族和吲哚族硫苷合成分支途径内相关调控基因与结构基因的表达模式的相关性较高。【结论】拟南芥硫苷生物合成相关基因主要在营养组织中高表达,在种子中低表达;植物中存在一个硫苷转运系统,负责将营养组织中合成的硫苷转运到种子中贮藏;硫苷合成相关基因的表达受到病原菌、虫害、高温等逆境因子的影响,其中吲哚族硫苷合成相关基因更易受到生物和非生物胁迫因子的诱导表达,说明吲哚族硫苷可能对植物抗性更为重要。     

气味受体基因Orco在中华蜜蜂雄蜂触角中的表达及定位分析

【目的】昆虫气味受体（odorant receptors, Ors）在其发挥嗅觉识别过程中采用的是配体门控离子通道信号传导机制,这一离子通道是由一个特定的共受体与一个普通气味受体结合为异源二聚体而形成的。其中,气味共受体（odorant receptor coreceptor, Orco）是一个十分独特的家族,在不同种类昆虫中高度保守,并在调控昆虫的嗅觉行为方面发挥关键作用。论文在对中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）工蜂Orco研究基础之上,进一步探讨雄蜂Orco的表达特性。【方法】采集中蜂1日龄雄蜂的触角、头（去除触角）、胸、腹、足5部分组织,以及不同发育阶段的幼虫、蛹及成蜂触角。提取各样本的总RNA,利用real-time quantitative PCR（qPCR）技术鉴定Orco在雄蜂不同组织及不同发育时期的表达谱;采集1日龄雄蜂触角制备冰冻切片,合成地高辛标记的寡核苷酸探针,利用原位杂交技术对Orco在雄蜂触角中的表达进行细胞定位分析。【结果】qPCR分析结果表明,Orco转录本在不同组织中的表达量表现为触角>头>足>腹>胸,其中触角表达量约为头部的100倍;Orco在雄蜂不同发育阶段均有表达,其中幼虫期和蛹期表达量较低,羽化后开始逐渐升高,性成熟后维持在一个较高的水平。此外,结合前期工蜂荧光定量试验数据,分析得到Orco在雄蜂触角中的表达量极显著高于工蜂触角表达量（P＜0.01）。原位杂交结果显示,Orco阳性杂交信号大量表达于雄蜂触角的板型感器和毛型感器的神经元细胞中。【结论】气味受体基因Orco在中蜂雄蜂的触角中大量表达,且在性成熟后表达量达到高峰。结合前期研究结果,推测Orco在中蜂中是偏雄性表达的。     

茄萼花色苷合成相关基因DFR和MYB克隆及表达分析

【目的】花色苷是一类通过类黄酮途径合成的水溶性次生代谢产物,既能使植物的不同器官呈现红、紫、蓝等颜色,还有利于人体健康。紫茄富含花色苷,但是有关茄萼花色苷生物合成的分子机制还不是很清楚。本研究旨在通过克隆茄萼花色苷合成相关基因DFR和MYB,测定其在不同发育时期不同颜色茄萼中的表达量,探究DFR和MYB在茄萼花色苷合成中的作用。【方法】选用绿萼和紫萼长茄(Solanum melongena L.)果萼为试材,测定不同p H条件下茄萼花色苷含量;通过RACE方法分离克隆DFR和MYB cDNA全长序列,分析DFR和MYB的保守结构域及序列特征;分别对DFR和MYB及其同源蛋白序列进行系统进化分析,构建系统进化树来进一步分析鉴定基因;使用Ex PASy网站提供的在线分析软件SOPMA预测蛋白质二级结构;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在不同发育阶段果萼中的表达情况。【结果】从绿萼和紫萼长茄果萼中克隆了DFR和MYB片段,分别命名为ouSmDFR、dongSmDFR和ouSmMYB、dongSmMYB,Gen Bank登录号分别为:KX224250、KX224251和KX224253、KX224254。ouSmDFR和dongSmDFR全长分别为1 285 bp和1 249 bp,开放阅读框为858 bp和864 bp,分别编码285个和287个氨基酸;ouSmMYB和dongSmMYB全长分别为969 bp和959 bp,开放阅读框均为462 bp,编码153个氨基酸。蛋白质二级结构分析表明α-螺旋和无规则卷曲均为两个DFR蛋白和两个MYB蛋白的主要二级结构元件。序列比对表明DFR蛋白具有NADPH结构域(NADPH binding domain)和底物特异性结合结构域(Substrate specific binding domain),属于NADB-Rossmann超基因家族;MYB蛋白属于R2R3-MYB转录因子,具有R2、R3两个MYB结构域和b HLH结合域。ouSmDFR和dongSmDFR与St DFR和Sl DFR具有相对较高的同源性;ouSmMYB和dongSmMYB与Es MYB同源性较高。花色苷含量测定显示,紫萼果茄萼花色苷含量较高且随着果实的发育成熟而逐渐增加;而绿萼茄萼几乎检测不到花色苷。荧光实时定量PCR分析表明,DFR和MYB在紫萼长茄果萼中表达量均远高于绿萼长茄;从初蕾期到盛花期,紫萼长茄果萼中DFR和MYB表达量逐渐升高,而绿萼长茄则几乎没有变化,与两个品种茄萼颜色变化相一致。【结论】ouSmDFR和dongSmDFR属于NADB-Rossmann超基因家族,ouSmMYB和dongSmMYB为典型R2R3-MYB转录因子,DFR和MYB在紫萼长茄果萼中表达明显高于绿萼长茄。推测DFR和MYB在茄萼呈色中发挥作用,并且参与花色苷生物合成。     

MicroRNA828负调控缺磷胁迫诱导的番茄花青素生物合成

【目的】深入解析番茄miR828的生物学功能,特别是参与番茄缺磷胁迫响应和花青素生物合成的调控作用。【方法】分别利用psRNATarget和RLM-5′ RACE预测和验证miR828在番茄中的靶基因。用MegAlign和MEGA5对番茄SlMYB7-like与部分R2R3 MYB转录因子氨基酸序列进行了多重比对和进化树分析。用qRT-PCR分析miR828及其靶基因SlMyb7-like在AC、MicroTom和LA1996 3个不同番茄种质中的表达和miR828在番茄（AC）中的组织特异性表达模式。以miR828过表达转基因番茄和野生番茄为材料,设置正常供磷（+Pi,MS+KH₂PO₄ 3.4 g·L^-1）和缺磷（-Pi,MS+KCl 1.86 g·L^-1）2个处理的培养试验。用qRT-PCR分析miR828及其靶基因在缺磷胁迫下的表达模式。将野生型和miR828过表达的转基因番茄植株缺磷培养15 d后,观察番茄植株地上部分和地下部分的表型差异,通过qRT-PCR分析miR828、miR828的靶基因SlMyb7-like（SGN-U320618）和花青素合成相关酶基因（PAL、CHS、DFR、ANS、3GT和F3′H）的表达模式,应用分光光度计测量各样品的花青素含量。【结果】RLM-5′ RACE剪切试验表明miR828对靶基因SlMyb7-like存在剪切调控作用,且剪切作用位点位于成熟miR828的第10位和第11位核苷酸之间,从而验证了SlMyb7-like是 miR828直接作用的靶基因。氨基酸序列多重比对及进化树分析显示番茄SlMYB7-like与拟南芥AtMYB7和金鱼草MYB330的序列相似性最高。SlMYB7-like含有与花青素合成相关的保守氨基酸基序。miR828在MicroTom幼苗中的表达最高,在LA1996中的表达最低。相反,miR828靶基因SlMyb7-like在LA1996中的表达水平最高,在MicroTom中的表达水平最低。qRT-PCR分析显示SlMyb7-like的表达模式与miR828相反,证明SlMyb7-like被miR828调控。正常供磷条件下,野生型番茄各组织中miR828的表达量普遍较低,但在花芽、花和绿果中相对较高;miR828过表达转基因番茄植株中各花青素合成相关基因的表达量降低为野生型植株的30%-60%,花青素含量降低为野生型植株的40%。在缺磷胁迫下,野生型和miR828过表达转基因番茄植株中miR828及其靶基因SlMyb7-like的表达均受到诱导上调表达;转基因番茄植株地上部分和根系生长受到的抑制程度均小于野生型番茄;转基因番茄植株的颜色较野生型番茄植株颜色浅;转基因番茄植株中SlMyb7-like、花青素合成相关基因的表达以及花青素含量均低于野生型植株;miR828过表达转基因番茄植株缺磷胁迫耐受性却高于野生型番茄。【结论】在番茄中,miR828直接作用的靶基因是SlMyb7-like。野生型番茄所测组织中miR828的表达量普遍较低,但在花芽、花和绿果中相对较高。miR828及其靶基因SlMyb7-like的表达受缺磷胁迫诱导。在正常供磷和缺磷条件下,miR828过表达转基因番茄植株中各花青素合成相关基因的表达量和花青素含量均低于野生型,表明miR828通过靶向SlMyb7-like负调控花青素合成相关基因的表达,进而负调控番茄植株中花青素的生物合成。miR828能够提高番茄对缺磷胁迫的耐受性。