PEI介导外源基因进入植物细胞的瞬时表达

 【目的】医学方面的大量研究证实,聚乙烯亚胺（polyethylenimine,PEI）作为一种新型阳离子多聚物基因载体可以吸附和浓缩DNA,通过与细胞膜亲和粘附和细胞吞噬作用运载外源基因进入细胞并实现表达。本实验研究旨在探索PEI作为非病毒基因载体介导外源基因进入植物细胞并获得瞬时表达的可能性。【方法】制备PEI/DNA复合物,利用凝胶阻滞分析PEI与DNA的结合情况,采用电子显微镜观察PEI/DNA复合物的形态。以绿色荧光蛋白基因为报告基因研究不同N/P比条件下PEI/DNA复合物对拟南芥原生质体细胞的转化效率,并与PEG转化方法进行比较分析。【结果】PEI与DNA的质量比为5﹕1～1﹕4,PEI可以与DNA稳定结合,形成粒径约100～200 nm的球形复合物。PEI/DNA复合物对拟南芥原生质体细胞的转化效率随其N/P比的增大而提高,N/P＝5时PEI的转化效率达到最高且明显高于PEG介导的转化效率,N/P＞5时转化效率反而下降,容易使细胞破碎和变形。【结论】PEI作为一种新型的外源基因运送载体对拟南芥原生质体细胞具有良好的介导基因转移效果。     

Transient Expression of Exogenous Gene into Plant Cell Mediated by PEI Nanovector

This study was carried out to investigate the transfection effect of exogenous gene into plant protoplast cell mediated by polyethylenimine (PEI) nanovector, based on PEI gene delivery system in the field of medical science. PEI/DNA complexes were prepared by using PEI polymer to bind the plant expression plasmid, pCMI205-GFPn. The ability of PEI combining and protecting DNA was investigated by agarose gel electrophoresis retardation assay. The surface characteristics of PEI/DNA complexes were observed with transmission electron microscope. The transfection efficiency of Arabidopsis thaliana protoplasts mediated by PEI/DNA complexes at different N/P ratios was analyzed based on observation of transient expression of green fluorescent protein with confocal laser scanning microscope. PEI could bind and condense DNA, and form stable 100-200 nm PEI/DNA complexes when the proportion of PEI and DNA is in the range of 5:1-1:4.Transfection efficiency of PEI/DNA complexes increased with N/P ratios in range of N/P＜5 and reached the highest at N/P=5, and began to decrease beyond N/P＞5 as higher toxicity to cells. The transfection efficiency of PEI/DNA complexes at N/P=5 was higher than PEG. This study confirmed that PEI nanovector could effectively mediate foreign gene entering into A. thaliana protoplast cell to obtain transient expression, which may be developed as a hopeful and novel transgenic method combined with plant protoplast regeneration.     

诊断超声照射对大鼠早孕胚胎组织细胞Caspase-3表达的影响

目的 了解诊断超声照射对大鼠早孕胚胎组织细胞Caspase-3表达的影响.方法 40只孕7dSD大鼠随机分为4组,用3.5 MHz超声持续照射腹部子宫体表投影区,分别照射0、10、20、30 min,超声照射后24 h取胚胎组织,用SP免疫组织化学检测Caspase-3蛋白表达.结果 超声照射20、30 mir组,Caspase-3表达明显高于对照组（P＜0.01）.结论 经腹诊断超声持续照射大鼠早孕胚胎超过20 min可使Caspase-3蛋白表达增高,从而可能导致早孕胚胎组织细胞凋亡.     

超声照射对人胚肾细胞凋亡的影响

目的了解诊断超声照射对体外培养的人胚肾（HEK-293）细胞凋亡的影响。方法 HEK-293细胞用腹部超声探头（3.5 MHz、MI 0.8）照射0、10、20、30 min,再作Hoechst 33258染色,观察细胞凋亡的变化。结果超声照射10 min后,细胞凋亡率与假照组比较差异无统计学意义（P〉0.05）;超声照射20 min后,细胞凋亡率明显高于假照组（P〈0.05）,其中以照射30 min较为显著（P〈0.01）。结论特定剂量的超声照射可诱导人胚肾细胞凋亡增加。     

牛肌肉抑制素前肽对牛肌卫星细胞增殖的影响

通过PCR扩增目的基因,构建真核表达载体,利用PEI转染牛肌卫星细胞,转染后48与72 h通过CCK-8与流式细胞术检测细胞增殖的变化,通过RT-PCR检测目的基因的表达,通过RT-PCR与Western blot检测下游基因P21,CDK2的表达变化.结果表明,在两个时间点,实验组细胞活力明显升高(P<0.01),G0/G1期细胞所占的比例明显下降(P<0.01),S期细胞所占比例明显上升(P<0.01),MSTN前肽基因有大量表达,P21表达下降,CDK2表达上升.结果揭示,在牛肌卫星细胞中,MSTN前肽通过下调P21,上调CDK2的表达量促进细胞增殖.旨在揭示牛MSTN前肽基因对牛肌卫星细胞(MDSC)增殖的影响,为后续的转基因牛试验提供理论依据.     

聚乙烯亚胺改性尿素-乙二醛聚合物树脂性能研究

为了改善尿素-乙二醛（UG）的耐水及胶接性能，将聚乙烯亚胺（PEI）作为交联剂对UG进行改性，考察不同加入比例对树脂体系性能的影响，并借助仪器分析对树脂体系的固化特征、结构组成和形貌特征进行表征。结果表明，当PEI加入量为3%时，树脂所表现出的胶接强度及耐水性能最佳，而且PEI加入后通过有效官能团的交联反应，树脂体系的固化更加充分，形成的交联体系更加均匀和致密，树脂整体性能得到提升。     

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因植物表达载体的构建及瞬时表达

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体具有特异性诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性的特点,被认为是肿瘤凋亡疗法较有希望的候选药物。植物生物反应器在药用蛋白质生产方面具备较大优势。构建了可溶性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的植物表达载体,进行本氏烟(Nicotiana benthamiana)瞬时表达,并对目的蛋白的体外活性进行检测。结果显示,本氏烟叶片中目的蛋白平均表达量为68.60 pg/mg TSP;在浓度为200 pg/m L时,对NCI-H460细胞株的抑制率为28.75%。研究表明,经密码子优化的编码基因能够在受体植物中表达出有活性的目的蛋白,为开展目的基因的稳定转化工作奠定了基础。     

一种用于芽孢杆菌代谢物细胞毒性的快速检测方法

为建立一种快速检测芽孢杆菌细胞毒性的方法,通过比较不同的细胞以及活性测定方法,确立以非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)为受试细胞,MTT比色法作为芽孢杆菌代谢物细胞毒性的检测方法,并对检测条件进行了优化.利用优化后的方法对81株不同来源芽孢杆菌的细胞毒性进行检测,发现有16株芽孢杆菌具有细胞毒性.通过毒素编码基因PCR、溶...     

线性聚乙烯亚胺(LPEI)介导DNA转染的优化研究

线性聚乙烯亚胺(LPEI)是一类广泛用于核酸转染或药物传递的阳离子聚合物.为了进一步探究25 kDa LPEI的转染条件,通过凝胶电泳阻滞试验评估N/P,聚合pH及聚合时间对LPEI-DNA复合物形成的影响,继而利用大范围N/P的25 kDa LPEI对HEK293 T细胞进行绿色荧光蛋白表达质粒转染,转染48 h后通过绿色荧光细胞比例及MTT的统计分析,评估转染效率与LPEI造成的细胞毒性.结果表明, N/P的上升能增强LPEI-DNA的电泳阻滞;随着共孵育pH值从6～8升高, LPEI-DNA聚合逐渐减弱;随着共孵育时间延长, LPEI-DNA聚合逐渐增强,孵育1 h时达到饱和.随着体外转染HEK293 T细胞的N/P升高,转染阳性细胞比例逐渐升高,当N/P达到40～60时转染效率达到最高,进一步提高N/P后转染效率极显著下降(p0.01);随着N/P升高,细胞活力逐渐下降.结果表明, N/P, pH,聚合时间均可影响LPEI聚合核酸能力;综合考虑N/P对HEK293 T细胞转染效率及细胞毒性的影响,确定25 kDa LPEI转染细胞适宜的条件为N/P为40～60,聚合pH值为6.0,聚合时间为1 h.     

棉花GhCCR4基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

研究以GUS基因为报告基因,构建CCR4基因的瞬时表达载体,首先酶切带有CCR4基因的 pGEM-T-CCR4载体,获得CCR4基因目的片段,然后将其克隆到瞬时表达载体pGUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CCR4融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CCR4转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色,表明构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达.为进一步在棉花中研究GhCCR4基因的功能奠定了实验基础.     

双波长分光光度法测定藏红花中总黄酮的含量

用双波长分光光度法,测定藏红花中的总黄酮含量,测定波长510nm,参比波长588nm,平均回收率98.63%。结果表明,藏红花中总黄酮平均含量为7.27%,该方法稳定可靠,重现性好。     

棉花GhCAD6基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

[目的]以GUS基因为报告基因,构建GhCAD6基因的瞬时表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM-T-CAD6质粒为模板,获得GhCAD6基因目的片段.然后将其克隆到瞬时表达载体pRTL2-GUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CAD6融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CAD6转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色.[结论]构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达,为进一步研究棉花GhCAD6基因的功能奠定了实验基础.     

MS-222、丁香酚对刀鲚幼鱼的麻醉效果

研究了MS-222、丁香酚2种麻醉剂对人工繁养刀鲚(Coilia nasus Schlegel)幼鱼的麻醉效果,探索了2种麻醉剂在安全浓度下麻醉后刀鲚幼鱼暴露在空气中的时间,并运用该2种麻醉剂的适宜剂量对刀鲚幼鱼进行了运输实验。麻醉实验表明:(1)理想MS-222浓度为150 mg/L,理想丁香酚麻醉剂浓度为30 mg/L;(2)经MS-222浓度为150 mg/L深度麻醉后,适宜的暴露在空气中的时间应4 min;经丁香酚浓度为30 mg/L深度麻醉后,适宜的在空气中的时间应5 min;(3)养殖长江刀鲚幼鱼采用30 mg/L MS-222和8 mg/L丁香酚分别麻醉后,其复苏率和48 h内的成活率均达到100%,与各自对照组存在明显差异(P0.05)。     

新疆野苹果SSR-PCR 反应体系的优化

以4个新疆野苹果株系为试材,利用CTAB法提取DNA,对影响SSR-PCR扩增结果的主要因子设计了多梯度的优化试验。结果表明:新疆野苹果SSR-PCR反应体系(25μL)中含Taq DNA聚合酶0.5 U、模板DNA 5.0 ng、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.2μmol/L、Mg2+1.0 mmol/L、退火温度为60℃时效果最佳。最佳扩增程序为:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,65℃退火1 min,72℃延伸1 min,4个循环;94℃变性30 s,60℃退火1 min,72℃延伸1 min,30个循环;72℃延伸5 min,4℃保存。利用此反应体系对30份新疆野苹果进行SSR-PCR扩增和电泳检测,扩增谱带清晰且多态性较好,表明该体系适用于新疆野苹果的基因连锁图谱构建和QTL定位。     

猪TOLL样受体2基因在CHO-K1细胞中的表达

将含猪TLR2(猪Toll样受体2,pTLR2)基因的真核表达载体PcDNA3.1/CT-GFP-pTLR2,采用脂质体法转染到CHO-K1细胞,用G418持续筛选获得了阳性细胞克隆.阳性细胞克隆系经PCR和RT-PCR检测表明:pTLR2基因得到稳定整合并能成功地转录.荧光显微镜观察,转染细胞可见绿色荧光,表明获得了表达pTLR2的克隆细胞系.     

产肠毒素大肠杆菌K88-STII-LTA2/LTB融合基因在烟草中的表达

融合保护性抗原的LT类全毒素具有传输抗原载体和免疫佐剂两重功效。利用基因工程技术，构建了带有信号肽的Pr1as-K88ac-STII-LTA 2/UP-LTB融合基因的双价植物表达载体。双价植物表达载体通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101，并利用农杆菌介导技术叶盘法转化模式植物烟草。转基因烟草经PCR和RT-PCR初步检测，证明外源基因已经整合到受体植物基因组中，同时表明融合基因在转录水平上有表达。转基因烟草的获得，为进一步研制新型的抗腹泻植物口服疫苗奠定了良好的基础。     

氯前列醇钠与卡贝缩宫素对荣昌猪和涪陵黑猪母猪分娩时间的影响

氯前列醇钠作为人工合成的前列腺素类似物被广泛的应用于诱导各种母畜的分娩。卡贝缩宫素作为一种具有长效特性的新型催产素类样分子,有望在母猪分娩过程中替代缩宫素起到收缩子宫启动分娩的作用。试验一主要对氯前列醇钠注射部位和剂量进行研究,将母猪随机分为自然分娩组(n=74)、2 mL肌肉注射组(n=52)、2 mL后海穴注射组(n=63)和1 mL后海穴注射组(n=57)。研究结果表明,2 mL后海穴注射组的母猪分娩时间上表现更为集中,产仔持续时间最短(228 min),白天分娩比例最高(90.48%)。说明通过调整母猪注射氯前列醇钠时间、剂量以及部位等因素能够一定程度的缩短母猪产仔时间,提高母猪白天分娩率。试验二主要对卡贝缩宫素(CBT)与氯前列醇钠的联合应用进行研究,试验将母猪随机分为自然分娩组(n=81)、氯前列醇钠注射组(n=70),CBT注射组(n=67),氯前列醇钠+CBT注射组(n=64)。研究结果表明,氯前列醇钠与卡贝缩宫素联合应用能够缩短母猪产仔持续时间(205 min),并且大幅提高母猪在白天工作时间分娩比例(95.31%)。     

中性蛋白酶与超声波结合分离稻米淀粉及其黏滞性研究

用中性蛋白酶与超声波结合提取稻米淀粉,并用快速黏度分析仪测定稻米淀粉的黏滞性。结果显示,用中性蛋白酶提取稻米淀粉时,稻米淀粉的提取率为62.3%～73.8%,淀粉中蛋白质含量为3.74%～4.88%;蛋白酶与超声波结合时稻米淀粉的提取率为72.1%～77.2%,蛋白质含量为0.68%～1.30%,破损淀粉含量显著降低,两者结合的最佳条件是酶先作用3h,再50%超声波作用40min。中性蛋白酶与超声波结合处理所得淀粉的黏滞谱中,峰值黏度、消减值和最终黏度都比单独酶解所得淀粉的高,而崩解值降低;与碱处理淀粉比,也是峰值黏度、消减值和最终黏度升高,崩解值降低,这说明超声波作用没有破坏淀粉性质。中性蛋白酶与超声波结合是提取稻米淀粉的有效方法。     

紫叶李叶片花色苷超声辅助有机溶剂提取工艺

在单因素试验的基础上,运用Box-Behnken中心组合试验和响应面法考察了液料比、超声提取时间、温度3个因素对花色苷提取率的影响,并优化了提取工艺。结果表明,紫叶李叶片花色苷最佳工艺条件为：提取剂0.1%盐酸甲醇,超声（功率300W）提取时间5min,温度78℃,液料比51∶1（V/m）。在此条件下,花色苷的提取率预测值为2 291.96±72.37mg/kg,验证值为2 467.42±69.58mg/kg,与预测值的相对误差为7.42%,说明利用响应面法优化超声辅助有机溶剂提取紫叶李叶片花色苷工艺可行。     

中药有效成分诱导肺微血管内皮细胞表达IFN-γ的研究

以体外培养的RPMVECs(rat pul monary microvascular endothelial cells,RPMVECs)为模型,采用双夹心ELISA法和MTT法,研究了绿原酸、连翘酯苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素诱导RPMVECs表达IFN-γ(inferteron-γ)的影响以及对PMVECs的毒性。ELISA检测结果表明,加入质量浓度为5,10,20,50,100μg/mL的5种中药成分刺激细胞16 h后,在培养细胞上清液内均能检测到IFN-γ,其中绿原酸、黄芩素组IFN-γ的表达量随药物浓度增大而减少;连翘酯苷组IFN-γ的表达量均较多;黄芩苷、汉黄芩素组均在10μg/mL时IFN-γ的表达量达到峰值,随后IFN-γ的表达量随浓度增大而减少。MTT检测结果显示,各浓度的黄芩苷、黄芩素对PMVECs均有一定程度的抑制作用,而连翘酯苷对PMVECs均有增殖作用,绿原酸、汉黄芩素的细胞毒性则随药物浓度而发生变化。