苹果生长素响应因子MdARF5的克隆与功能鉴定

【目的】分离苹果生长素响应因子Md ARF5(Auxin Response Factor 5),分析其对生长素的响应,鉴定其在调节花青苷合成过程中的作用,揭示Md ARF5的生物学功能,为进一步研究生长素对花青苷的调节提供理论依据。【方法】以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为材料,利用同源克隆技术,克隆得到一个ARF(Auxin Response Factor)转录因子,并将其命名为Md ARF5。利用MEGA5.0软件构建多物种间系统进化树。通过农杆菌介导的遗传转化获得转基因苹果愈伤组织。比较野生型和转基因苹果愈伤组织花青苷积累的差异。利用烟草叶片瞬时转化试验,分析Md ARF5对Md MYB1的转录调控。【结果】克隆获得苹果生长素响应因子Md ARF5(序列号:MDP0000143749),该基因CDS为2 691 bp,编码含有896个氨基酸的蛋白。系统进化树分析表明,苹果Md ARF5与梨Pb ARF5同源性最高。基因表达分析显示,该基因响应生长素处理,并且与花青苷合成相关基因表现出相反的表达模式。在苹果愈伤组织中超表达Md ARF5,其花青苷积累较野生型显著降低,表明Md ARF5在调控花青苷积累过程中发挥重要作用。对苹果Md MYB1启动子序列进行分析,发现其序列包含一个Md ARF5的结合位点。烟草瞬时表达试验显示,Md ARF5能够抑制Md MYB1的表达。【结论】推测苹果Md ARF5可能通过直接抑制Md MYB1的表达负调节花青苷的积累。     

苹果细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2的克隆及抗性鉴定

采用同源克隆和PCR技术从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2(基因序列号:MDP0000279125)。该基因含有1 542 bp的完整开放阅读框,编码513个氨基酸。利用Plant CARE数据库对MdCKX7.2启动子顺式作用元件进行预测分析,发现MdCKX7.2启动子序列中存在光、干旱、脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯等响应元件。基因表达分析发现,‘嘎拉’幼苗中MdCKX7.2的表达明显受干旱和ABA的诱导。通过农杆菌介导的遗传转化获得MdCKX7.2转基因拟南芥植株。抗性试验表明,异位表达MdCKX7.2基因明显提高了拟南芥对干旱胁迫的抗性。拟南芥种子萌发试验表明,在拟南芥中异位表达MdCKX7.2提高了植株对ABA的敏感性,种子萌发率和幼苗鲜质量明显下降,与种子萌发相关基因的表达量明显上调。以上试验结果表明,MdCKX7.2在植物非生物胁迫响应中发挥重要作用。     

苹果光响应转录因子MdHY5表达及蛋白互作分析

【目的】克隆苹果光响应过程中关键的bZIP（basic-leucine zipper）转录因子MdHY5,并进行表达分析及蛋白互作检测,为阐述苹果中MdHY5在光信号过程中的功能及作用机制奠定基础。【方法】对苹果中具有bZIP保守结构的基因设计半定量引物进行表达分析,筛选具有光响应的bZIP转录因子。对光响应的bZIP家族基因进行BLAST比对,根据同源比对分析将目的蛋白命名为MdHY5,同时对cDNA序列设计引物进行克隆;利用MEGA5软件将MdHY5蛋白与拟南芥基因组中所有的bZIP转录因子家族成员进行聚类分析,同时对蛋白进行保守结构域分析;取苹果各组织材料进行MdHY5时空表达分析;通过对MdHY5启动子序列进行预测分析,并结合拟南芥同源基因芯片数据,进一步利用RT-PCR与半定量PCR检测MdHY5对不同光质的表达响应。将MdHY5连接到原核表达载体PGEX-4T-1上,利用IPTG对转化的大肠杆菌BL21融合蛋白进行诱导表达、蛋白杂交检测,并进行蛋白纯化;利用pull down试验验证MdHY5与MdCOP1蛋白的互作。【结果】通过光响应分析,在苹果中筛选到一个bZip转录因子家族成员,聚类分析显示MdHY5基因与拟南芥AtHY5同源性最高,该基因位于苹果基因组12号染色体上,基因编号为MDP0000586302,与拟南芥AtHY5结构相似,MdHY5也含有4个外显子,3个内含子。该基因cDNA序列长度为1 112 bp,其中5′非编码区长度为214 bp,3′非编码区长度为403 bp,开放阅读框长度为495 bp,编码一个含有164个氨基酸残基的蛋白。蛋白保守域分析显示,MdHY5蛋白C端含有一个典型的亮氨酸拉链结构（bZIP domain）,其中在bZIP结构域的N端含有一个核定位信号区域（NLS domain）。时空表达分析显示MdHY5在各组织中均表达,其中叶片中表达水平最高,花和种子中表达水平较低。利用PLACE对启动子进行了顺式作用元件分析发现,MdHY5启动子上含有G-box、GT-1-box、I-box等多个光响应的作用元件,而定量表达分析显示MdHY5能够被白光、蓝光、紫外光诱导,而红光对MdHY5表达没有明显影响。将构建好的融合蛋白表达载体转化BL21并进行蛋白诱导,菌体经超声波破碎后显示,融合蛋白主要在上清中存在。将诱导的MdHY5-GST蛋白分别与MdCOP1-HIS及pET-HIS蛋白孵育进行pull down试验,结果显示,MdHY5在体外能够与MdCOP1蛋白互作。【结论】MdHY5为光诱导的bZIP转录因子,是拟南芥光形态建成关键转录因子AtHY5的同源基因,与AtHY5具有类似的基因与蛋白结构,在叶中表达量最高,同时对多种光质具有表达响应,能够与MdCOP1互作。     

苹果蛋白磷酸酶基因MdPP2C-Like的克隆及其对ABA的响应分析

以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)为试材,克隆了ABA信号转导过程中的响应基因蛋白磷酸酶基因MdPP2C-Like(基因序列号MDP0000126636)。基因结构分析显示,MdPP2C-Like定位于苹果8号染色体上,含有5个外显子与4个内含子;该基因全长1 035 bp,编码344个氨基酸,预测其蛋白质分子量为37.84 k D,等电点(p I)为5.72。蛋白质结构分析发现,其存在1个蛋白磷酸酶2C(PP2C)保守结构域,并与拟南芥中的A类PP2C保守结构域高度同源。构建的系统进化树表明MdPP2C-Like与At4G32950位于同一进化支,同源性较高。亚细胞定位结果表明,MdPP2C-Like主要定位于细胞核,少数分布在细胞质。定量分析显示,MdPP2C-Like在苹果不同组织中表达量不同,根中表达量较高。对获得的转基因拟南芥株系和苹果愈伤组织进行ABA响应分析,结果表明该基因的过量表达降低了植株和愈伤组织对ABA的敏感性。以上结果表明,克隆得到的MdPP2C-Like在响应ABA信号过程中起着重要作用。     

苹果愈伤组织超表达MdNAC029促进花青苷积累

以‘光辉’海棠(Malus spectabilis‘Guanghui’)与‘王林’苹果(Malus×domestica‘Orin’)杂交后代中分离出来的红肉苹果果实为试验材料,克隆得到1个NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)转录因子基因,命名为MdNAC029。该基因开放阅读框(ORF)为843 bp,编码含有280个氨基酸的蛋白。保守结构域分析显示,MdNAC029蛋白在N端包含1个保守的NAC结构域。基因表达分析显示该基因在红肉苹果果实中表达量较非红肉果实高。在‘王林’苹果愈伤组织中超表达MdNAC029,其花青苷积累显著增加,表明MdNAC029在调控花青苷积累过程中发挥重要作用。对MdMYB1启动子序列进行分析,发现其序列包含1个MdNAC029转录因子的结合位点。同时,烟草瞬时表达试验显示,MdNAC029能够激活MdMYB1基因的表达。由此推测,MdNAC029可能通过直接促进MdMYB1基因的表达,正向调节花青苷的积累。     

过表达苹果多肽激素基因MdCEP1促进花青苷积累

以‘王林’苹果(Malus×domestica‘Orin’)愈伤组织为试材,初步探讨苹果多肽激素Md CEP1(C-TERMINALLY ENCODED PEPTIDE1)在调控花青苷合成方面的作用。分析显示Md CEP1位于苹果第15号染色体,只有1个外显子。蛋白序列比对显示不同物种中CEP结构域非常保守。启动子分析表明,Md CEP1启动子序列包含多个顺式作用元件,包括与分生组织有关的CAT-box元件、赤霉素响应元件(P-box)、光响应元件(MNF1)和与类黄酮合成相关的MYB类蛋白结合位点(MBSI)。通过农杆菌介导的遗传转化获得Md CEP1转基因苹果愈伤组织,进一步分析发现过表达Md CEP1能够明显促进愈伤组织花青苷积累,并且促进花青苷合成相关基因的表达。Md CEP1在拟南芥中异位表达,同样能够促进拟南芥中花青苷的积累,并且促进拟南芥花青苷合成相关基因的表达。研究结果表明,Md CEP1能够正调控苹果花青苷的合成。     

苹果6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Md6PGDH1的克隆和功能分析

以‘嘎拉’苹果为材料,克隆了6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Md6PGDH1(序列号:MDP0000279299)全长。序列分析显示,该基因包含一个长为1 047 bp完整的开放阅读框,编码347个氨基酸,分子量为36.430 k D,预测等电点为9.24。同源性分析表明Md6PGDH1还有另外3个同源基因;功能域分析表明Md6PGDH蛋白含有两个保守的绑定域;亚细胞预测表明Md6PGDH定位存在差异。分析Md6PGDH1启动子发现存在多个响应非生物胁迫的顺式作用元件。定量分析显示,Md6PGDH1在苹果的不同组织中都有表达,且受非生物胁迫诱导。原核诱导Md6PGDH1蛋白并进行蛋白酶活的测定,为后续蛋白功能鉴定奠定了基础。Md6PGDH1在苹果愈伤组织中过量表达,提高其抗盐胁迫的能力。     

施氮量对潮土区冬小麦-夏玉米轮作农田氮磷淋溶的影响

潮土是我国华北地区主要土壤类型之一,潮土区是我国冬小麦-夏玉米作物的主要产区,研究不同施氮量潮土氮磷淋溶特征对于指导区域农田面源污染防控具有重要意义。本研究设置3个施肥处理,即传统施氮(CON)、优化施氮(OPT)和优化再减氮(OPTJ),利用田间渗漏池法,研究潮土冬小麦-夏玉米轮作农田硝态氮及总磷淋溶特征。结果表明:2016—2018年,冬小麦-夏玉米轮作周年不同施肥处理90cm土层年淋溶水量79.0～102.5 mm,不同淋溶事件间土壤淋溶液硝态氮浓度波动较大, CON、OPT和OPTJ处理单次淋溶事件硝态氮浓度分别为18.9～208.7(平均为72.7) mg·L~(-1)、9.0～99.2 (平均为33.8) mg·L~(-1)、4.7～55.5 (平均为15.4) mg·L~(-1)。本研究区域冬小麦-夏玉米轮作模式的氮素淋溶风险较高,磷素淋溶风险较低。传统施氮处理(CON)下农田硝态氮的平均淋溶量和表观淋失系数分别为66.4 kg·hm~(-2)和10.3%,而总磷(TP)为0.06 kg·hm~(-2)和0.04%。氮肥减施会显著降低氮素淋失,OPT和OPTJ处理的氮素淋溶减排率可达56.3%和78.9%。两个年度CON、OPT和OPTJ处理硝态氮平均表观淋失系数分别为10.3%、6.2%和4.9%,随着施氮量的增加,硝态氮淋失系数动态增加。氮淋溶具有较大的年际变化,降雨量高的2018年比降雨少的2017年硝态氮淋溶量多57.0%。两个年度CON、OPT和OPTJ处理总磷平均淋溶量分别为0.06 kg·hm~(-2)、0.06 kg·hm~(-2)和0.08 kg·hm~(-2)。适量减施氮肥会增加作物产量, OPT处理的作物产量是CON处理的1.08倍。然而,过量减施则会带来减产风险, OPTJ处理氮肥减施56%,作物产量比CON处理降低2.0%～8.1%。总之,潮土区农田硝态氮淋溶风险较大,适量减施氮肥能够在保证作物产量的基础上显著降低氮素淋失损失。     

沼液替代化肥对小麦-玉米轮作温室气体排放及温室效应的影响

本文采用密闭箱-气相色谱法研究不同沼液灌溉模式,小麦-玉米轮作条件下温室气体的排放特征,并运用全球增温潜势(GWP)和气体排放强度(GHGI)对小麦-玉米排放的温室效应进行估算。研究表明,在冬小麦-夏玉米轮作周期中,以清/沼比2∶1配比的沼液灌溉,小麦灌3次,玉米灌溉1次的处理(T3)和小麦灌溉4次,玉米灌溉1次的处理(T4)与常规施肥(CF)相比,GWP连续两年没有显著性差异,T3、T4和CF在2016年的GWP为2 990.82±285.00、3 235.48±307.05、3 047.35±315.11;T3、T4和CF在2017年的GWP为2 865.61±296.44、3 069.10±318.44和2 741.70±284.37。但小麦季灌溉1次,玉米灌溉1次处理(T1)和与小麦灌溉2次,玉米灌溉1次的处理(T2)的GWP比CF处理相比显著降低。T1和T2处理在2016年和2017年的GWP分别为2 578.57±279.39、2 586.13±263.01;2 702.59±300.75、2 733.19±260.81,T1和T2处理2016年比CF处理降低了15.38%和11.31%;2017年比CF处理降低了5.67%和0.31%。针对产量进行分析,T2、T3、T4和CF处理连续两年差异性不显著,其中T4处理在2016年产量比CF处理提高了4.12%。T3、T4的温室气体排放强度与常规施肥处理(CF)连续两年差异性不显著,2016年T1和T2处理与CF处理相比显著降低了0.56%,2017年T2处理和CF处理相比差异性不显著。综合考虑GWP与作物产量的因素,T2处理(小麦季2∶1沼液灌溉2次,玉米季2∶1沼液灌溉1次,施氮量为315 kg·hm~(-2))为最优选择,所以T2处理是可以替代化肥且较合理的灌溉模式。     

苹果细胞分裂素响应因子基因MdCRF4的分离与功能鉴定

以‘嘎拉’苹果(Malus × domestica‘Royal Gala’)为研究材料,利用同源克隆和PCR技术,分离了苹果细胞分裂素响应因子(cytokinin response factor)基因MdCRF4。该基因开放阅读框(ORF)为1077 bp,编码含有358个氨基酸的蛋白。保守结构域和系统进化树分析显示,MdCRF4蛋白包含一个保守的CRF结构域和一个保守的AP2/ERF结构域,与梨PbCRF4同源性最高。基因表达分析显示,该基因主要在苹果根和叶中表达并且响应细胞分裂素。EMSA试验显示MdCRF4原核表达蛋白能够绑定DRE(ACCGAC)序列。在‘王林’苹果愈伤组织中超表达MdCRF4,其花青苷积累显著增加,表明MdCRF4在调控花青苷积累中发挥重要作用。