中华稻蝗Knickkopf(Knk)基因分子特性和生物学功能

基于中华稻蝗转录组数据库,采用生物信息学方法搜索获得1条OcKnk基因全长cDNA序列,采用qRT-PCR检测其组织部位表达特性和其在表皮发育过程中表达情况,明确其分子特性,采用RNAi技术结合表型观察,研究其对中华稻蝗蜕皮和生长发育的影响,以明确其生物学功能。组织部位表达结果显示其在中华稻蝗体壁、前肠和脂肪体表达最高,发育表达结果显示其在表皮不同发育日龄均有表达,且在蜕皮前期和后期表达显著高于其他日龄。生物学功能研究表明,注射dsRNA后,多数虫体难以成功蜕去旧表皮,导致死亡,少部分可蜕至下一龄期,但活动力较低,行动缓慢,最终死亡。研究结果表明OcKnk参与昆虫生长发育和蜕皮过程,可作为重要靶标基因,为下一步害虫防治提供理论基础。     

飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达及酶学特性分析

【目的】β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase,NAG)是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类。研究旨在利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统获得高纯度LmNAG1蛋白并对其酶学特性进行分析,探究该酶在飞蝗(Locusta migratoria)生长发育过程中的生物学功能,为飞蝗绿色防控分子靶标研发提供理论与实践依据。【方法】根据Lm NAG1的cDNA全长序列(Gen Bank:JX888720.1)设计包含酶切位点Bam H Ⅰ、Hind Ⅲ和6×His标签的引物。采用PCR技术扩增包含开放阅读框的目标片段,双酶切后连接至pFast Bac~(TM)-Dual载体上。将重组质粒转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,通过Tn7转座子把目的基因转座到杆状病毒基因组上,用蓝白斑结合抗生素筛选。挑取白斑用pUC/M13引物来扩增目的条带,挑选带目的基因全长的重组杆状病毒质粒(baculovirus plasmid,Bacmid)。用转染试剂将重组Bacmid转染至草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9中,72 h内连续观察细胞形态,当出现感染迹象后收集细胞,离心,取上清得到P1代重组病毒粒子。用P1代病毒粒子去感染Sf9细胞,裂解并提取蛋白,Western blot检测目的蛋白是否成功表达。之后大量感染Sf9细胞,提取蛋白,利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱和阴离子交换柱Q对重组蛋白进行纯化,取最纯的馏分用Bradford法测定蛋白浓度。采用4MU-GlcNAc为底物对重组目的蛋白LmNAG1的动力学参数、最适温度和最适pH进行测定。【结果】克隆得到包含1 845 bp LmNAG1全长的pFast Bac-LmNAG1重组质粒,酶切验证与目标条带一致。将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞中,PCR扩增挑选出纯白斑,成功将LmNAG1全长序列构建到杆状病毒基因组上。将重组Bacmid转染至Sf9细胞,72 h后在显微镜下观察可见细胞膨大,边缘不规则等感染迹象。离心收集重组病毒粒子感染新的Sf9细胞,72 h后收集细胞,Western blot检测发现在67 kD附近有明显条带,与LmNAG1的理论分子量一致,获得带6×His标签的融合蛋白。大量感染收集细胞提取蛋白,经Ni-NTA琼脂糖层析纯化,进一步透析除盐后用阴离子交换柱Q二次纯化,得到了高纯度的目的蛋白。用Bradford法测定最纯的E3组分的蛋白浓度为0.057μg·μL~(-1)。体外活性测定结果表明LmNAG1的最适pH为8.0,且在pH 6.0—8.0范围内具有较高的稳定性;LmNAG1的最适温度为40℃,在40℃以下具有很高的稳定性,当温度高于45℃时热稳定性迅速下降;采用4MU-GlcNAc为底物测得LmNAG1具有水解β-1,4糖苷键的活性,可以释放出4MU,它的动力学参数K_m值为(0.28±0.02)mmol·L~(-1),K_(cat)值为(902.88±38.15)s~(-1)。【结论】成功获得高纯度且具活性的LmNAG1蛋白,其可水解β-1,4糖苷键连接的几丁质寡糖,与已知昆虫NAG1具有相似的生物学功能,即参与几丁质的降解。     

牛精子表面抗原单克隆抗体的制备

精细胞膜是一种异质结构,它在维持精子运行、活力和受精能力方面起着极为重要的作用。应用单抗隆抗体研究精子表面的抗原。可以从分子水平深入了解精细胞膜的特性。精子由睾丸的曲精细管生成,然后通过附睾头和附睾尾,最后排出。在这一过程中,精细胞是逐步发育和成熟分化的。可以用高度特异性的单克隆抗体检测这一过程中精细胞抗原位点的分布和变化以及研究精子受精被抑制的机制。     

长期取食染镉小麦后中华稻蝗体内镉的累积分布

重金属镉在动物体内的代谢过程主要通过消化途径实现。以食物染毒的方法，采用不同浓度镉溶液培养的麦苗饲喂中华稻蝗（从一龄若虫至成虫），将中华稻蝗成虫不同组织部位（头、翅、足、卵巢／精巢、体壁、前肠、中肠、后肠）解剖，并通过原子吸收分光光度计测定其镉的浓度，统计分析各组织部位镉的累积分布规律。火焰原子吸收测定结果表明，生长于浓度为0、36．67、73．34、110．01、146．68μg·g^-1镉溶液中的小麦，其叶片中镉的累积浓度分别达到1．99、102．88、159．92、255．48、372．68μg·g^-1,与培养液中镉浓度呈显著正相关（Y=2．4379X-0．206，R^2=0．988P〈0．01；Y为小麦中镉浓度，X为镉溶液浓度）；随着镉处理浓度的增加，中华稻蝗头、翅、足、卵巢、体壁、前肠、中肠、后肠中镉的累积浓度基本都呈增加的趋势，例如，在各组织部位中镉累积浓度最高的为中肠，4个处理浓度中雌虫分别为对照组的139．29、82．11、197．94、212．74倍，雄虫为对照组的99．89、70．32、100．17、91．23倍；在各组织部位中镉累积浓度较低的足，雌、雄虫也分别达到了对照组的4．95、8．80、16．23、16．90倍和7．14、12．22、20．59、27．98倍。对中华稻蝗成虫各组织部位镉累积浓度进行比较发现，消化道各部位的累积浓度较其他部位为高，其中，中肠内镉的累积浓度均为最高，前后肠间的累积浓度次之；此外，镉在中华稻蝗头部也有明显的累积，其次是体壁和翅，而卵巢／精巢和足的累积浓度最低。研究结果表明长期取食染毒小麦可导致镉在中华稻蝗体内的累积，且镉在不同组织部位中的累积分布存在差异。     

中华稻蝗不同体段镉与铅含量及抗氧化酶的比较

采用现场采样及室内测试方法,对中华稻蝗不同体段的镉与铅含量、MDA及H2O2自由基含量、GSH含量及其相关酶（GST、GPx、GR）活性、SOD及CAT活性进行了研究。结果表明,镉与铅含量均在胸部最高,其次为腹部和头部,后足含量最低。胸部镉含量分别是腹部、头部和后足的2.83、3.40和5.67倍,铅含量分别是腹部、头部和后足的1.29、1.39和1.41倍。GSH、MDA、H2O2含量及SOD、CAT活性均为后足最高,其次为头部和腹部,胸部最低。GST在4个体段的活性无显著差异。GR活性的顺序为头部〉胸部〉腹部〉后足,GPx活性的顺序为头部〉腹部〉胸部〉后足。进入土壤中的镉与铅经食物链转运后,在中华稻蝗体内富集,据此可将中华稻蝗作为农业环境中镉与铅污染的指示生物。     

奶牛的体型、产量和长寿性

奶牛终生利润能力(lifetime profitab-ility:下称终生利润)与产量、体型和长寿性间的遗传联系至今还不太明确。我们认为,头胎产量是终生产量和长寿性的一个良好预测指标,用48月龄初产母牛的性能评定公牛有助于对公牛父亲终生性状的选择。经济分析表明,当后备牛成本和产奶收入的变化范围很大时,按出生到48月龄女儿的“保留率”(stayabili-ty)进行公牛排队能提高利润。每头公牛有100到200头女儿时测定的保留率就可靠,产量与保留率的相对经济权数约为2∶1。虽然研究尚未得出最终结论,但已表明用体型估测长寿性似乎没有什么价值,远不如保留率有用。但是如果只强调泌乳期产量,而不重视乳房中央悬韧带的选择就可能使母牛出现悬垂乳房。     

中华稻蝗两地理种群乙酰胆碱酯酶生化特性研究

采用生物测定方法,对采自山西省临猗县和江苏省徐州市郊中华稻蝗五龄若虫的乙酰胆碱酯酶(AChE)特性进行了比较研究,同时测定了2种群五龄若虫对马拉硫磷的敏感性。用对氧磷、氧化毒死蜱和甲基内吸磷3种有机磷抑制剂对2种群中华稻蝗五龄若虫AChE的体外抑制进行的研究表明,该2种群AChE对对氧磷、氧化毒死蜱、甲基内吸磷的敏感性没有显著差异,临猗种群比徐州种群分别高1.24、1.13和0.82倍;乙酰胆碱酯酶动力学研究结果表明,临猗种群的动力学参数米氏常数(Km值)和最大反应速度(Vmax值)均较徐州种群为高;用乙酰硫代胆碱(ATC)做底物测定AChE活性,2种群AChE活性无显著差异,临猗种群是徐州种群的1.24倍。而2种群生物测定结果表明,临猗种群和徐州种群五龄若虫对马拉硫磷的敏感度有差异,徐州种群五龄若虫的LD50值(13.00μg·g-1虫质量)是临猗种群(4.64μg·g-1虫质量)的2.8倍。据此推测,中华稻蝗徐州种群马拉硫磷敏感性下降与AChE无相关性,可能存在其他影响因素。     

Cd在中华稻蝗体内的分布

中华稻蝗属于非迁飞性蝗虫,尤其喜食水稻.当水稻生长环境Cd污染严重时,Cd将富集于蝗虫体内.中华稻蝗不同体段对Cd的富集程度不同,在雌性头、胸、腹、后足的富集浓度分别为0.323,O.343,0.486及0.306 mg·kg-1,各体段富集Cd能力大小的顺序为腹＞胸＞头＞后足;在雄性头、胸、腹、后足的富集浓度分别为O.509,0.437,0.738,0.356mg·kg-1,分布状况为腹＞头＞胸＞后足;Duncan的多重比较显示,Cd在中华稻蝗腹部的富集量与在头、胸、后足的富集量差异显著,而头、胸、后足间的富集量差异不显著;Cd在不同性别中华稻蝗腹部的富集量差异显著,但在头、胸、后足中的富集量差异不显著.由于中华稻蝗对Cd有富集作用,因此,可利用中华稻蝗作为Cd的环境污染指示生物,对稻田及周围环境重金属污染进行监测,快速、准确地反映环境中重金属Cd污染状况.     

飞蝗表皮蛋白LmKnk3-5′的抗体制备及组织定位

【目的】LmKnickkopf3-5′(LmKnk3-5′)是飞蝗（Locusta migratoria）蜕皮发育中重要的表皮蛋白。本文旨在制备LmKnk3-5′特异抗体并对其进行组织定位,为LmKnk3-5′生物学功能研究提供蛋白水平的证据,同时为进一步深入探究LmKnk3-5′与其他表皮蛋白在飞蝗表皮形成过程中的协同作用打下基础。【方法】首先比对飞蝗Knickkopf(Knk)家族4个基因LmKnk、LmKnk2、LmKnk3-FL和LmKnk3-5′的氨基酸序列,选取LmKnk3-5′的3段特异抗原序列R1、R2和R3,设计包含BamH I、Hind III酶切位点的引物,以LmKnk3-5′全长cDNA为模板,PCR获得LmKnk3-5′的特异抗原片段;然后将特异抗原片段与pET-32a经双酶切、T4连接酶连接、测序验证、成功构建重组质粒后,转入BL21（DE3）表达菌株中,加入IPTG（终浓度0.5 mmol·L^-1）低温（16℃）诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况;接着扩大培养可在菌体裂解液的上清中表达重组融合蛋白的大肠杆菌,提取蛋白并用Ni-NTA对其进行纯化,之后再用纯化后的重组特异抗原免疫小鼠4次,获得anti-LmKnk3-5′多克隆抗体,ELISA法对其进行效价检测,并用Western blot法检测其特异性。取飞蝗5龄若虫第8天表皮,制备石蜡切片,通过免疫组化法对LmKnk3-5′蛋白进行组织定位。【结果】通过氨基酸序列比对,选取LmKnk3-5′的特异抗原区域R1、R2和R3,分别包含208、147和131个氨基酸残基,蛋白理论分子量分别为24.0、17.0和14.8 kD。酶切连接后,成功获得 pET-32a-R1、pET-32a-R2 和pET-32a-R3重组质粒。诱导表达检测,发现只有含pET-32a-R2的表达菌在菌体裂解液的上清液中大量表达重组蛋白。将其扩大培养纯化后获得 R2重组融合蛋白,免疫小鼠取抗血清进行效价检测,抗体效价高达1﹕512 000,可满足抗体使用需求。Western blot结果表明,注射dsLmKnk3-5′后飞蝗体壁LmKnk3-5′的蛋白表达显著减少,表明anti-LmKnk3-5′抗体特异性良好。免疫组化试验结果表明,表皮蛋白LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁皮细胞及新表皮中均有分布,特别是新合成的外表皮顶端。【结论】成功获得飞蝗LmKnk3-5′多克隆抗体,证明其特异性良好。LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁新合成的外表皮顶端分布较多。研究结果为飞蝗表皮蛋白LmKnk3-5′功能研究提供了蛋白水平的证据。