中华蜜蜂工蜂和雄蜂的触角感受器差异

【目的】了解中华蜜蜂工蜂和雄蜂触角感受器的类型、形状和数量,以探明工蜂和雄蜂在信息交流和对化学气味敏感性程度差异的原因,为丰富蜜蜂行为学和蜜蜂生物学提供参考资料。【方法】采用扫描电镜技术,观察工蜂和雄蜂触角切片,对比分析其感受器类型、数量的差异。【结果】工蜂和雄蜂的触角均呈膝状,鞭节、柄节总长度、粗细差异两者均不显著,但工蜂的鞭节由10节组成,而雄蜂的鞭节由11节组成;触角感器有板形感器(Spl)、刺形感器(Sch)、B9hm氏鬃毛、毛形感器(Str)、锥形感器(Sba)和钟形感器(Sca),雄蜂触角板形感器与工蜂触角板形感器的形状大小无差异,但雄蜂触角板形感器的数量显著多于工蜂;叶状刚毛着生于鱼鳞状表皮上,且只存在于雄蜂触角中。【结论】中华蜜蜂工蜂和雄蜂触角感受器的类型和数量差异可能是雄蜂和工蜂对不同气味敏感程度不同的原因之一。     

性成熟雄蜂与外勤工蜂触角差异蛋白质组分析

【目的】通过对性成熟雄蜂与外勤工蜂差异蛋白质组进行定量及定性的分析,以期探明雄蜂与工蜂触角发挥生理功能的分子基础。【方法】将性成熟雄蜂与外勤工蜂的触角蛋白质进行双向凝胶电泳以获得蛋白质的分子量、等电点和表达量信息,利用MALDI-TOF质谱以及MASCOT软件对部分表达量有差异的蛋白质进行鉴定,并对其进行表达量的聚类分析。【结果】性成熟雄蜂和外勤工蜂的触角各表达了484、479个蛋白质,其中共有蛋白质416个。在表达的蛋白质中,有102个蛋白质在雄蜂触角中高表达,有80个蛋白质在工蜂触角中高表达。9个已鉴定的差异蛋白质在功能上主要参与转运、激素代谢和能量代谢。雄蜂触角中高表达的有气味结合蛋白质14、脂肪酸结合蛋白质(2个)、保幼激素酯酶(2个)、酰基辅酶A脱氢酶、bellwether异构体1以及CG31974-PA;在工蜂触角中高表达的仅有触角特异蛋白质2。【结论】性成熟雄蜂与外勤工蜂表达的总蛋白质的数量没有明显的差异,且大部分为共有蛋白质,说明工蜂与雄蜂触角的分子进化过程是较为保守的。在雄蜂触角中高表达的参与转运以及代谢的蛋白质,可能是为了使雄蜂婚飞过程中能够更灵敏的接受蜂王的性信息素,准确发现并找到蜂王进行交尾;而在工蜂触角中高表达的触角特异蛋白质2,可能在快速准确寻找蜜粉源、接受巢内外信息素以识别同伴的过程中起着重要作用。     

甜菜夜蛾触角气味受体基因OR18的克隆和表达定位

【目的】从甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）成虫触角中克隆气味受体基因,研究受体基因在虫体不同组织和触角不同感受器中的表达分布,从而探讨受体基因的功能。【方法】通过PCR结合RACE技术克隆气味受体基因的全长序列,利用实时定量PCR检测其在不同组织中的表达,采用原位杂交确定其在触角不同感受器中的分布。【结果】通过同源克隆的方法从甜菜夜蛾触角中获得1条740 bp的基因片段,通过RACE技术获得全长序列并命名为SexiOR18（GenBank登录号JN873314）。SexiOR18 cDNA全长1 618 bp,开放阅读框长度为1 194 bp,编码398个氨基酸。序列比对和进化树分析结果显示SexiOR18与其它鳞翅目昆虫尤其是夜蛾科昆虫的OR18具有很高的相似性。实时定量PCR检测结果显示,SexiOR18主要在成虫触角中表达,且在雌虫中的表达量显著高于雄虫,SexiOR18在成虫其它组织和幼虫触角中无明显表达。原位杂交结果显示,SexiOR18主要在毛形感器和锥形感器下表达,而在腔锥形感器和刺形感器下没有表达。【结论】SexiOR18在感受性信息素和普通气味的毛型感器和锥形感器中都有分布,推测其可能参与了性信息素和普通气味分子的识别。     

中华蜜蜂离子型受体AcerIR76b、AcerIR75f.1生物信息学和差异表达分析

【目的】从中华蜜蜂Apis cerana cerana触角转录组测序结果中筛选获得中华蜜蜂离子型受体IR76b、IR75f.1的基因序列,对其进行蛋白结构预测和表达谱分析,为该基因的功能研究提供依据。【方法】利用多种生物信息学软件对其编码蛋白的理化特性进行分析;采用qRT-PCR技术对AcerIR76b、AcerIR75f.1在中蜂1日龄工蜂和采集蜂、1日龄雄蜂和性成熟雄蜂各部位(触角、头、胸、腹和足)中mRNA的表达情况进行比较分析。【结果】成功获得了AcerIR76b、AcerIR75f.1的完整开放阅读框ORF序列,全长分别为1 635 bp和1 686 bp,分别编码545、562个氨基酸。预测AcerIR76b分子量为63.09 ku,AcerIR75f.1分子量为62.28 ku,它们均具有3个跨膜结构。qRT-PCR结果显示,AcerIR76b在1日龄工蜂和采集蜂、1日龄雄蜂和性成熟雄蜂的各部位中均有表达,但在触角中的表达量极显著的高于其它部位(P0.01);AcerIR75f.1在1日龄工蜂和采集蜂中,均在触角中高表达,而在1日龄雄蜂和性成熟雄蜂中,均在足部高表达。【结论】AcerIR76b和AcerIR75f.1的编码产物均具有昆虫离子型受体的典型结构特征,2个离子型受体在中华蜜蜂工蜂和雄蜂各个部位均有表达,推测其不仅参与气味分子的识别过程,在味觉感知中也同样发挥着一定作用。     

美洲斑潜蝇气味结合蛋白OBP13的鉴定与功能

【目的】克隆与鉴定美洲斑潜蝇（Liriomyza sativae）气味结合蛋白（odorant binding protein,OBP）基因,并对其序列特征、表达情况、系统发育及蛋白功能进行研究,为深入研究美洲斑潜蝇嗅觉机制提供依据。【方法】通过PCR技术克隆美洲斑潜蝇OBP13编码区全长,用DNAMAN对其进行序列分析,用BLAST进行同源性比较,并使用MEGA6.0构建进化树,进行系统发育分析。通过实时定量PCR对OBP13在美洲斑潜蝇不同组织中的表达情况进行分析。构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白纯化,获取重组蛋白。设定荧光分光光度计的激发波长为337 nm,以1-NPN为荧光探针,研究OBP13与25种不同气味配基的结合特性。使用间接免疫荧光染色技术及制备的OBP13的特异性多克隆抗体,对其在组织中的分布情况进行定位。将美洲斑潜蝇触角进行包埋、切片、免疫染色,并在激光共聚焦显微镜下进行观察,了解OBP13在触角感器中的亚细胞分布。【结果】获得了一个美洲斑潜蝇气味结合蛋白基因,命名为LsatOBP13（GenBank登录号：KT250751）。LsatOBP13开放阅读框全长462 bp,编码153个氨基酸,预测成熟蛋白分子量为17.80 kD,等电点为5.75,N-末端的前17个氨基酸为信号肽序列。具有4个保守的半胱氨酸位点,为Minus-C OBP。系统发育分析显示,其与地中海实蝇CcapOBP99a-like位于同一小分支上,亲缘关系较近。检测LsatOBP13在不同组织的表达水平,发现LsatOBP13在触角中的表达量远远高于其他组织。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。对25种气味配基的结合能力检测,发现LsatOBP13与反式-2-己烯醛、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、α-紫罗兰酮、苯并噻唑、β-紫罗兰酮具有较强的结合能力,解离常数分别为12.592、10.995、11.165、11.224、10.336、9.218 μmol·L^-1,其中与β-紫罗兰酮亲和能力最强。通过免疫荧光定位,发现其在触角中主要定位在毛形感器和锥形感器上,在触角嗅觉窝及触角芒连接处也有分布。【结论】美洲斑潜蝇OBP13为非典型的气味结合蛋白Minus-C OBP。表达情况、气味结合特性、免疫定位结果表明,OBP13主要存在于美洲斑潜蝇触角中,参与触角对绿叶植物中大量存在的气味物质的识别过程,推测其在美洲斑潜蝇嗅觉识别、寄主植物定位中发挥功能。     

白蜡吉丁啮小蜂触角感觉器的扫描电镜观察

【目的】明确白蜡窄吉丁（Agrilus planipennis）的优势寄生性天敌—白蜡吉丁啮小蜂（Tetrastichus planipennisi）（膜翅目：姬小蜂科）触角及感觉器的外部形态特点。【方法】对白蜡吉丁啮小蜂触角的形态特征、感觉器的类型、形态、数量和分布特点进行扫描电镜观察,并对雌、雄蜂触角感觉器进行性别间差异比较。【结果】白蜡吉丁啮小蜂触角呈膝状,由柄节、梗节和鞭节组成,雌蜂鞭节有5亚节,雄蜂鞭节有4亚节。触角上着生有板形感器（Ⅰ型和Ⅱ型）、毛形感器（Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型）、指形感器、刺形感器、锥形乳头状感器和Böhm氏鬃毛,其中,板形感器Ⅰ型仅分布于雄蜂棒节,雌蜂未见分布,毛形感器Ⅱ型和Ⅲ型仅分布于雌蜂触角,雄蜂未见分布,雌蜂的毛形感器总数量显著多于雄蜂。【结论】白蜡吉丁啮小蜂触角呈膝状,共有6种类型感器,雌、雄蜂的感器类型、数量和分布规律存在差异,具有明显的性二型现象。     

豌豆蚜温度受体基因Painless的克隆及时间和组织表达

【目的】从豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）触角中克隆候选的温度受体基因--Painless,分析该基因所编码的蛋白结构特点,研究该基因在昆虫不同发育时期和不同组织中的表达谱,探讨该基因的功能。【方法】通过生物信息学的方法,使用果蝇（Drosophila melanogaster）Painless从豌豆蚜基因组数据库AphidBase中预测ApisPainless的假定全长序列,之后根据预测得到的假定全长序列,使用Primer premier 5.0 设计全长引物,使用RT-PCR方法从豌豆蚜触角cDNA中克隆ApisPainless的全长序列,并应用DNAMAN软件对预测序列与克隆序列进行比对,确定克隆序列与预测序列一致后,使用在线工具SMART（simple modular architecture research tool）对克隆得到的ApisPainless蛋白结构进行预测,分析其序列N端的锚蛋白重复序列及跨膜域,通过使用在线比对软件Clustal Omega对ApisPainless与DmelPainless的3个可变剪切型（isoform A、B、C）进行多序列比对,分析ApisPainless的可变剪切类型,通过构建昆虫TRP（transient receptor potential）离子通道超家族的进化树,分析ApisPainless的进化地位,并通过绘图直观地比较TRPA亚家族4个成员TRPA1、Painless、Pyrexia和Water witch的序列长短及N端锚蛋白重复序列的差异,使用实时定量荧光PCR技术,研究ApisPainless在1-4龄若虫以及成虫这5个不同发育时期的相对表达量,以及其在豌豆蚜成虫的触角、头、足和胸腹这4个不同组织中的相对表达量。【结果】预测并克隆得到ApisPainless全长序列,该基因的全长序列为2 832 bp,编码943个氨基酸,蛋白结构分析表明ApisPainless具有8个锚蛋白重复序列以及6次跨膜结构,通过序列比较发现ApisPainless与DmelPainless isform A的相似性最高,达到42.3%。进化树分析结果表明昆虫TRP超家族分为TRPA、TRPC、TRPM、TRPN、TRPV、TRPP和TRPML 7个亚家族,而ApisPainless聚类于TRPA亚家族Painless一支,在TRPA亚家族TRPA1、Painless、Pyrexia和Water witch这4个成员中,TRPA1的序列最长,约为1 200个氨基酸,其后依次是Water witch、Pyrexia和Painless,氨基酸数目约有920-1 000个。从N端的锚蛋白重复序列上看,Water witch和Pyrexia约有9个重复序列,Painless约为8个,而TRPA1则高达15-16个,发育时期表达谱分析结果显示ApisPainless在豌豆蚜的各个发育阶段均有表达,其中以1龄若虫期表达量最高。组织表达谱分析结果显示,ApisPainless在豌豆蚜的触角、头、足和胸腹各组织中均有表达,其中以在触角中的表达量最高,足中的表达量居其次。【结论】克隆得到的ApisPainless是TRPA亚家族Painlss基因,其在触角及足中表达量高,推测其功能可能类似于果蝇的Painless,参与高温伤害识别、机械刺激识别及味觉探测等过程。     

中红侧沟茧蜂非典型气味受体的克隆及组织特异性表达

 【目的】研究中红侧沟茧蜂Microplitis mediator非典型气味受体的表达谱。【方法】使用RT-PCR法克隆得到中红侧沟茧蜂非典型气味受体基因序列。使用实时荧光定量PCR法研究其表达谱。【结果】克隆得到中红侧沟茧蜂非典型气味受体全长基因。该基因在触角中特异性表达。在雌虫触角中羽化当天达到最大表达量,雄虫触角中在羽化前d阶段达到最大表达量。【结论】该非典型气味受体在中红侧沟茧蜂触角中特异存在。     

异凹纹胡蜂触角感器的扫描电镜观察

【目的】弄清异凹纹胡蜂(Vespa velutina variana van der Vecht)触角感器类型与结构特征。【方法】利用扫描电镜对蜂王、雄蜂和职蜂触角感器的形状、种类和超显微结构进行了观察。【结果】异凹纹胡蜂触角呈膝状,包括柄节、梗节和鞭节3部分,蜂王和职蜂鞭节分10节,雄蜂鞭节分11节;触角感器共有5种,分别为毛形感器、锥形感器、板形感器、刺形感器和腔锥形感器,其中除腔锥形感器外,其它4种感器均有2个亚型。以毛形感器数量最多,分布范围最广泛;各种感器主要分布于鞭节上;蜂王、职蜂和雄蜂感器的类型相同,分布范围基本相似,仅雄蜂触角平均长度较蜂王和职蜂长。【结论】异凹纹胡蜂触角上共有5种感器,其雄蜂触角总长最长。弄清了异凹纹胡峰触角感器的类型,为今后研究异凹纹胡蜂触角感器的具体功能及机制奠定了基础,也为进一步了解其触角与行为间的关系提供基础资料。     

中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP7的表达及结合特性

目的 中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）是我国本土蜂种,也是重要的传粉昆虫和经济昆虫。气味结合蛋白（odorant binding protein,OBP）是蜜蜂嗅觉感知中的关键蛋白。在前人对中蜂AcerOBP7基因序列特征分析的基础上,本研究进一步对其表达特性及与气味物质的结合能力进行探究,为揭示气味结合蛋白在中蜂嗅觉系统中的作用提供基础数据。 采用qRT-PCR检测AcerOBP7在工蜂不同组织和发育阶段的表达特性;通过原核表达系统获得AcerOBP7融合蛋白,使用Ni-NTA柱进行蛋白纯化;采用荧光竞争结合法,以1-NPN（N-phenyl-1-naphthylamine）为荧光探针,测定AcerOBP7与信息素及植物挥发物的结合能力;设计并合成dsAcerOBP7,采用饲喂法对该基因进行沉默,通过qRT-PCR测定沉默效率;结合RNAi,利用EAG检测并比较对照组与干扰组中蜜蜂触角对待测物质反应值的差异。 结果 qRT-PCR结果显示,AcerOBP7 mRNA在工蜂触角中的表达量极显著高于其他组织（P<0.01）,且在20日龄时表达量最高,在1日龄时表达量最低。成功构建了pET28a/AcerOBP7表达载体,通过大肠杆菌原核表达系统获得了高纯度的重组蛋白。与37种配体分子的荧光竞争结合试验表明,AcerOBP7与9-ODA、1-壬醇结合能力最强,Ki值均为1.85 µmol·L^-1,其次与(+)-柠檬烯、1-辛烯-3-醇、芳樟醇、反式肉桂酸乙酯、桉树脑、(+)-3-蒈烯及壬醛有较强的结合活性,Ki 值分别为1.87、2.66、2.72、3.05、3.88、4.14和4.40 µmol·L^-1,与所选择的幼虫信息素均无结合能力。使用饲喂dsRNA的方法成功干扰了AcerOBP7的表达,干扰效率最高可达70.63%。干扰后的EAG试验表明,中蜂触角对所测气味物质的反应强度均有所下降,其中1-辛烯-3-醇、壬醛、桉树脑和9-ODA的EAG相对值显著降低（P<0.05）。 结论 AcerOBP7在中蜂采集蜂触角中高表达,重组蛋白能与多种气味分子结合,表明AcerOBP7是一种广谱型结合蛋白,推测其可能在工蜂采集和哺育蜂王的行为中发挥着重要作用。另外,1-辛烯-3-醇、壬醛、桉树脑和9-ODA可能是AcerOBP7结合特异性较高的配体物质。     

中华蜜蜂气味结合蛋白基因AcerOBP14的克隆及时空表达

【目的】克隆获得中华蜜蜂(Apis cerana cerana)Acer OBP14基因序列,并对其蛋白结构进行预测,分析其在不同组织和发育阶段的时空表达差异,为该基因的功能研究提供参考。【方法】以中华蜜蜂全组织c DNA为模板利用RT-PCR技术扩增和克隆获得Acer OBP14 c DNA全长序列,并提交至Gen Bank数据库;利用多种生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;采用MEGA5.2软件中的邻位相连法(neighbor-joining,NJ)构建Acer OBP14及其同源膜翅目昆虫OBPs的系统发育树;通过实时荧光定量PCR技术分析Acer OBP14在1、5、10、15、20、25和30日龄中华蜜蜂不同组织(触角、头、胸、腹、足和翅)中m RNA的表达情况。【结果】克隆获得了中华蜜蜂气味结合蛋白基因Acer OBP14的c DNA序列(Gen Bank登录号为KT24648)。Acer OBP14的开放阅读框(ORF)长度为408 bp,编码135个氨基酸,预测其蛋白分子量为15.08 k D,理论等电点为5.44,有信号肽,无跨膜结构,且第18—127位氨基酸之间存在一个昆虫气味结合蛋白家族PBP-GOBP superfamily保守结构域;存在多个比较明显的疏水区域,可能是脂溶性气味分子的结合位点;含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。亚细胞定位分析表明,Acer OBP14属于分泌型蛋白,主要集中在内质网-高尔基体-质膜分泌途径上。Acer OBP14蛋白具有7个α螺旋,α1—α6属于典型OBPs核心螺旋,α7位于C端且暴露在蛋白表面。氨基酸同源序列比对结果显示,Acer OBP14与西方蜜蜂Amel OBP14的氨基酸序列一致性最高,达到86%;其次是大蜜蜂Ador GOBP56a-like,一致性为55%。系统进化树分析表明,同为蜜蜂属的中华蜜蜂Acer OBP14、西方蜜蜂Amel OBP14、大蜜蜂Ador GOBP56a-like、中华蜜蜂Acer OBP21和小蜜蜂Aflo GOBP56d-like聚为一个分支,切叶蜂属的苜蓿切叶蜂Mrot GOBP56a-like、侧沟茧蜂属的毁侧沟茧蜂Mdem GOBP83a-like、壁蜂属的角额壁蜂Ocor OBP3和熊蜂属的Bter GOBP56d-like和Bimp GOBP56d-like聚为另一大分支。荧光定量PCR结果显示,Acer OBP14在成蜂不同发育期的触角、头、胸、腹、足和翅中均有表达,其表达程度有差异。1日龄工蜂的胸部表达量最高,触角次之,且两者均极显著高于头、腹、足和翅(P0.01);其他日龄工蜂触角表达量均极显著高于其他组织(P0.01),其中20日龄工蜂的触角表达量最高。从各组织在不同发育阶段的表达量来看,触角的表达量在1日龄最低,极显著地低于其他日龄(P0.01);5、10日龄逐渐增加,15日龄突然下降,20日龄达到最高,极显著高于其他日龄(P0.01);之后又呈逐渐下降趋势。头、胸、腹、足和翅膀表达量总体上随日龄增加而呈下降趋势,5日龄之后大幅下降,之后趋于平稳且呈低丰度表达。【结论】Acer OBP14属于Minus-C OBP亚家族,具有PBP-GOBP家族的典型结构;组织表达谱结果暗示,Acer OBP14属普通气味结合蛋白GOBP,在中华蜜蜂中除嗅觉识别之外还参与其他生理功能。     

中华蜜蜂二倍体雄蜂人工培育及形态测定

【目的】研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana）二倍体雄蜂并进行人工培育,测定其形态指标,明确中华蜜蜂二倍体雄蜂的生物学特性。【方法】采用复式移虫方法培育中华蜜蜂蜂王,待蜂王性成熟时进行CO₂麻醉处理后放回原群,用糖水进行奖励饲喂。蜂王产下大量未受精卵,待雄蜂出房后采用颜料进行标记。雄蜂性成熟后,利用蜂王人工授精技术使蜂王与本群子代雄蜂进行母子回交（多雄交配）。控制蜂王产卵,将工蜂巢房中刚孵化的幼虫移至恒温恒湿培养箱（相对湿度：95%;温度：35℃）中进行人工培育。幼虫前3日龄食物配制为：蜂王浆90％,无菌水10％;第4-6日龄食物成分比例为：蜂王浆50％,葡萄糖6％,果糖6％,酵母抽出物1％,无菌水37％;从第7日龄起食物比例为：蜂王浆43％,葡萄糖9％,果糖9％,酵母抽出物1％,无菌水38％,直到幼虫进入排便期为止。采用流式细胞仪对人工培育和蜂群工蜂巢房出房的雄蜂进行倍性鉴定,并对蜂群工蜂巢房出房的单倍雄蜂和二倍体雄蜂进行形态指标测定比较。【结果】室内人工培育的中华蜜蜂总羽化率偏低,平均为36％,其中26.9％为雄蜂;通过流式细胞仪分析雄蜂倍性发现人工培育的雄蜂92％为二倍体,蜂群工蜂巢房中出房的雄蜂82%为二倍体雄蜂;形态指标测定显示,二倍体雄蜂的初生重与生殖器官重分别为99.78和6.05 mg,均比单倍体雄蜂（分别为105.64和7.02 mg）显著偏小,而前翅长、前翅宽、翅钩数等指标差异不显著。【结论】中华蜜蜂近亲交配的蜂群会产生二倍体雄蜂,部分二倍体雄蜂可在蜂群中发育至成蜂出房,其形态指标与单倍体雄蜂存在一定差异。     

应用微卫星DNA技术研究中华蜜蜂群内工蜂监督效果

【目的】研究不同中华蜜蜂（Apis cerana cerana）群内的工蜂繁殖现象,探讨蜂群的工蜂监督效果。【方法】以中华蜜蜂为试验材料,对处女蜂王分别进行单雄和双雄人工授精,并以蜂王自然交尾的蜂群作为对照。蜂王成功繁殖后7周,利用蜜蜂微卫星DNA技术检测蜂群内的雄蜂是由蜂王产的未受精卵发育而成,还是由工蜂产的未受精卵发育而成。【结果】所有蜂群中的雄蜂都是由蜂王产的未受精卵发育而成。【结论】在人工授精和自然交尾蜂群中都明显存在工蜂监督行为。     

转录组学分析意大利蜜蜂脑部哺育行为相关基因

【目的】意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）哺育行为在维护蜂群稳定和生产蜂王浆方面发挥重要作用。本研究通过人工组建蜂群获得相同日龄的哺育蜂和采集蜂,筛选出排除日龄因素干扰后哺育蜂脑部与哺育行为密切相关的差异表达基因,揭示哺育蜂脑部调控哺育行为的分子网络。【方法】通过人工组建蜂群的方法获得3日龄工蜂、10日龄哺育蜂和采集蜂、21日龄哺育蜂和采集蜂,解剖各组工蜂头部获得脑组织样本,应用RNA-seq技术对5组脑部样本（3日龄工蜂、10日龄哺育蜂、10日龄采集蜂、21日龄哺育蜂、21日龄采集蜂）中基因表达量进行转录组测序的全面分析,筛选出哺育蜂脑部哺育行为密切相关的差异表达基因,并对这些差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。同时利用实时荧光定量PCR（qPCR）对随机选取的4个差异表达基因的表达模式进行验证。【结果】RNA-seq分析筛选得到32个与哺育蜂哺育行为密切相关的差异表达基因,这些基因在10日龄哺育蜂脑中表达量均显著高于3日龄工蜂、10日龄采集蜂、21日龄采集蜂,且在21日龄哺育蜂脑中的表达量也显著高于21日龄采集蜂。GO富集分析发现上调差异表达基因主要参与氧化还原酶活性、气味结合、跨膜运输等功能。KEGG富集结果显示,上调的差异表达基因主要参与蛋白质代谢（核糖体）、能量代谢（氧化磷酸化、碳代谢、三羧酸循环、淀粉和蔗糖代谢、氮代谢、其他聚糖降解通路）、信号转导（Toll和Imd信号通路、光传导、鞘脂代谢）、消化作用（溶酶体）,其中显著性富集在鞘脂代谢和其他聚糖降解通路。qPCR结果显示3个上调差异表达基因（LOC409709、LOC551813、LOC409708）和1个下调差异表达基因（LOC551165）表达模式的检测结果与测序数据一致。【结论】通过对3日龄工蜂、10日龄哺育蜂、10日龄采集蜂、21日龄哺育蜂、21日龄采集蜂5组样本脑部进行全面分析,获得相同日龄哺育蜂和采集蜂脑部基因的转录组图谱,分析得到了脑部哺育行为相关的32个上调差异表达基因。哺育蜂脑部的差异表达基因主要通过信号转导和能量代谢等途径调控哺育蜂的哺育行为。     

中华蜜蜂CREB基因的克隆及表达

【目的】克隆中华蜜蜂（Apis cerana cerana）的cAMP反应原件结合蛋白（cAMP response element binding protein,CREB)基因全长cDNA序列,预测该基因及其编码蛋白的理化性质,并解析中华蜜蜂CREB在大脑中的表达特征,为研究该基因在中华蜜蜂学习记忆过程中的生物学功能提供基础。【方法】以中华蜜蜂为试验材料,解剖其大脑获得脑组织,提取大脑组织的总RNA。在此基础上,利用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂大脑的CREB基因(AcCREB),然后用DNAstar软件中的Seqman程序将CREB正反向测序后的序列拼接获得CREB基因的cDNA序列,其氨基酸序列通过Bioedit软件按照六框翻译而成;用BLASTn和BLASTp进行序列比对分析;用ClustalX进行多重序列比对和同源性比较;用MEGA软件的邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树,明确其系统进化关系。并通过SMART数据库分析AcCREB的结构域。另外,将解剖好的蜜蜂大脑制成石蜡切片,并采用地高辛原位杂交技术分析AcCREB在中华蜜蜂大脑中的分布表达情况。【结果】中华蜜蜂CREB基因的cDNA全序列全长890 bp,编码240个氨基酸残基,序列提交到GenBank（登录号为KC814690）。其编码的蛋白预测分子质量为25.691 kD,等电点为5.82。结构域分析结果显示,该蛋白具有AA 89-131的PKID和AA 176-237的BRLA两个保守结构域。氨基酸序列比对结果显示,中华蜜蜂与西方蜜蜂、熊蜂、切叶蜂、大黄蜂、印度跳蚁、家蚕、埃及伊蚊、疟原虫、人类、小鼠10个物种的同源蛋白相似度分别为98.76%、98.35%、97.11%、94.09%、72.22%、58.97%、44.69%、41.69%、36.89%、36.89%。系统发育树显示该基因编码的蛋白质与西方蜜蜂的CREB亲缘关系最近,与熊蜂、大黄蜂之间的亲缘关系次之。另外,经过地高辛原位杂交技术处理后,在中蜂大脑蘑菇体的凯尼恩细胞、触角叶周围的细胞和大脑的髓质与小叶之间的细胞均有阳性着色,而且AcCREB在中华蜜蜂工蜂左右大脑的阳性着色不对称。【结论】AcCREB的氨基酸序列与西方蜜蜂、熊蜂、切叶蜂、大黄蜂高度同源,且基因在大脑中的分布暗示其可能参与了中华蜜蜂学习记忆过程。     

中华蜜蜂和意大利蜜蜂耐寒性能差异比较

【目的】研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)体内抗寒系统的组成,为探究中蜂和意蜂耐寒性能的差异提供理论依据。【方法】试验选取室外相同环境条件越冬的中蜂和意蜂各5群,于2015年12月20日每群随机选取蜜蜂立即测定两者的过冷却点、冰点,比较其耐寒性能差异。然后分别测定蜂体游离水、结合水、脂肪、糖原和蛋白质含量以及海藻糖酶的活性。利用高效液相色谱测定血淋巴中山梨醇、海藻糖、甘露醇的含量。在海藻糖的生物合成通路中确定4个重要调控基因,选择β-action和β-肌动蛋白分别作为中蜂和意蜂的内参基因,采用实时荧光定量PCR检测中蜂和意蜂海藻糖4个相关调控基因在越冬期时m RNA相对表达量的差异。【结果】越冬期中蜂和意蜂过冷却点差异显著,中蜂的过冷却点显著低于意蜂(P0.05),但二者冰点没有显著性差异(P0.05);越冬期中蜂和意蜂蜂体含水量存在显著差异,中蜂体内游离水含量显著低于意蜂(P0.05),而结合水含量显著高于意蜂(P0.05);越冬中期蜂体脂肪含量在两蜂种间差异不显著(P0.05);中蜂和意蜂蜂体和血淋巴蛋白质含量差异不显著(P0.05);意蜂在越冬期时体内糖原含量明显低于中蜂,并且差异显著(P0.05);中蜂血淋巴中甘露醇、山梨醇含量接近于意蜂的两倍,海藻糖含量也相对高于意蜂,差异显著(P0.05);中蜂蜂体和血淋巴的海藻糖酶活性均显著低于意蜂(P0.05);以中蜂为对照组,实时荧光定量PCR检测意蜂的海藻糖酶基因(Tre-2)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)表达量明显高于中蜂(P0.05);而基因Tre-1表达情况相反;海藻糖合成酶基因(TPS)表达量在中蜂和意蜂体内无显著差异(P0.05)。【结论】与意蜂相比,中蜂能够通过降低体内游离水含量,提高糖原和小分子糖含量,调节海藻糖酶活性和相关基因表达等方式降低体内过冷却点,提高自身耐寒性能。     

西方蜜蜂工蜂不同虫态发育的转录组学分析

【目的】基于转录组学对西方蜜蜂工蜂不同虫态间的差异表达基因（DEGs）进行筛选和功能注释分析,揭示与工蜂生长发育相关的信号通路,为深入解析工蜂生长发育的分子调控机理提供基础数据。【方法】以西方蜜蜂工蜂的3日龄幼虫、1日龄蛹和1日龄羽化工蜂3个虫态为研究对象,利用llumina NovaSeq 6000平台进行转录组测序,采用DESeq2筛选不同虫态样品间的表达差异基因,然后分别进行GO功能注释分析及KEGG信号通路富集分析,并通过实时荧光定量PCR进行验证。【结果】经转录组测序,在西方蜜蜂工蜂3日龄幼虫与1日龄蛹间筛选出4823个差异表达基因（51.86%上调,48.14%下调）,在1日龄蛹与1日龄羽化工蜂间筛选出3295个差异表达基因（57.51%上调,42.49%下调）,在3日龄幼虫与1日龄羽化工蜂间筛选出5267个差异表达基因（52.95%上调,47.05%下调）。GO功能注释分析结果显示,3日龄幼虫与1日龄蛹间的差异表达基因注释到43个GO功能条目,1日龄蛹与1日龄羽化工蜂间的差异表达基因注释到45个GO功能条目,3日龄幼虫与1日龄羽化工蜂间的差异表达基因注释到44个GO功能条目,主要涉及细胞过程、细胞部分及结合等。KEGG信号通路富集分析发现,3日龄幼虫与1日龄蛹间有2905个差异表达基因富集到332条KEGG信号通路上,其中17条KEGG信号通路呈显著富集,涉及核糖体、氧化磷酸化和昆虫激素生物合成等;1日龄蛹与1日龄羽化工蜂间有1644个差异表达基因富集到331条KEGG信号通路上,其中45条KEGG信号通路呈显著富集,涉及氧化磷酸化、生热作用和胰岛素分泌等;3日龄幼虫与1日龄羽化工蜂间有2958个差异表达基因富集到337条KEGG信号通路上,其中14条KEGG信号通路呈显著富集,涉及核糖体、蛋白酶体和胰岛素分泌等。6个随机挑选差异表达基因的实时荧光定量PCR检测结果与转录组测序结果相符,即转录组测序结果可靠。【结论】昆虫激素生物合成通路相关差异表达基因调控与西方蜜蜂工蜂各虫态JH滴度变化规律一致,氧化磷酸化信号通路则与各虫态的营养摄入和活动行为相关,而胰岛素分泌通路涉及各虫态的营养调控、脂肪体合成及细胞凋亡。可见,昆虫激素生物合成、胰岛素分泌和氧化磷酸化3种信号通路在西方蜜蜂工蜂幼虫、蛹和成虫的发育调控中发挥着重要作用。