哺乳动物成体干细胞的研究进展

干细胞具有自我更新能力,能够产生高度分化的功能细胞。干细胞按照发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。胚胎干细胞的发育等级较高,是全能干细胞,而成体干细胞的发育等级较低,是多能或单能干细胞。一般认为成年组织或器官内的干细胞具有组织特异性,只能分化成特定的细胞或组织,然而,研究结果表明,组织特异性干细胞同样具有分化成其他细胞或组织的潜能,这为干细胞的应用开创了更广泛的空间。作者主要综述了干细胞的研究进展及几种成体干细胞的诱导分化。     

牛输卵管上皮细胞的纯化培养与生长特性研究

研究依据牛输卵管上皮细胞与成纤维细胞对EDTA/胰酶消化敏感性不同,分离纯化牛输卵管上皮细胞,并以其进行生长曲线和细胞凋亡趋势的研究。结果表明:荷斯坦奶牛输卵管上皮细胞在DMEM/F12培养基中生长旺盛,第3代细胞在2.5×104个细胞/孔的起始浓度下,生长周期明显,7 d左右可以达到100%汇合。第11代细胞达到100%汇合的时间较第3代细胞延长3 d左右,细胞出现滞长现象。用膜联蛋白V-FITC/PI双标记流式细胞术检测输卵管上皮细胞凋亡,发现输卵管上皮细胞在生长期细胞凋亡速度慢,在接触生长期中短期内饥饿培养对凋亡影响不大。9代以前细胞凋亡率每代增加约1%左右,但9代后凋亡率明显加快,在9代时为15.5%,11代时已经达到了20.7%,13代为26.4%。因为细胞凋亡时细胞的核质出现退化,提示以输卵管上皮细胞作为核移植供体材料或建立早期胚胎发育的共培养体系时,应该使用10代以前的细胞为宜。     

显微操作针的制作

显微操作技术如今已广泛应用于胚胎生物工程,如体细胞核移植、显微受精、胚胎性别鉴定和胚胎分割等。完成这些工作,首先必须有符合要求的显微操作针,由国外购买成品针用于显微操作人员培训其成本太高。本实验室主要从事牛、羊的体细胞克隆工作,所以由国外购买了拉针仪、煅针仪和磨针仪。经过一年的学习摸索,显微操作针的制作已很熟练,而国内做显微操作针的相关资料还很少,现将实验中摸索出来的一些方法和技巧总结出来与同行共享。1做针用材料实验室购买的是NIKON和LEICA公司的显微操作系统,因此使用的是与其相匹配的外径为1mm,壁厚0.1mm…     

良种肉用绵羊与小尾寒羊杂一代屠宰试验研究

细胞电融合的原理是先通过双向电泳使细胞间排列成串珠状，互相紧密接触，随后给予短暂的高压脉冲，引起细胞膜穿透，细胞膜发生结合导致细胞融合。本试验以盘羊和北山羊的皮肤成纤维细胞为供核细胞，以绵羊和山羊卵母细胞为供体细胞进行了异种核移植，对不同电融合条件下对核移植胚胎的发育影响进行了比较。结果发现，盘羊的皮肤纤维细胞可以和绵羊的卵母细胞融合，北山羊的皮肤纤维细胞可以和山羊的卵母细胞融合；     

应用奶牛性控冻精人工授精及胚胎生产的效果分析

实现奶牛出生性别控制．多产母牛犊是广大奶牛养殖人员的美好愿望，是奶牛业发展的必然要求，是实现奶牛业经济效益的重要手段．是实现我国畜牧业快速发展的必然需要。     

牛乳铁蛋白基因N-lobe的cDNA克隆及毕赤酵母表达载体的构建

以牛乳腺组织总RAN为模板,经RT-PCR得到牛乳铁蛋白基因的N-lobe片段并将其克隆到pGM-T克隆载体上,最后将其连入表达载体pPICZαA中,构建牛乳铁蛋白基因N-lobe的酵母表达载体。结果表明：克隆片段大小为1028bp,与Gen Bank中登录的序列的相应部位相比,所获牛乳铁蛋白N-lobe cDNA序列的同源性为99.7%;重组表达质粒经酶切和PCR鉴定构建正确,为酵母表达乳铁蛋白基因N-lobe奠定了基础。     

牛输卵管上皮细胞转人胶原蛋白cDNA基因及转基因克隆胚胎

以2岁奶牛输卵管为材料,用胰酶消化法分离得到了牛输卵管上皮细胞。输卵管上皮细胞在DMEM／F12培养基中生长良好。用一代牛输卵管上皮细胞为靶细胞,对其进行了电穿孔转染,转染对象是分子大小为31085bp的以β-casein启动子为基础的含有人胶原蛋白cDNA基因和EGFP、Neor双标记基因的质粒。电穿孔试验发现,牛输卵管上皮细胞在低渗缓冲液中电转染可以获得阳性转染子,其中以90mOsm／kg为最佳。电压以800V为好,电压高和低都不利于电穿孔的成功。成功转染的细胞用800mg/L G418进行筛选,在10d后获得了较大的阳性细胞克隆簇。对获得的阳性细胞克隆簇进行扩大后,得到了较纯的阳性细胞克隆系,流式细胞仪检测其纯度为81．6％。在荧光显微镜下选择阳性细胞作为核移植供体细胞进行了转基因克隆试验,结果显示以转基因和非转基因细胞为核供体获得的重构胚融合率差异显著（51．9％比63．2％）,获得的桑椹胚／囊胚率差异不显著（20．3％比25．5％）。对获得的具有绿色荧光的胚胎进行DNA分析,结果显示这些胚胎成功转入了外源基因,并且转入的外源基因结构完整。     

性控冻精在奶牛生产中应用与展望

XY精子流式细胞分选技术是目前最有效的性别控制繁殖手段之一。本文使用冷冻后X精子人工授精,平均情期受胎率达63%,青年母牛的情期受胎率为77.45%;用性控冻精通过超排技术生产体内性控胚胎平均每头次达5.2枚。用PCR技术对生产的体内胚胎进行性别鉴定后,雌性胚胎的比率为92.98%,实际出生牛犊的母犊率在93%左右。由此表明,使用XY种畜(天津)有限公司生产的性控冻精在生产中应用效果良好,在受胎率不受影响的情况下其性控率可达90%以上。     

不同级别绵羊卵母细胞在春季体外培养条件下的成熟率比较

为了对在春季屠宰场所采绵羊卵母细胞的分布及不同分布的成熟率有明确的认识．2003年3月至4月共进行15次试验，收集卵母细胞1485枚。按卵母细胞外层所含卵丘细胞及完整程度分戍A、B、C、D、E5个级别。A级：卵丘细胞层完整且紧密，一般为4层以上；B级：卵丘细胞层完整，一般为1～3层；C级：有卵丘细胞包被，但不完全；D级：裸卵，但细胞质均匀，细胞形态完好；E级：退化裸卵，胞质不均匀，细胞形态消失。选择A，B，C，D级卵母细胞单独进行体外成熟培养，培养液为TCM-199 5％FCS 5μg/mL LH 5μg／mL FSH 1μg／mL β-estradiol 2％penstrep，培养奈件为5％CO2,38．5℃,饱和湿度。结果显示：A，B，C,D级的分布分别为19．8％、28．1％、19．6％和32．4％．成熟率分别为81．3％、65．3％、61．5％和17．0％。总体成熟率为52．1％,卵丘一卵母细胞复合体(COCs)的成熟率为68．9％。     

电融合条件对盘羊、北山羊异种核移植胚胎发育的影响

本试验通过对异种核移植后电融合的参数进行比较,发现盘羊的皮肤纤维细胞可以和绵羊的卵母细胞融合,北山羊的皮肤纤维细胞可以和山羊的卵母细胞融合;对盘羊细胞电融合强度为1.4 kV/cm、20 μs/次的融合率要较1.3 kV/cm、20μs/次高,并且降低融合后重构胚死亡率,显著提高重构胚的分裂率;对北山羊的细胞电融合强度为1.5 kV/cm、20 μs/次的融合率要较1.4 kV/cm、30 μs/次和1.6 kV/cm、20 μs/次高;融合后的重构胚胎能够正常分裂,并在子宫中着床发育.