体外培养的绵羊卵丘/颗粒细胞周期特征分析

作者探讨了体外培养的绵羊卵丘/颗粒细胞在不同生长状态、不同传代次数的细胞周期特征。流式细胞仪分析结果显示:第3代和第13代细胞生长至50%~60%汇合、70%~80%汇合和完全汇合时处于G0/G1期细胞的比例分别为76.6%±1.7%、83.4%±1.65%、84.53%±2.27%和66.8%±1.84%、72.8%±2.09%、76%±3.41%。低代细胞处于G0/G1期的比例显著高于高代细胞(P<0.05),高汇合度的细胞处于G0/G1期的比例显著高于低汇合度的细胞(P<0.05)。这表明核移植时选用低代高汇合度的培养细胞为宜。     

云南半细毛羊毛囊干细胞凋亡研究

采用2种不同方法检测云南半细毛羊毛囊干细胞(hair follicle stem cells,HFSCs)凋亡情况,为后续的诱导分化研究奠定基础。利用凯基TUNEL-细胞凋亡原位检测试剂盒和Annexin V-EGFP/PI标记结合流式细胞仪检测HFSCs凋亡。结果:凯基TUNEL-细胞凋亡原位检测试剂盒检测表明,第2代细胞凋亡率6.0%,第6代细胞凋亡率6.5%;Annexin V-EGFP/PI标记结合流式细胞仪检测表明,第2代细胞凋亡率0.24%,第6代细胞凋亡率0.80%。说明云南半细毛羊HFSCs细胞生长状态很好。随着传代次数的增加,细胞凋亡率有所上升。     

水牛卵巢颗粒细胞的分离培养及凋亡测定

研究主要是通过比较水牛卵巢颗粒细胞在不同培养基中的生长状态,并对细胞的增殖、核型及凋亡情况进行检测,以了解水牛卵巢颗粒细胞体外生长特性,建立水牛卵巢颗粒细胞的体外培养体系。结果发现,分离获得的水牛卵巢颗粒细胞存活率约为60%;采用DMEM培养基,颗粒细胞的生长速度和生长状态优于TCM-199和DMEM/F12培养基;细胞培养24 h后开始零星增殖,3~5 d增殖速度达到高峰;第1、3、5、7代颗粒细胞正常核型比率差异不显著,均在85%以上;第1代颗粒细胞的凋亡率与第5代差异显著(P<0.05),与第7代差异极显著(P<0.01)。结果表明,DMEM培养基更适宜用于水牛颗粒细胞的体外培养;水牛颗粒细胞能稳定地进行传代培养,染色体的数目不会发生明显改变,但细胞凋亡率会随着培养代数的增加而明显升高。     

猪小肠上皮细胞分离培养与鉴定

为建立功能性永生化的猪小肠上皮细胞系,并为猪肠道营养吸收与免疫调控以及仔猪肠道疾病发病机制的研究提供细胞模型,本试验采用组织块培养法来分离纯化猪小肠上皮细胞,并通过细胞角蛋白18、细胞增殖曲线、核型分析来鉴定猪小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块培养法能够成功培养猪小肠上皮细胞并稳定传11代。2)本试验获得的猪小肠上皮细胞角蛋白18抗原鉴定为阳性,染色体核型为二倍体。3)倒置显微镜下观察培养至第11代的猪小肠上皮细胞仍然保持着上皮细胞的特征,呈现"铺路石"和上皮样形态。培养11代后的猪小肠上皮细胞间隙开始变大,规则不明显,细胞开始凋亡。第15代的猪小肠上皮细胞则出现大量凋亡并从瓶底脱落,仅有很少细胞贴壁生长。综上所述,采用组织块培养法能够获得生物学功能稳定的猪小肠上皮细胞系并能正常传11代,可为细胞的永生化提供试验素材。     

家兔子宫内膜细胞和平滑肌细胞的分离培养

本试验旨在体外分离培养兔子宫内膜细胞(腺上皮细胞和基质细胞)和平滑肌细胞,并且探讨纯化子宫内膜上皮细胞和基质细胞的方法。用差速离心法和差速贴壁法获得纯化的子宫内膜上皮细胞和基质细胞,用滤网法分离得到子宫平滑肌细胞,分别在添加20%胎牛血清(FBS)、100μg/mL牛胰岛素、63.5 nmol/L雌二醇(E2)、7.14nmol/L孕酮(P4)的DMEM/F12(1∶1)培养液和37℃5%CO2的饱和湿度条件下培养;用免疫组化和免疫荧光法鉴定细胞并检测分离的细胞纯度。结果表明用该方法成功地分离培养了兔子宫内膜上皮细胞和基质细胞,且2种细胞纯度都达98%左右,基质细胞出现蜕膜化;子宫平滑肌细胞的纯度为97%左右,而且出现横纹状的生长。本研究表明子宫内膜细胞和平滑肌细胞能够在体外成功培养;在含20?S、100μg/mL牛胰岛素、63.5 nmol/L E2、7.14 nmol/L P4的DMEM/F12(1∶1)培养液和37℃5%CO2饱和湿度的培养条件下最有利于体外培养的子宫内膜细胞和平滑肌细胞的生长。     

4℃保存的小鼠胎体皮肤成纤维细胞继代培养及冻存

为了探讨利用死亡动物皮肤组织获取成纤维细胞的方法,研究将小鼠胎体或皮肤分别在4℃的mPBS液中保存24~120 h,然后通过原代培养、冷冻复苏和继代培养,观察了皮肤成纤维细胞的生长增殖能力。结果表明:与新鲜皮肤(对照组)原代培养成纤维细胞达到85%以上汇合需要8 d相比,4℃保存24~120 h后的皮肤(试验组)需要的时间延长(9~21 d),但仍能贴壁生长并达到85%以上汇合,且皮肤保存法优于胎体保存法;各试验组经3~4 d继二代培养即可达到85%汇合(对照组为3 d);冷冻复苏的各试验组原代培养细胞,经继二代培养即可在3~4 d内达到85%以上汇合。说明动物死亡后,若及时采集其皮肤并在4℃的mPBS液中保存一段时间,经原代培养和继代培养,或经原代培养、冷冻复苏和继代培养,可获得具有正常继代能力的成纤维细胞。     

不同培养体系对牛体外受精早期胚胎发育的影响

为探讨体外受精早期胚胎的最佳体外培养体系,将从屠宰牛卵巢上获取的卵母细胞进行体外成熟培养、体外受精后获取的早期胚胎,分别用TCM199和mSOFaa与牛卵泡颗粒细胞和牛输卵管上皮细胞进行共培养。结果表明：TCM199和mSOFaa均能使体外受精胚胎突破8～16细胞期的发育阻断,但是囊胚发育率仅为14.3%和15.5%,差异不显著;胚胎与牛卵泡颗粒细胞和牛输卵管上皮细胞进行共培养能够使胚胎的囊胚发育率达到30.2%和33.5%,差异不显著。     

牛输卵管上皮细胞转人胶原蛋白cDNA基因及转基因克隆胚胎

以2岁奶牛输卵管为材料,用胰酶消化法分离得到了牛输卵管上皮细胞。输卵管上皮细胞在DMEM／F12培养基中生长良好。用一代牛输卵管上皮细胞为靶细胞,对其进行了电穿孔转染,转染对象是分子大小为31085bp的以β-casein启动子为基础的含有人胶原蛋白cDNA基因和EGFP、Neor双标记基因的质粒。电穿孔试验发现,牛输卵管上皮细胞在低渗缓冲液中电转染可以获得阳性转染子,其中以90mOsm／kg为最佳。电压以800V为好,电压高和低都不利于电穿孔的成功。成功转染的细胞用800mg/L G418进行筛选,在10d后获得了较大的阳性细胞克隆簇。对获得的阳性细胞克隆簇进行扩大后,得到了较纯的阳性细胞克隆系,流式细胞仪检测其纯度为81．6％。在荧光显微镜下选择阳性细胞作为核移植供体细胞进行了转基因克隆试验,结果显示以转基因和非转基因细胞为核供体获得的重构胚融合率差异显著（51．9％比63．2％）,获得的桑椹胚／囊胚率差异不显著（20．3％比25．5％）。对获得的具有绿色荧光的胚胎进行DNA分析,结果显示这些胚胎成功转入了外源基因,并且转入的外源基因结构完整。     

鸡输卵管囊肿病病原的分离与鉴定

用病鸡的输卵管囊肿液中脱落的上皮细胞感染SPF鸡胚及BHK21、Vero、L929细胞,观察3～10d鸡胚死亡情况及细胞生长情况,并进行病原分离、鉴定、检测等.结果为SPF鸡胚感染后盲传15代,1～11代基本无鸡胚死亡,12～15代鸡胚有死亡.细胞感染后第1代可见到CPE,敏感性L929＞Vero＞BHK21细胞,被感染的细胞及卵黄膜(第4代起)CF呈阳性;电镜观察到胞浆中有衣原体;Giemsa染色光镜下可见包涵体颗粒;碘染色及磺胺嘧啶敏感试验均呈阴性;病毒学及细菌学检测阴性;雏鸡感染试验阳性;病鸡肝、脾、输卵管等组织病理变化明显.     

鸡输卵管囊肿病病原的分离与鉴定

用病鸡的输卵管囊肿液中脱落的上皮细胞感染SPF鸡胚及BHK21、Vero、L929细胞,观察3～10 d鸡胚死亡情况及细胞生长情况,并进行病原分离、鉴定、检测等.结果为SPF鸡胚感染后盲传15代,1～11代基本无鸡胚死亡,12～15代鸡胚有死亡.细胞感染后第1代可见到CPE,敏感性L929>Vero>BHK21细胞,被感染的细胞及卵黄膜(第4代起)CF呈阳性;电镜观察到胞浆中有衣原体;Giemsa染色光镜下可见包涵体颗粒;碘染色及磺胺嘧啶敏感试验均呈阴性;病毒学及细菌学检测阴性;雏鸡感染试验阳性;病鸡肝、脾、输卵管等组织病理变化明显.     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量。BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液。A组:85%DMEM+10%胎牛血清+5%DMSO;B组:80%DMEM+10%胎牛血清+10%DMSO;C组:75%DMEM+10%胎牛血清+15%DMSO;D组:70%DMEM+10%胎牛血清+20%DMSO;E组:85%DMEM+5%胎牛血清+10%DMSO;F组:75%DMEM+15%胎牛血清+10%DMSO;G组:70%DMEM+20%胎牛血清+10%DMSO;H组:80%DMEM+10%胎牛血清+10%甘油;I组:70%DMEM+10%胎牛血清+20%甘油;J组:60%DMEM+10%胎牛血清+30%甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106个/mL冻存。分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst33258双染计算凋亡率。结果表明,BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性(P>0.05);传代后B组细胞的生长状况最好。     

山羊副流感病毒3型通过Caspase途径诱导气管上皮细胞凋亡

旨在揭示山羊副流感病毒3型(CPIV3)感染气管上皮细胞后是否可诱导细胞发生凋亡,并对细胞凋亡的信号通路进行初步探究。本研究将CPIV3病毒液接种气管上皮细胞,在12、24、36、48、72和96 h收集培养物上清检测病毒增殖滴度;通过形态学观察CPIV3诱导气管上皮细胞病变(CPE)情况;采用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒和Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性检测试剂盒检测凋亡水平及相关指标;荧光定量PCR检测细胞凋亡分子mRNA表达水平;Western blot分析激活型Caspase-3蛋白表达变化情况。结果显示,CPIV3在气管上皮细胞中的增殖呈上升趋势,96 h能达到10~(4.50)TCID_(50)·mL~(-1);形态学观察发现,病毒接种后48 h出现细胞收缩变圆、脱落等CPE现象;流式细胞术检测及Caspase活性检测表明,感染组细胞出现细胞凋亡,48 h后细胞凋亡率达19.66%,且Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性随着时间延长逐渐升高;死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径细胞凋亡因子mRNA表达上调。Western blot分析揭示,激活型Caspase-3蛋白在病毒感染过程中被活化。本研究证实CPIV3感染可诱导气管上皮细胞凋亡,且Caspase途径在病毒诱导细胞凋亡的过程中发挥重要作用。     

不同细胞密度冻存对奶牛乳腺上皮细胞的影响

试验采用了内蒙古呼和浩特健康荷斯坦奶牛乳腺组织经5代纯化后,将奶牛乳腺上皮细胞分别设为1组（1×104个细胞/mL）、2组（1×105个细胞/mL）、3组（1×106个细胞/mL）、4组（1×107个细胞/mL）4个密度梯度进行冻存,复苏后检测细胞死亡率、贴壁率、凋亡率并进行形态学观察。结果显示,4组复苏后死亡率极显著低于其他3组（P〈0.01）,贴壁率显著高于其他3组（P〈0.05）;3组细胞凋亡率显著低于其他3组（P〈0.05）;3、4组细胞到第3天基本铺满瓶底,生长状态良好。     

不同细胞密度冻存对奶牛乳腺上皮细胞的影响

试验采用了内蒙古呼和浩特健康荷斯坦奶牛乳腺组织经5代纯化后,将奶牛乳腺上皮细胞分别设为1组(1×104个细胞/mL)、2组(1×105个细胞/mL)、3组(1×106个细胞/mL)、4组(1×107个细胞/mL)4个密度梯度进行冻存,复苏后检测细胞死亡率、贴壁率、凋亡率并进行形态学观察。结果显示,4组复苏后死亡率极显著低于其他3组(P<0.01),贴壁率显著高于其他3组(P<0.05);3组细胞凋亡率显著低于其他3组(P<0.05);3、4组细胞到第3天基本铺满瓶底,生长状态良好。     

不同细胞密度冻存对奶牛乳腺上皮细胞的影响

试验采用了内蒙古呼和浩特健康荷斯坦奶牛乳腺组织经5代纯化后,将奶牛乳腺上皮细胞分别设为1组(1×104个细胞/mL)、2组(1×105个细胞/mL)、3组(1×106个细胞/mL)、4组(1×107个细胞/mL)4个密度梯度进行冻存,复苏后检测细胞死亡率、贴壁率、凋亡率并进行形态学观察.结果显示,4组复苏后死亡率极显著低于其他3组(P＜0.01),贴壁率显著高于其他3组(P＜0.05);3组细胞凋亡率显著低于其他3组(P＜0.05);3、4组细胞到第3天基本铺满瓶底,生长状态良好.     

绵羊输卵管上皮细胞的分离与培养

通过建立输卵管上皮细胞的体外培养和传代的方法，进行形态学观察及冻存。取雌性绵羊输卵管上皮细胞，用胶原酶消化和不锈钢网过筛法分离输卵管内膜基质细胞和上皮细胞，进行单细胞原代及传代培养。在输卵管上皮细胞的培养可持续培养4-6周，传3-4代。原代培养细胞7d长成单层，传代细胞4d长成单层。该研究旨在建立一套输卵管上皮细胞体外培养和传代的方法，为进一步研究β-防御素在雌性生殖道的作用方面提供很好的研究模型。     

昆明小鼠胚胎成纤维细胞体外培养条件初步研究

本研究旨在探索影响小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)分离培养的因素,建立有效的胚胎成纤维细胞培养体系,为构建饲养层细胞与体细胞核移植技术的细胞核供体建立平台。本研究用组织细胞培养液DMEM作为基础培养液,观察了不同胎龄、不同血清浓度及不同胰蛋白酶作用时间等因素对MEF分离培养的影响。结果显示,在所进行的4个胎龄8.5、10.5、12.5、14.5 d的比较试验中,原代成纤维细胞分离培养的最适胎龄为12.5 d,细胞贴壁迅速,12 h已完全贴壁,增殖速度快;在所进行的不同时间5、10、15、30 min的胰蛋白酶消化中,最佳时间为5~10 min;在所进行的5个血清浓度7%、9%、10%、11%、13%的比较试验中,添加11%胎牛血清浓度培养效果最佳,从3~5代增殖倍数稳定在1.35左右,传代时间也相对较长。以上结果表明,采用12.5 d胎鼠,胰蛋白酶消化5~10 min,在含有11%血清的DMEM培养液中培养MEF细胞时,原代和传代效果最好,传代至第3~5代时细胞生长增殖最旺盛,处于对数分裂期,适宜作为饲养层细胞与体细胞核移植细胞核供体。     

透明质酸酶对牛卵母细胞孤雌激活的研究

在37－39℃50mL/L CO2条件下，用含80mL/L发情牛血清及50mL/L犊牛血清的M199成熟培养液培养牛的A、B级卵丘－卵母细胞复合体（COCs)，18－22h后以无血清的TCM199培养液洗涤3次，用透明质酸酶消化吹打脱去卵丘细胞，以无血清的M199培养液洗涤3次，移回成熟培养液中培养。结果：卵细胞于成熟后第3d开始出现卵裂，第5d卵裂率达到37％，第9d囊胚率达5％－9％。表明透明质酸酶可以促使成熟的牛孤雌卵母细胞激活并发育至囊胚。     

比格犬排卵时间预测

本实验通过采用阴道涂片、排卵测定仪、母犬发情的特征和公犬试情、对排卵期前后血清中促黄体素(LH)、雌二醇(E2)及孕酮(P)等生殖激素的含量进行检测,对发情母犬进行排卵检查。根据文献资料,母犬角质化细胞达到90%～100%、排卵测定仪数值达到最高值(一般为1 500)后1～2 d、母犬从开始接受公犬爬跨到第3 d左右、LH峰值之后2～3 d为母犬的排卵时间。本实验中,当母犬滴血第11 d,阴道涂片细胞角质化率达到91%,排卵测定仪达到最高值,所有母犬愿意接受交配,LH值在峰值后2～3 d范围内,综合预测比格犬的排卵时间为阴道滴血第11～13 d。