中华蜜蜂普通气味结合蛋白ASP2的气味结合功能模式分析

【目的】研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana）体外重组普通气味结合蛋白AcerASP2与不同气味信息的结合功能和模式。【方法】通过诱导条件的优化和纯化,在获得的重组AcerASP2蛋白基础上,研究竞争性荧光探针1-NPN及不同结构气味信息与蛋白的相互作用关系,并通过同源建模和分子对接解析蛋白与气味信息的结合模式和机理。【结果】通过条件摸索获得了可溶性表达的重组中蜂ASP2蛋白,荧光光谱分析1-NPN与AcerASP2的解离常数K1-NPN为7.38 μmol•L-1,结合位点数n为1.0321。在7种气味信息中,4-烯丙基藜芦醚亲和力最强,其IC50和解离常数KD分别达到7.09和3.46 μmol•L-1。分子对接显示AcerASP2具有1个呈狭长的口袋状的疏水性结合内腔,4-烯丙基藜芦醚绝大部分位于该预测疏水性内腔中,且与Lys74产生2个氢键。【结论】中华蜜蜂AcerASP2由于特殊的空间结构而具有较强的气味信息结合能力,且易通过与疏水内腔中的赖氨酸残基产生氢键而促进结合。     

参与烟粉虱免疫反应的clip丝氨酸蛋白酶基因分析

为了解参与烟粉虱免疫反应的clip丝氨酸蛋白酶(clip-domain serine proteases in Bemisia tabaci,Bt CLIPs)基因,对已鉴定的8个Bt CLIPs基因编码的蛋白进行序列分析,与冈比亚按蚊、家蚕、黑腹果蝇、烟草天蛾4种模式昆虫的同源蛋白进行系统进化分析,并通过q RT-PCR检测球孢白僵菌侵染烟粉虱4龄若虫后Bt CLIPs的时间表达模式。结果显示,8个Bt CLIPs基因均为含有CLIPs结构域的丝氨酸蛋白酶基因;Bt CLIP19、Bt CLIP20和Bt CLIP21独自聚在进化树的一支上;其它Bt CLIPs均与4种模式昆虫中的1种或多种同源蛋白聚在一起;与对照相比,8个Bt CLIPs基因受球孢白僵菌侵染后在不同时间的相对表达量均上调,但诱导程度不同,48 h的相对表达量达最高,其中Bt CLIP19上调表达最明显,为对照组的71倍。研究表明,8个Bt CLIPs可能参与烟粉虱对真菌侵染的免疫反应,并成为烟粉虱生物防治的新靶标。     

不同葡萄品种臭氧保鲜试验初报

以"意大利"、"红提"、"克瑞森"3个葡萄品种为试材,采用保鲜袋+纸箱、无保鲜袋+泡沫箱、保鲜膜+塑料盒3个处理,研究不同浓度臭氧对葡萄保鲜效果的影响。结果表明:"红提"葡萄入库前用60mg/kg的臭氧浓度处理,以保鲜袋+纸箱包装,放入0℃左右保鲜库中,保鲜时间可达150d,其余品种效果一般。     

美洲斑潜蝇气味结合蛋白OBP13的鉴定与功能

【目的】克隆与鉴定美洲斑潜蝇（Liriomyza sativae）气味结合蛋白（odorant binding protein,OBP）基因,并对其序列特征、表达情况、系统发育及蛋白功能进行研究,为深入研究美洲斑潜蝇嗅觉机制提供依据。【方法】通过PCR技术克隆美洲斑潜蝇OBP13编码区全长,用DNAMAN对其进行序列分析,用BLAST进行同源性比较,并使用MEGA6.0构建进化树,进行系统发育分析。通过实时定量PCR对OBP13在美洲斑潜蝇不同组织中的表达情况进行分析。构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白纯化,获取重组蛋白。设定荧光分光光度计的激发波长为337 nm,以1-NPN为荧光探针,研究OBP13与25种不同气味配基的结合特性。使用间接免疫荧光染色技术及制备的OBP13的特异性多克隆抗体,对其在组织中的分布情况进行定位。将美洲斑潜蝇触角进行包埋、切片、免疫染色,并在激光共聚焦显微镜下进行观察,了解OBP13在触角感器中的亚细胞分布。【结果】获得了一个美洲斑潜蝇气味结合蛋白基因,命名为LsatOBP13（GenBank登录号：KT250751）。LsatOBP13开放阅读框全长462 bp,编码153个氨基酸,预测成熟蛋白分子量为17.80 kD,等电点为5.75,N-末端的前17个氨基酸为信号肽序列。具有4个保守的半胱氨酸位点,为Minus-C OBP。系统发育分析显示,其与地中海实蝇CcapOBP99a-like位于同一小分支上,亲缘关系较近。检测LsatOBP13在不同组织的表达水平,发现LsatOBP13在触角中的表达量远远高于其他组织。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。对25种气味配基的结合能力检测,发现LsatOBP13与反式-2-己烯醛、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、α-紫罗兰酮、苯并噻唑、β-紫罗兰酮具有较强的结合能力,解离常数分别为12.592、10.995、11.165、11.224、10.336、9.218 μmol·L^-1,其中与β-紫罗兰酮亲和能力最强。通过免疫荧光定位,发现其在触角中主要定位在毛形感器和锥形感器上,在触角嗅觉窝及触角芒连接处也有分布。【结论】美洲斑潜蝇OBP13为非典型的气味结合蛋白Minus-C OBP。表达情况、气味结合特性、免疫定位结果表明,OBP13主要存在于美洲斑潜蝇触角中,参与触角对绿叶植物中大量存在的气味物质的识别过程,推测其在美洲斑潜蝇嗅觉识别、寄主植物定位中发挥功能。     

三叶草斑潜蝇幼期密度效应及其与美洲斑潜蝇的种间竞争

【目的】研究三叶草斑潜蝇（Liriomyza trifolii）卵密度和幼虫密度对其生长发育的影响,探索其种内竞争的密度效应;明确三叶草斑潜蝇与美洲斑潜蝇（L. sativae）在不同1龄幼虫密度下,各自幼虫对食物资源的竞争能力,探索两种斑潜蝇之间的种间竞争取代机制。【方法】在实验室饲养条件下,用针刺死三叶草斑潜蝇多余的卵和幼虫,使其形成不同的卵密度梯度和1龄幼虫密度梯度,再继续培养。根据相关文献判定昆虫各种致死因子是否存在密度依存性的方法,令N₁为该因子作用前的虫口数,N₂为该因子作用后的虫口数。以lgN₁为因变量,lgN₂为自变量,求回归系数,再以lgN₁为自变量,lgN₂为因变量,求回归系数。如果这两条直线在b=1的等分线一侧,则认为作用于N₁→N₂之间的因子为密度依存因子,如果这两条直线在b=1的等分线两侧,则不认为是密度有关因子。选取美洲斑潜蝇和三叶草斑潜蝇各1、2和3对成虫,在固定叶片面积上产卵24 h后,形成不同的卵和幼虫密度,统计后代中两种斑潜蝇的生长状况,分析卵密度和1龄幼虫密度对种间竞争取代的影响。【结果】三叶草斑潜蝇卵期不存在密度效应,卵密度对卵的存活、生长发育以及发育速率均没有显著影响,实验室饲养条件下三叶草斑潜蝇卵存活率均在91%以上;幼虫期存在明显的密度制约效应,幼虫密度对幼虫的存活率、平均蛹重、化蛹率、羽化率、成虫寿命和单雌产卵量均有显著的影响。在寄主植物矮生菜豆上,三叶草斑潜蝇1龄幼虫密度超过0.87头/cm²时,幼虫死亡率上升,平均蛹重减少,化蛹率和羽化率降低,成虫寿命缩短且繁殖力下降。1龄幼虫密度对三叶草斑潜蝇幼虫和蛹的发育速率没有影响,对羽化成虫的雌性比也没有影响;卵密度对两种斑潜蝇各自的竞争力没有影响,不同卵密度下两种斑潜蝇总的孵化率均在94.25%以上。两种斑潜蝇的幼虫密度越高种间竞争越激烈,在幼虫密度较低时,两种斑潜蝇子代数量相当,幼虫密度较高时,三叶草斑潜蝇子代数量明显的高于美洲斑潜蝇的子代数量。【结论】三叶草斑潜蝇卵密度对其种群消长没有显著影响,1龄幼虫密度过高时种内竞争激烈,对其试验种群的增长有很大的抑制作用。与美洲斑潜蝇相比,三叶草斑潜蝇幼虫的种间竞争能力更大,主要原因是三叶草斑潜蝇的幼虫比美洲斑潜蝇的幼虫拥有更强的抗拥挤能力、适应环境恶化的能力以及对食物资源的占有能力。     

茶尺蠖普通气味结合蛋白EoblGOBP2与茶树挥发物的结合功能研究

茶尺蠖是茶园中一种重要的鳞翅目害虫,主要以幼虫取食危害茶树叶片,给茶叶生产带来了严重威胁。茶尺蠖在寻找配偶、产卵地以及觅食活动中其嗅觉系统发挥了非常重要的作用。本研究以茶尺蠖Ectropis obliqua Prout嗅觉系统中的一个普通气味结合蛋白——EoblGOBP2为研究对象,在克隆得到的EoblGOBP2基因基础上,通过对EoblGOBP2进行原核表达、分离纯化后,利用1-NPN的荧光竞争结合法研究了体外重组EoblGOBP2与茶树挥发物的结合生理功能。Scatchard方程显示EoblGOBP2与1-NPN的解离常数K_D为2.310 μmol·L^-1。在荧光竞争结合实验中,7种待测配基均能使1-NPN的相对荧光强度降低到50%以下,表明与EoblGOBP2均有较强的结合能力,而其中邻苯二甲酸二丁酯结合能力最强,K_D值达到4.353 μmol·L^-1。本研究7种配基均为茶树叶片挥发物,表明EoblGOBP2在茶尺蠖嗅觉系统对茶树挥发物的信息识别结合功能中发挥了重要作用。     

不同培养基继代培养球孢白僵菌对西花蓟马毒力和产孢量的影响

【目的】通过开展连续继代培养对高毒菌株产孢和毒力的影响研究,获得对西花蓟马(Frankliniella occidentalis)毒力和产孢量均高且稳定的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株,进一步提出有效防止菌株退化、优良菌株保存和改良的方法与措施,为高效菌株的规模化生产提供参考。【方法】室内条件下,采用浸虫法,用浓度为1×107个孢子/mL球孢白僵菌悬浮液处理西花蓟马初羽化成虫,分别测定28株不同来源的菌株对西花蓟马的毒力;并将筛选出的4株高毒力菌株的分生孢子分别涂布于玉米琼脂（CMA）培养基与SDAY培养基上,比较不同菌株以及不同培养基之间产孢量的差异,筛选出高产孢菌株与产孢培养基,以筛选得到的白僵菌菌株为初始菌株F0,把F0代球孢白僵菌分别接种于CMA培养基、添加蝉蜕的CMA培养基和添加西花蓟马虫尸粉的CMA培养基,分别测定经过不同培养基连续5代继代培养得到的球孢白僵菌对西花蓟马成虫的毒力,并测定产孢量。使用模型模拟分析球孢白僵菌菌株经过不同培养基继代培养后培养代数与产孢量的关系,并对不同培养基培养得到的不同培养代数的白僵菌菌株的产孢量与其对西花蓟马的致死中时（LT₅₀）进行回归分析,研究毒力与产孢量的相关关系。【结果】经过室内毒力测定,处理5 d后,菌株DZDC-9、GZGY-5、WLMQ1-8、SZ-26对西花蓟马成虫的校正累积死亡率均高于90%,LT₅₀均在3 d内,毒力显著高于其他菌株;比较高毒力菌株在两种产孢培养基上的产孢量,发现4株球孢白僵菌的产孢量存在显著差异,菌株DZDC-9的产孢量显著高于其他3株,4株菌株在CMA培养基中的产孢量均明显高于SDAY培养基。随着白僵菌菌株在CMA培养基上连续5代的继代培养,菌株对西花蓟马成虫的致病力呈现下降趋势,从第3代开始致病力显著降低,而添加蝉蜕的CMA培养基培养得到的不同培养代数的分生孢子对西花蓟马致病力则没有显著差异,添加西花蓟马虫尸粉的CMA 培养基培养得到的不同代数的分生孢子对西花蓟马致病力有一定的增强趋势;通过模型可以发现单纯以CMA培养基继代培养白僵菌的产孢量随培养代数呈现指数下降,而在培养基中添加蝉蜕或西花蓟马虫尸粉白僵菌产孢量则随培养代数呈现指数上升,蝉蜕或西花蓟马虫尸粉的添加对产孢量有一定的增强作用。白僵菌菌株产孢量与毒力存在一定正相关关系,产孢量相对较高的菌株对西花蓟马成虫的致病力相对较高,致死中时短。【结论】筛选得到一株对西花蓟马高效的白僵菌菌株DZDC-9,产孢培养基中加入蝉蜕和西花蓟马虫尸可以维持菌株生长特性,延缓毒力退化趋势;同一菌株的产孢量可以作为菌株毒力评价的一个指标。     

中华蜜蜂化学感受蛋白基因家族克隆及表达特征分析

【目的】完成中华蜜蜂（Apis cerana cerana）化学感受蛋白（chemosensory proteins,CSPs）基因家族的序列及表达谱鉴定,解析中蜂整个CSPs家族的表达特征与分布规律,为中蜂CSPs的生物学功能研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术扩增,克隆获得中蜂CSPs基因家族全部6条基因序列的开放阅读框（ORF）全长,并利用real-time PCR技术对中蜂所有的CSPs序列在中蜂工蜂不同发育历期及不同器官表达特征进行研究。【结果】新克隆4条基因（Ac-CSP2、Ac-CSP4、Ac-CSP5和Ac-CSP6）的开放阅读框分别为354、387、315和378 bp,分别编码117、128、104和125个氨基酸残基,预测蛋白质分子量分别为13.01、14.61、12.46和14.63 kD,等电点分别为8.86、4.53、9.60和8.71,且均具有4个保守的半胱氨酸残基,均符合昆虫CSPs的一般生化特征。中蜂与意蜂CSPs同源基因家族间具有高达95%—99%的相似性。CSPs在中蜂不同发育时期及器官的表达特征结果显示,Ac-CSP1、2、3、4在卵、幼虫和蛹期几乎不表达,其中Ac-CSP1、2、4在触角中表达量最高,而Ac-CSP3在翅中表达量最高;Ac-CSP5在中蜂各个发育历期的表达量几乎相同;Ac-CSP6蛹期有较高表达,其余时期不表达。【结论】中蜂CSPs基因家族所有6个基因的氨基酸序列与意大利蜜蜂有较高的相似性,但二者各基因的表达谱在整体相似的情况下局部又存在着某些差异,为进一步研究该家族蛋白的生理功能机制奠定了良好基础。