PEI介导外源基因进入植物细胞的瞬时表达

 【目的】医学方面的大量研究证实,聚乙烯亚胺（polyethylenimine,PEI）作为一种新型阳离子多聚物基因载体可以吸附和浓缩DNA,通过与细胞膜亲和粘附和细胞吞噬作用运载外源基因进入细胞并实现表达。本实验研究旨在探索PEI作为非病毒基因载体介导外源基因进入植物细胞并获得瞬时表达的可能性。【方法】制备PEI/DNA复合物,利用凝胶阻滞分析PEI与DNA的结合情况,采用电子显微镜观察PEI/DNA复合物的形态。以绿色荧光蛋白基因为报告基因研究不同N/P比条件下PEI/DNA复合物对拟南芥原生质体细胞的转化效率,并与PEG转化方法进行比较分析。【结果】PEI与DNA的质量比为5﹕1～1﹕4,PEI可以与DNA稳定结合,形成粒径约100～200 nm的球形复合物。PEI/DNA复合物对拟南芥原生质体细胞的转化效率随其N/P比的增大而提高,N/P＝5时PEI的转化效率达到最高且明显高于PEG介导的转化效率,N/P＞5时转化效率反而下降,容易使细胞破碎和变形。【结论】PEI作为一种新型的外源基因运送载体对拟南芥原生质体细胞具有良好的介导基因转移效果。     

Enhancement of the transfection efficiency of DNA into Crocus sativus L. cells via PEI nanoparticles

Over the past decade, several natural and synthetic cationic polymers have been utilized for gene delivery into cells. Among them, polyethylenimine (PEI) was used for gene therapy successfully. The present study investigated the effect of PEI and ultrasound waves on ssDNA delivery into saffron cells. Gel retardation, dynamic light scattering (DLS) and scanning electron microscopy (SEM) assays were employed to determine the physicochemical properties of PEI/f-DNA polyplex (complex of PEI and fluorescently labeled DNA). Moreover, the cytotoxicity of PEI, PEI/f-DNA polyplex and ultrasound were investigated on saffron cells at different concentrations. The gel retardation results indicated that the formation and neutralization of the PEI/f-DNA polyplex were completed at N/P=5. The particle size distribution of the polyplexes was from 50 to 122 nm. The experimental results revealed that the cytotoxicity of the PEI/f-DNA polyplex was lower than that of PEI alone, hence the cells showed both dose- and exposure duration-dependent responses. Furthermore, the viability of saffron cells declined extremely after 5 and 10 min sonication but this reduction was not significant at 2 min exposure duration. The results also indicated that the combined utilization of ultrasound and PEI nanoparticles increased the transfection efficiency of saffron cells up to two times higher than those obtained by PEI or ultrasound separately.     

玉米生长条件对玉米原生质体转化的影响研究

植物原生质体瞬时转化体系是一种高效、快捷的基因表达分析工具。为研究玉米生长条件对玉米原生质体活力和转化效率的影响,以玉米自交系Q319幼苗为研究对象,利用正交试验L9(34)探讨了玉米的生长条件（光照强度、光照周期、生长温度和龄期）对玉米叶肉细胞原生质体转化的影响。实验结果显示上述四个因素都能够影响玉米叶肉细胞原生质体活力与转化效率,而光照强度的影响最大;进一步研究发现光照强度与玉米叶肉细胞原生质体的活力及转化效率呈负相关关系,玉米黄化苗原生质体转化效果最好,其原生质体活力及转化效率分别达到了100%和85%。另外,龄期为13 d的玉米黄化苗原生质体转化效率最高,龄期过小或过大,黄化苗的原生质体转化效率都会下降。     

棉花真叶原生质体分离及瞬时表达体系的优化

【目的】真叶细胞能模拟植物内源条件,建立基于棉花真叶原生质体的高效瞬时表达体系,为快速有效研究棉花基因功能提供方法。【方法】以陆地棉TM-1真叶为材料,采用常用的纤维素酶和离析酶组合分离原生质体,探究影响原生质体分离的叶龄、渗透压、酶解液成分和酶解时间,及渗透压和酶解时间对原生质体活力的影响,并分析渗透压、PEG浓度和培养液种类对原生质体瞬时转化的影响,进而优化棉花真叶原生质体瞬时表达体系。构建GhLTP-GFP表达载体,对比融合蛋白在拟南芥、棉花原生质体和烟草表皮细胞中的亚细胞定位,验证该体系。【结果】不同于棉花子叶,酶解液中高浓度CaCl₂会显著抑制真叶细胞壁的酶解,含10 mmol·L^-1 CaCl₂的酶解液能有效分离棉花真叶原生质体。甘露醇显著影响原生质体得率,含0.5 mol·L^-1甘露醇的酶解液分离原生质体得率最高,且细胞形态维持较好,而0.4 mol·L^-1甘露醇条件下原生质体活力降低一倍,表明0.5 mol·L^-1甘露醇能较好维持棉花真叶原生质体渗透压。陆地棉刚展平的真叶分离所得原生质体大小合适,而展平后的嫩叶分离得到的原生质体细胞较大,得率降低一倍。酶解处理7 h前,原生质体游离缓慢,酶解9 h原生质体产量达到高峰,继续酶解原生质体将破裂,得率降低。在等渗条件下用40% PEG4000转化所得原生质体,转化效率最高,而普遍采用的低渗条件不利于棉花真叶原生质体的转化。转化后,用WI溶液继续培养原生质体,会引起原生质体的大量破裂,用含0.5 mol·L^-1甘露醇的W5溶液继续培养,有利于原生质体形态的维持,转化率提高到90%。表达载体35S:GhLTP-GFP分别转入棉花、拟南芥原生质体和烟草表皮细胞,GFP信号在细胞中的定位结果一致。 【结论】建立的棉花真叶原生质体瞬时表达体系,可获得8.10×10⁶个/mL活力在95%以上的高质量原生质体,原生质体得率提高8倍,转化效率达到90%,可用于亚细胞定位、蛋白互作,以及代谢调控网络研究等。     

脂质体介导质粒DNA法转染藏鸡成纤维细胞的研究

采用Lipofectin阳离子脂质体介导质粒DNA转染藏鸡成纤维细胞,通过优化重组质粒转染细胞的各种参数以寻求最佳的转染条件。结果表明:6孔培养板中细胞汇合度达70%~80%时,用2μL脂质体介导1.5μg重组质粒转染10 h即可获得较满意的转染效率。说明Lipofectin能有效介导质粒pEGFP-N3转染藏鸡成纤维细胞,转染率与细胞生长汇合程度、脂质体包被质粒的浓度比例及转染时间直接相关。     

玉米淀粉合成酶SSⅡa启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆玉米Zea mays淀粉合成酶SSⅡa启动子,并分析其功能,为进一步研究和应用SSⅡa启动子奠定基础。【方法】通过NCBI上公布的玉米基因组序列,在网站Maize GDB上BLAST查找到SSⅡa 5'侧翼序列,利用PCR方法从玉米B73中克隆SSⅡa启动子;通过Plant Care在线分析启动子顺式作用元件,用特异性引物分别克隆出长度为1 407、867、633、483和365 bp的片段,与植物表达载体p CAMBIA3301连接,构建5种5'缺失体的植物表达载体,命名为P1、P2、P3、P4和P5。用农杆菌介导法转化拟南芥Arabidopsis thaliana,获得转基因拟南芥。【结果】以玉米B73基因组DNA为模板,用特异性引物SSⅡa F/SSⅡaR进行扩增,得到2 526 bp序列;除草剂筛选的阳性拟南芥植株PCR验证均检测出gus基因;GUS组织化学分析表明,5种类型启动子构建的表达载体在成熟期叶片、果荚中均显蓝色;gus基因定量分析表明,成熟期5种转基因拟南芥叶片中,gus基因表达量P1最高,其他基本一致;种子中gus基因表达量P1和P2相近,且高于P3、P4和P5。【结论】成功克隆玉米SSⅡa启动子;构建的5种SSⅡa启动子缺失体表达载体在转基因拟南芥中均具有活性,长度为1 407 bp(P1)和867 bp(P2)的启动子具有胚乳特异性。     

拟南芥PGK基因家族功能的初步分析

磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase)是一类进化上非常保守的蛋白家族,因而利用模式植物拟南芥研究PGK家族基因功能具有普遍意义。拟南芥基因组中含有三个PGK基因家族成员(PGK1,PGK2和PGK3),但是对于它们的基因表达模式和蛋白定位的研究还不是很清楚。本文利用实时荧光定量PCR技术检测了PGK基因家族的表达模式,结果表明三个PGK基因在拟南芥的各个组织器官和发育阶段中都有表达。利用拟南芥原生质体瞬时转化系统对三个PGK蛋白进行亚细胞定位,结果显示PGK1和PGK3定位于细胞基质,而PGK2定位于叶绿体。另外,我们分离得到了PGK2基因的T-DNA插入敲除突变体pgk2。pgk2在正常条件下表现出叶片黄化,PR1基因上调表达和H_2O_2过量积累等类似于超敏反应的细胞死亡表型。进一步的遗传分析表明pgk2的细胞死亡表型和T-DNA插入位点紧密连锁,暗示着pgk2的细胞死亡表型是由于PGK2的基因缺失造成的,因此PGK2可能在调控植物细胞程序化死亡过程中有重要作用。以上研究结果对于进一步探讨PGK基因家族的功能具有重要的参考价值。     

人Ⅰ型胶原基因脂质体转染牛耳细胞克隆筛选方法

构建连接有人Ⅰ型胶原基因的质粒(PGCl-collagen).利用脂质体介导的方法转染荷斯坦奶牛耳成纤维细胞,优化一系列转染条件以提高转染效率,再利用G418和GFP荧光的表达来筛选稳定转染的细胞,最后以末转染的成纤维细胞作为阴性对照组,PGCl-collagen作为阳性对照组对转染的细胞进行PCR验证.结果显示:在6孔培养板中细胞融合度达到50%～60%左右介导1～3μg重组质粒转染24 h,转染效率可达25%～30%,筛选单克隆细胞在荧光显微镜观察检测到绿色荧光蛋白的表达.在使用800U的G418筛选效果最好,维持浓度300～600U,获得25个稳定表达的阳性细胞系.从中选取6个克隆进行PCR验证.成功利用脂质体转染方法将人I型胶原基因成功转染到荷斯坦奶牛耳成纤维细胞,PCR验证结果正确.     

拟南芥免疫相关基因启动子对免疫信号分子的响应强度分析

为对比不同的植物抗病相关基因对植物免疫激发子的响应强度,筛选出响应强度较高的报告基因,从拟南芥中克隆5个植物免疫相关基因(WRKY33、FRK1、WRKY29、PR2和PDF1.2)的启动子序列,构建目的基因启动子驱动的萤光素酶(Luciferase,LUC)表达载体,并将其转化到拟南芥原生质体中瞬时表达;经植物免疫激发子(FLG22与PEP1)处理后,进行LUC活性检测,判断目的基因启动子的激活情况,分析上述目的基因启动子对免疫信号分子的响应强度。结果显示:经FLG22与PEP1处理后,拟南芥原生质体细胞中WRKY33响应强度为最高,与对照相比分别上调11.2与4.5倍,WRKY29响应强度次之,分别为对照的10.0与3.1倍;与WRKY相比,FRK1响应强度明显降低,而PR2与PDF1.2均无明显响应。上述结果表明在拟南芥原生质体瞬时表达体系中WRKY33可高效响应植物免疫激发子,pWRKY33::LUC原生质体表达体系可作为一种高效的PTI反应报告系统,用于新型植物免疫激发子的筛选鉴定。     

线性聚乙烯亚胺(LPEI)介导DNA转染的优化研究

线性聚乙烯亚胺(LPEI)是一类广泛用于核酸转染或药物传递的阳离子聚合物.为了进一步探究25 kDa LPEI的转染条件,通过凝胶电泳阻滞试验评估N/P,聚合pH及聚合时间对LPEI-DNA复合物形成的影响,继而利用大范围N/P的25 kDa LPEI对HEK293 T细胞进行绿色荧光蛋白表达质粒转染,转染48 h后通过绿色荧光细胞比例及MTT的统计分析,评估转染效率与LPEI造成的细胞毒性.结果表明, N/P的上升能增强LPEI-DNA的电泳阻滞;随着共孵育pH值从6～8升高, LPEI-DNA聚合逐渐减弱;随着共孵育时间延长, LPEI-DNA聚合逐渐增强,孵育1 h时达到饱和.随着体外转染HEK293 T细胞的N/P升高,转染阳性细胞比例逐渐升高,当N/P达到40～60时转染效率达到最高,进一步提高N/P后转染效率极显著下降(p0.01);随着N/P升高,细胞活力逐渐下降.结果表明, N/P, pH,聚合时间均可影响LPEI聚合核酸能力;综合考虑N/P对HEK293 T细胞转染效率及细胞毒性的影响,确定25 kDa LPEI转染细胞适宜的条件为N/P为40～60,聚合pH值为6.0,聚合时间为1 h.     

白桦BpSPL8启动子的克隆及异源过表达BpSPL8对拟南芥耐旱性的影响

目的目前对植物SPL8的基因功能研究主要集中在开花和育性方面,而其在干旱胁迫响应中的作用却鲜有报道。本文克隆、分析了白桦BpSPL8启动子,并研究了BpSPL8基因在拟南芥中响应干旱胁迫的功能。方法通过PCR克隆技术得到了白桦BpSPL8启动子;利用PLACE和PlantCARE软件对BpSPL8启动子顺式作用元件进行了预测。构建了BpSPL8启动子驱动GUS（β-葡萄糖苷酸酶编码基因）的植物表达载体,并采用浸花法将其转化至拟南芥中;继而利用GUS染色分析了BpSPL8启动子的组织表达模式;同时对BpSPL8在PEG处理下的表达水平进行了qRT-PCR分析。最后,以过表达BpSPL8拟南芥为材料来探究BpSPL8在干旱胁迫下的生物学功能。结果启动子元件分析显示,BpSPL8启动子中含有组织特异表达、光响应、激素响应及多个胁迫响应元件。GUS染色结果表明,BpSPL8启动子可在拟南芥的下胚轴、叶片、叶柄、根和花序中启动GUS基因表达。BpSPL8基因在PEG处理下的野生型白桦的根和叶片中均呈现先上调后下调的表达趋势。干旱胁迫下,过表达BpSPL8拟南芥的存活率和脯氨酸含量均显著低于野生型,丙二醛含量显著高于野生型;两个已知的抗逆基因DR29B和P5CS1在干旱处理后的野生型和转基因拟南芥中均上调表达;但在转基因拟南芥中呈现出延迟上调的表达模式。结论异源过表达白桦BpSPL8能够降低拟南芥的耐旱性,并在干旱胁迫下影响抗性基因DR29B和P5CS1的表达模式。      

2022 年 11 期目录

  目的  次生细胞壁的发育对于木材的形成至关重要,揭示林木次生壁形成的分子调控机制将为改良其木材品质提供理论依据。  方法  （1）本研究从速生型杨树NE19中克隆得到PdKNAT7基因,并构建表达载体,采用花序侵染法转化拟南芥,筛选得到过表达植株。（2）利用农杆菌介导的瞬时转化法侵染烟草,对PdKNAT7进行亚细胞定位。（3）通过徒手切片观察不同基因型拟南芥花薹基部的次生细胞壁厚度。（4）通过真空渗透的方法瞬时转化84K杨。（5）qRT-PCR分析不同品系杨树中PdKNAT7基因的表达情况,并揭示拟南芥和杨树中参与次生壁形成的相关基因的表达模式。  结果  （1）PdKNAT7定位于细胞核。（2）PdKNAT7主要在NE19杨茎中表达,且表达量高于107杨。（3）与野生型相比,过表达PdKNAT7的拟南芥花薹基部的束间纤维壁变薄,木质部纤维壁变厚,而突变体正好相反;另外,突变体的导管壁更厚。（4）过表达PdKNAT7的拟南芥植株中,4CL1、C4H1、CCR1、CesA8、IRX9和IRX10基因的表达量均下调,突变体中与之相反。（5）瞬时转化PdKNAT7基因的84K杨中,4CL3、C4H1、CCR1、CesA8、IRX9和IRX10基因的表达量也下调。  结论  PdKNAT7通过调控木质素和纤维素的积累来影响拟南芥次生细胞壁的厚度。      

棉花GhCCR4基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

研究以GUS基因为报告基因,构建CCR4基因的瞬时表达载体,首先酶切带有CCR4基因的 pGEM-T-CCR4载体,获得CCR4基因目的片段,然后将其克隆到瞬时表达载体pGUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CCR4融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CCR4转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色,表明构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达.为进一步在棉花中研究GhCCR4基因的功能奠定了实验基础.     

胡杨miR1444b在拟南芥中正调控植物抗旱性

目的miR1444b是木本植物特异miR1444家族中的一员,能够参与植物对金属胁迫的响应,但在干旱胁迫响应中的功能尚不明确。方法本实验克隆得到了胡杨MIR1444b基因(peu-MIR1444b)及其启动子(pro-peu-MIR1444b),将peu-MIR1444b基因在模式植株拟南芥中过表达,对转基因植株进行正常浇水、甘露醇模拟干旱和自然干旱条件处理,研究peu-MIR1444b的功能。结果克隆得到的pro-peu-MIR1444b和peu-MIR1444b与Phytozome数据库收录的毛果杨基因组序列相似性分别为99.61%和98.82%。利用PlantCARE数据库分析发现,pro-peu-MIR1444b序列中包含逆境相关的TC-rich repeats元件和受干旱诱导的MYB结合位点MBS。实时荧光定量PCR分析显示miR1444b在转基因拟南芥中表达量显著高于野生型,预测的靶基因葡聚糖合成酶Ⅳ(AT3G14570.2)表达量明显下调,初步确定葡聚糖合成酶Ⅳ在拟南芥中被peu-miR1444b负调控。在250 mmol/L甘露醇模拟的干旱胁迫条件下,转基因拟南芥株系TG-2和TG-5萌发率分别显著高于野生型20.83%和26.67%,根长分别显著高于野生型56.83%和52.60%(P < 0.05)。土壤自然干旱8 d测得转基因拟南芥的光合速率、气孔导度、叶片水分利用效率、PSⅡ最大光化学效率和过氧化物酶(POD)活性均显著高于野生型(P < 0.05)。结论胡杨miR1444b可以促进根系生长增加植物的吸水能力,负调控葡聚糖合成酶Ⅳ提高植物的渗透调节能力,维持植物在水分亏缺条件下的光合效率,保证植株正常生长,在拟南芥中正调控植物抗旱性。      

DREB 2A基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

研究提取盐处理的拟南芥植株叶片总RNA,用DREB2A基因特异引物通过RT-PCR扩增出1050bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的DREB2A基因序列同源性达100%。进一步将DREB2A基因分别克隆至植物表达载体卡盒pCCE12和pCC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的DREB2A基因植物表达载体pCDRE12和pCDR29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导的DREB2A基因对植物的遗传转化奠定基础。     

拟南芥P5CS1基因转化羽衣甘蓝增强耐盐性分析

【目的】分析转拟南芥△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS1)基因羽衣甘蓝的耐盐性,为获得较强的耐盐性羽衣甘蓝品种及其抗逆育种提供理论依据。【方法】将拟南芥P5CS1基因(AtP5CS1)经农杆菌介导转入羽衣甘蓝植物中,在盐胁迫下,分别检测转基因植株与野生型植株的AtP5CS1 mRNA表达量、幼苗脯氨酸含量、株系根系性状、整株干质量和鲜质量、叶片相对水含量、叶片电导率和整株存活率。【结果】在150 mmol/L NaCl胁迫下,转基因植株的P5CS1基因mRNA可正常表达,与对照相比,转基因株系Y1、Y2的主根和最长侧根长度较长,侧根数目较多,整株干质量和鲜质量较重;而且相对水含量显著高于对照植株(P0.05,下同),脯氨酸含量及存活率均极显著高于对照植株(P0.01),叶片相对电导率显著低于对照植株。【结论】转AtP5CS1基因植株的耐盐表型优于对照,即AtP5CS1基因在羽衣甘蓝中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性。     

毛果杨PtAREB1基因启动子的克隆及功能

为了研究杨树ABF2同源基因的表达规律,从毛果杨基因组DNA中克隆出Pt AREB1基因上游一段1 800 bp序列。序列分析结果表明,该序列含有逆境胁迫响应元件TC-rich repeats、ABA应答元件ABRE和茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,Me JA)应答元件TGACG-motif等胁迫相关元件。在序列分析的基础上,构建了Pt AREB1基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体,利用农杆菌介导的花粉管通道法获得转基因拟南芥。结果表明Pt AREB1启动子可以在干旱、ABA、盐、Me JA和SA胁迫下,驱动GUS基因在转基因拟南芥的根、茎和叶中表达。说明Pt AREB1基因可能与干旱、高盐等胁迫应答紧密相关。     

表达带His-tag的禽流感病毒HA基因杆状病毒转移载体的构建及重组病毒的鉴定

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A／Goose／GuangDong／1／96（H5N1）1．7kb HA基因的eDNA将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后，亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis4．5，筛选到重组质粒命名为rpBacHisH5HA。测序正确后，在脂质体介导下，与线性化的杆状病毒ENA（Bac-N-Blue TMDNA）共转染Sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经3轮蚀斑纯化，获得数株重组杆状病毒rBacHisH5HA。提取重组病毒DNA经PCR证明目的基因片段已插入杆状病毒基因组。     

禽流感病毒 HA 基因在拟南芥中的表达

将H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因构建到植物表达载体,经农杆菌法转入拟南芥基因组中,酶联免疫吸附(ELISA)测定分析T2代转基因株系,据OD值筛选获得HA基因高效表达株系;RT-PCR及Western blot分析进一步证实,这些转基因株系均可转录HA基因,翻译形成相应的蛋白质.拟南芥叶片中表达积累的HA蛋白经亲和层析纯化,Western blot分析检测到1条分子量为65 ku的蛋白质带,与预期的HA蛋白大小完全一致,没有发生蛋白质降解现象.表明禽流感病毒HA蛋白可在植物细胞中稳定表达,植物可用于生产禽流感疫苗.     

石斑鱼生长激素基因的合成及其在拟南芥中的表达

为了使石斑鱼生长激素基因适合在植物中表达,重新合成了石斑鱼生长激素基因,对其密码子进行了优化,把合成的基因构建于植物表达载体pBI121上并转化模式植物拟南芥,获得了30个转基因抗性植株。对24株PCR阳性苗进行Northernblotting分析,结果表明,鱼类生长激素基因可以在转基因植物中表达,其表达在不同的转基因植株中存在明显差异,表达最强的植株与最弱的植株相比,二者表达量差异达到43倍。