意大利蜜蜂工蜂幼虫饲粮的适宜亚硒酸钠添加水平

【目的】探索意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂幼虫日粮的适宜亚硒酸钠水平,为意大利蜜蜂工蜂幼虫发育阶段硒的营养需要提供依据。【方法】共取1 440只1日龄意大利蜜蜂工蜂幼虫并平均分为两批,每批720只,一批用于化蛹率、羽化率的测定,一批用于理化指标和分子指标的测定。两批幼虫均按单因素完全随机设计分成6组,对照组饲喂基础日粮,试验组分别饲喂亚硒酸钠添加量为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·kg~(-1)的日粮,每组5个重复,每个重复24只幼虫。取3、5、7日龄幼虫测定体重、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、酚氧化酶(phenoloxidase,PO)活性,取5日龄幼虫测定硒磷酸合成酶(selenide water dikinase,Sel D)、丝氨酰-t RNA合成酶(seryl-t RNA synthetase,Ser Rs)、SECIS-结合蛋白1(SECIS-binding protein 1,Sbp1)、SECIS-结合蛋白2(SECIS-binding protein 2,Sbp2)基因表达量;7日龄时统计化蛹率。【结果】与对照组相比,日粮添加亚硒酸钠水平为0.2—0.6 mg·kg~(-1)时显著提高了幼虫的T-AOC(P0.05),日粮添加亚硒酸钠水平为0.2—0.8 mg·kg~(-1)时显著提高了幼虫的T-SOD活性(P0.05),各试验组均显著降低了幼虫的MDA含量(P0.05)。日粮添加亚硒酸钠水平为0.4 mg·kg~(-1)时幼虫的PO活性显著高于对照(P0.05)。日粮添加亚硒酸钠水平为0.6 mg·kg~(-1)时5日龄幼虫的Sel D、Ser Rs、Sbp1、Sbp2基因表达水平显著高于对照(P0.05)。日粮添加亚硒酸钠水平为0.4 mg·kg~(-1)时幼虫化蛹前体重显著高于对照(P0.05)。与对照组相比,日粮添加亚硒酸钠水平为0.2 mg·kg~(-1)时,幼虫化蛹率显著提高(P0.05)。【结论】人工饲养条件下基础日粮硒水平为0.21 mg·kg~(-1)时,根据幼虫化蛹前体重、化蛹率做拟合曲线得出意大利蜜蜂工蜂幼虫日粮适宜亚硒酸钠添加水平为0.24—0.33 mg·kg~(-1),即意大利蜜蜂工蜂幼虫的适宜硒水平为0.32—0.36 mg·kg~(-1)。     

微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定意大利蜜蜂雄蜂蛹中的硒

雄蜂蛹是一种营养价值较高的蜜蜂产品,本研究试图建立一种微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定意大利蜜蜂雄蜂蛹中硒含量的方法。将适量样品加入硝酸后进行微波消解前处理,利用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)对硒元素进行测定,通过在线加入标准溶液实现对样品的实时校正,内标为~(103)Rh。结果表明,该方法线性范围宽,在0~0.1mg/l范围内线性关系良好,相关系数为1.0000,检出限为0.045μg/ml,加标回收率为97.3%~105.4%。微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定意大利蜜蜂雄蜂蛹中硒含量的方法准确、灵敏、简便,可为雄蜂蛹微量元素的测定提供技术方法。     

中华蜜蜂Apidaecin的重组表达及其抗菌活性

【目的】研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana）抗菌肽Apidaecin在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中的重组表达,并验证纯化后的重组抗菌肽Apidaecin在体内和体外是否具有抗菌活性,为开发新型、安全具有抗菌和免疫调节功能的抗菌肽制剂提供理论依据。【方法】以意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）Apidaecin为模板,克隆出中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin,成功构建his-pHT43/Apidaecin表达载体,并参照MoBiTec所提供的制备方法成功制得枯草芽孢杆菌感受态细胞,现配现用,以保证其活性并得以在枯草芽孢杆菌表达系统中重组表达。使用His标签蛋白纯化试剂盒（可溶性蛋白）进行表达蛋白的分离纯化,使用Easy II Protein Quantitative Kit（BCA）试剂盒测定浓度。纯化得到的重组抗菌肽Apidaecin作用于大肠杆菌K88,在体外进行抑菌圈试验和最小浓度抑菌法测定;在体内,以小鼠为试验动物模型,试验组小鼠腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin,阴性对照组注射相同体积的生理盐水,阳性对照组注射相同体积的头孢霉素,然后人为感染大肠杆菌K88,感染24 h后对小鼠进行解剖,取得肠道样品和血液样品,并从肠道屏障和免疫功能两个方面探讨重组抗菌肽Apidaecin对感染大肠杆菌K88小鼠的保护作用。使用ELISA试剂盒对染菌小鼠血清免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）与肠道sIgA水平进行测定,采用qRT-PCR法对小鼠肠道紧密连接蛋白基因（claudin-1、ZO-2）以及小鼠肠道细胞因子（促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL6和抑炎因子IL10）的转录水平进行测定。【结果】克隆得到的中华蜜蜂Apidaecin含有183 bp的碱基,编码60个氨基酸,包含Apidaecin的信号肽序列、一个基础的RR二肽以及抗菌肽Apidaecin的氨基酸序列（内含高度保守的8个氨基酸序列）,编码的蛋白质命名为AccApidaecin,其分子量为15.6 kD,等电点为5.33。在IPTG终浓度为3 mmol·L ^-1,诱导温度为30℃,诱导表达12 h后,可从1 L表达上清中纯化得到约20 mg抗菌肽。药敏试验显示,重组抗菌肽Apidaecin在体外与阴性对照相比有明显抑菌圈出现,且测得的最小抑菌浓度为10 mg·L ^-1;在小鼠体内,腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin的染菌试验组与注射生理盐水的染菌试验组相比免疫球蛋白含量差异显著(P<0.05),说明腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin能够有效缓解由大肠杆菌K88引起的小鼠免疫球蛋白含量的增加;同时,小鼠肠道相关蛋白的基因表达量也差异显著(P<0.05),说明重组抗菌肽Apidaecin能够有效保护被大肠杆菌K88侵染的小鼠肠道。【结论】在枯草芽孢杆菌中能够成功重组表达中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin,并且纯化后的中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin在体外对大肠杆菌K88有良好的抗菌效果;经腹腔注射进入小鼠体内,能够提高小鼠的免疫机能,有效抵抗大肠杆菌K88对小鼠的侵染。     

中华蜜蜂和意大利蜜蜂耐寒性能差异比较

【目的】研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)体内抗寒系统的组成,为探究中蜂和意蜂耐寒性能的差异提供理论依据。【方法】试验选取室外相同环境条件越冬的中蜂和意蜂各5群,于2015年12月20日每群随机选取蜜蜂立即测定两者的过冷却点、冰点,比较其耐寒性能差异。然后分别测定蜂体游离水、结合水、脂肪、糖原和蛋白质含量以及海藻糖酶的活性。利用高效液相色谱测定血淋巴中山梨醇、海藻糖、甘露醇的含量。在海藻糖的生物合成通路中确定4个重要调控基因,选择β-action和β-肌动蛋白分别作为中蜂和意蜂的内参基因,采用实时荧光定量PCR检测中蜂和意蜂海藻糖4个相关调控基因在越冬期时m RNA相对表达量的差异。【结果】越冬期中蜂和意蜂过冷却点差异显著,中蜂的过冷却点显著低于意蜂(P0.05),但二者冰点没有显著性差异(P0.05);越冬期中蜂和意蜂蜂体含水量存在显著差异,中蜂体内游离水含量显著低于意蜂(P0.05),而结合水含量显著高于意蜂(P0.05);越冬中期蜂体脂肪含量在两蜂种间差异不显著(P0.05);中蜂和意蜂蜂体和血淋巴蛋白质含量差异不显著(P0.05);意蜂在越冬期时体内糖原含量明显低于中蜂,并且差异显著(P0.05);中蜂血淋巴中甘露醇、山梨醇含量接近于意蜂的两倍,海藻糖含量也相对高于意蜂,差异显著(P0.05);中蜂蜂体和血淋巴的海藻糖酶活性均显著低于意蜂(P0.05);以中蜂为对照组,实时荧光定量PCR检测意蜂的海藻糖酶基因(Tre-2)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)表达量明显高于中蜂(P0.05);而基因Tre-1表达情况相反;海藻糖合成酶基因(TPS)表达量在中蜂和意蜂体内无显著差异(P0.05)。【结论】与意蜂相比,中蜂能够通过降低体内游离水含量,提高糖原和小分子糖含量,调节海藻糖酶活性和相关基因表达等方式降低体内过冷却点,提高自身耐寒性能。     

小麦胚芽作为意大利蜜蜂春繁期饲料蛋白源的研究

为探究春繁时期小麦胚芽在蜜蜂代花粉饲料中的适宜添加比例,在春繁前期,将意大利蜜蜂(Apis mellifera L.)姊妹王群,随机分为5组,每组3群,其中A组为对照组,B、C、D、E分别为添加小麦胚芽25.00%、45.00%、65.00%、83.74%的试验组。试验期共36 d,记录期间蜂群的采食量和蜂群群势,第21 d采集各群新出房工蜂,测其初生重并在之后14 d,解剖标记蜜蜂观察中肠组织发育状态,测定中肠消化酶活性;测定1日龄和14日龄工蜂的抗氧化基因SOD1、SOD2、CAT mRNA表达量。结果表明,D、E组蜜蜂采食量显著低于其它组(P0.05);D组蜂群群势增长显著高于其它组(P0.05);C组工蜂初生重最大,且显著高于B组(P0.05);C组蜂群的中肠组织发育状态显著优于A、D、E组(P0.05);D组工蜂中肠蛋白酶活性最强,且显著高于B、E组(P0.05);随着饲料中小麦胚芽添加比例的升高,抗氧化基因SOD1表达量无显著差异,SOD2、CAT基因的表达量呈现下降趋势。由此得出,饲喂小麦胚芽添加水平为45.00%~65.00%的代花粉饲料,可以促进蜂群群势的增长,提高工蜂初生重,促进中肠发育,提高中肠蛋白酶活性,但会下调SOD2与CAT基因的表达。