长毛兔毛乳头细胞的分离培养及生长特性研究

为了成功分离培养家兔毛乳头细胞(DPCs),为体外开展家兔毛囊发育的相关机制研究提供良好模型,本研究采用中性蛋白酶与胶原酶两步消化法,分离并纯化长毛兔DPCs,观察体外生长的DPCs细胞形态并绘制生长曲线。结果表明,长毛兔DPCs在第47天进入对数生长期;体外培养的DPCsα-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白(VIM)表达均呈阳性,证实分离培养的细胞确为毛囊真皮源性的毛乳头细胞。ECCK-8比较第3代和第9代DPCs的增殖特性,显示在120h和144h生长高峰时,第9代的细胞密度显著低于第3代的细胞密度(P0.05);细胞周期结果显示,在72h、96h、122h和144h时,第3代DPCs的G0/G1期比例显著低于第9代(P0.05),而G2/M期的细胞比例显著高于第9代(P0.05),表明传至9代以后DPCs不再适合体外培养。本研究成功建立了长毛兔毛乳头细胞体外培养条件,为体外研究家兔毛囊发育机制奠定良好的理论基础。     

自噬在ZEA对睾丸支持细胞细胞周期影响中的作用

为探讨玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)雄性生殖毒性的机理,本试验展开了ZEA对睾丸支持细胞细胞周期的影响以及自噬在ZEA对睾丸支持细胞细胞周期影响中的作用研究。试验以原代睾丸支持细胞为材料,分别以浓度为0(对照组),0.1,1,10,20,30μmol/L ZEA进行染毒,24h后利用CCK-8法、流式细胞术、免疫荧光技术和Western blot等进行ZEA对睾丸支持细胞的活率、细胞周期分布、LC3聚点、自噬及细胞周期相关蛋白等影响的检测。流式细胞术检测结果显示:与对照组比较,当ZEA浓度高于10μmol/L时,G0/G1期比例显著下降(P<0.05),G2/M期的比例极显著升高(P<0.01);与20μmol/L ZEA组相比,自噬抑制剂(CQ)+20μmol/L ZEA组细胞周期的G2/M期的比例显著降低(P<0.05),自噬促进剂(RAP)+20μmol/L ZEA组细胞周期的G2/M期的比例显著升高(P<0.05)。免疫荧光检测结果显示,当ZEA浓度高于10μmol/L时,产生LC3荧光信号的细胞数目较对照组呈极显著性升高(P<0.01)。Western blot检测结果显示:与对照组比较,当ZEA浓度高于10μmol/L时,LC3蛋白的表达量呈极显著性升高(P<0.01),CDK4、CyclinD1等细胞周期蛋白的表达显著降低(P<0.05);与20μmol/L ZEA组相比,CQ+20μmol/L ZEA组CyclinD1、CDK4等蛋白的表达量上升(P<0.05),RAP+20μmol/LZEA组CyclinD1、CDK4等的表达量下降(P<0.05)。结果表明:ZEA能诱导睾丸支持细胞发生自噬,并使睾丸支持细胞发生G2/M期阻滞,且存在剂量依赖性;促进自噬可导致细胞周期阻滞在G2/M期,造成M期延长,而自噬的缺陷可以部分逆转ZEA诱导睾丸支持细胞周期G2/M期的阻滞。在一定浓度范围内,ZEA能显著抑制睾丸支持细胞的增殖,细胞自噬在这一过程中起促进作用。     

二甲双胍对犬乳腺肿瘤细胞周期及其相关蛋白的影响

为研究二甲双胍对犬乳腺肿瘤细胞增殖和细胞周期的影响,以犬乳腺肿瘤CHMm和CHMp为模型,采用终浓度为0、5、10、20、40mmol/L二甲双胍对其进行干预,应用CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期分布比例,再通过Western blot检测细胞周期相关蛋白cyclin D1和p27的表达情况。二甲双胍作用48 h后,与对照组比较,CHMm细胞试验各组的成活率显著降低(P0.05),而CHMp细胞除了5 mmol/L组(P0.05),其他试验各组的成活率也显著低于对照组(P0.05),并且均呈现一定的浓度依赖性。流式细胞仪分析细胞分布比例发现,CHMm的G0/G1期细胞比例从(38.7±5.89)%增加到(70.36±5.78)%,CHMp的G0/G1期细胞比例也从(37.03±4.23)%增加到(54.92±4.67)%。随着二甲双胍作用浓度的增加,CHMm和CHMp细胞内cyclin D1表达量呈现减少的趋势,而p27表达量呈现上升的趋势。研究结果表明,二甲双胍可以抑制犬乳腺肿瘤细胞体外增殖能力,诱导细胞发生G0/G1期阻滞,并下调cyclin D1和上调p27细胞周期相关蛋白表达量,从而为犬乳腺肿瘤治疗提供一定的理论基础。     

miR-21与Nocodazole联合作用对小鼠成肌细胞C2C12周期的影响

观察miR-21与Nocodazole联合作用对小鼠成肌细胞C2C12周期的影响。分别以0、200、300、400、500、600 nmol/L Nocodazole处理C2C12细胞24 h,流式细胞仪检测细胞周期,间接免疫染色激光共聚焦显微镜观察细胞有丝分裂器α-微管蛋白(α-tubulin)排列。转染miR-21 mimics/NC和inhibitors/NC,24 h后,添加400 nmol/L的Nocodazole处理24 h,流式细胞仪检测细胞周期。结果表明:Nocodazole使C2C12细胞同步化的最佳浓度是400 nmol/L;过表达miR-21 mimics之后,与对照组相比,G0/G1,S期细胞百分比极显著增加,G2/M期细胞百分比极显著减少(P0.01);添加抑制剂后,与对照组相比,添加抑制剂(inhibitors)的C2C12细胞中处于G0/G1期的细胞比例显著高于对照组,而处于G2/M期的细胞比例显著低于对照组细胞(P0.05);正反试验结果证明,miR-21促进C2C12细胞周期进入S期。为进一步研究miR-21对C2C12细胞的作用机制奠定基础。     

半胱胺对成年鹅血浆中几种激素及胆固醇水平的影响

以 14只装有超静脉瘘管的成年杂交鹅 (川白×太湖 ) ,圈养 ,自身对照。试验期于日粮中一次性添喂半胱胺 (按每千克体质量 10 0 m g) ,经瘘管采取对照期和处理后第 1、3、5、7天的血样 ,用 RIA双抗法和分光光度法分别测定激素和胆固醇的含量。试验期各天 ,生长抑素的含量较对照期的 (1.89± 0 .10 ) μg/ L 分别显著降低 (P<0 .0 1或 P<0 .0 5 )4 1.18%、2 6 .74 %、37.4 3%、17.11% ;甲状腺素水平较对照期的 (5 .4 1± 0 .98) μg/ L 分别显著升高 6 0 .2 6 %、4 3.2 5 %、37.15 %、16 .82 % ;胰高血糖素的水平 ,在第 1、3天显著高于对照期 (0 .5 6± 0 .0 3) μg/ L 17.86 %、2 1.4 3% ,第 5天又降到低于对照期 2 6 .79% (P<0 .0 5 ) ,第 7天回升到接近对照期水平 ;胆固醇在第 1、2天分别显著低于对照期 (5 .19±0 .4 7) mmol/ L 2 5 .82 %和 19.6 5 % ,而第 7天却高于对照期 10 .98% (P<0 .0 5 )。结果提示 ,半胱胺能够降低成年鹅血液中生长抑素含量 ,使甲状腺素和胰高血糖素水平升高 ,胆固醇水平降低 ,由此影响类脂的代谢 ,有利于促生长     

转hTERT基因的山羊胎儿成纤维细胞的生物学特性及其表达分析

用脂质体介导法将hTERT基因转染到山羊胎儿成纤维细胞中,以期获得永生化的山羊胎儿成纤维细胞系。对转染后的阳性细胞进行细胞学和分子学相关检测。结果显示,导入hTERT的阳性细胞形态正常,并已传至第58代;未转染组细胞经长期传代后（30代）,增殖缓慢,部分细胞表现衰老和凋亡的迹象。RT-PCR检测转染组细胞中有hTERT基因表达。生长曲线绘制结果显示转染组（30代和50代）山羊胎儿成纤维细胞生长速度稍快于未转染组（5代）细胞,但差异不显著（P〉0.05）。转染组细胞生长旺盛,细胞接种后第6天,基本覆盖培养孔。而未转染组（30代）细胞一直生长缓慢,差异显著（P〈0.05）。未转染组（30代）山羊胎儿成纤维细胞处于S期细胞和G1期细胞分别为28.9%和60.8%,而转染组（30代）分别为45.2%和45.0%。说明外源性hTERT基因可促进山羊胎儿成纤维细胞由G1期向S期转变,并提高细胞增殖能力。转染组（50代）山羊胎儿成纤维细胞染色体核型正常,未发生变化。未转染组（30代）细胞凋亡率和死亡率分别为39.7%和29.4%,而转染组（30代）分别为11.0%和12.7%,差异极显著（P〈0.01）。hTERT蛋白在转染组（30代）山羊胎儿成纤维细胞中表达,蛋白相对分子质量为127 000。说明外源性hTERT基因可以延长胎儿成纤维细胞在体外培养的寿命,降低细胞凋亡率。     

序贯培养液G1/G2对山羊核移植胚胎发育和质量的影响

为了优化山羊核移植胚胎体外培养体系,提高核移植效率,本研究检测了山羊体细胞核移植(SCNT)胚胎在序贯培养液G1/G2中的发育率和囊胚细胞凋亡,以及核移植胚胎移植后的妊娠率,以传统mSOF-FBS培养液作为对照组,评估序贯培养液G1/G2支持山羊核移植胚胎的发育能力。结果显示,与对照组相比,G1/G2组的囊胚发育率差异不显著((27.7±3.1)%vs(25.3±1.0)%,P>0.05),囊胚细胞数和囊胚细胞凋亡率显著降低(分别为(93.2±4.5)vs(109.1±6.2)和(4.9±0.2)%vs(11.3±0.1)%,P<0.05),但移植后的妊娠率显著增高(21.4%vs 8.0%,P<0.05)。结果表明,与传统的培养液mSOF-FBS相比,序贯培养液G1/G2能更好地支持山羊核移植胚胎的发育。     

钙对体外培养大鼠成骨细胞增殖分化及细胞周期的影响

在体外培养大鼠成骨细胞的过程中,添加不同剂量的钙(0、1、2、4 mmol/L),通过检测细胞周期、细胞增殖能力、碱性磷酸酶(ALP)活性及骨桥蛋白表达,探讨了钙对成骨细胞增殖分化及细胞周期的影响.结果表明,2、4 mmol/L钙组在1～8 d均显著或极显著地促进成骨细胞增殖(P<0.05或P<0.01),1 mmol/L钙组则在5、6、8 d有显著或极显著的差异(P<0.05或P<0.01);添加不同浓度的钙除1 mmol/L组第2天外的不同时间均极显著地抑制细胞内ALP活性(P<0.01);1 mmol/L钙能极显著的使成骨细胞滞留在S期(P<0.01);添加不同浓度的钙均能使G2期显著或极显著的增加(P<0.05或P<0.01),G1期极显著的下降(P<0.01),并能极显著地诱导细胞内骨桥蛋白的表达(P<0.01).表明添加不同浓度的钙均能抑制其早期分化,促进成骨细胞的增殖,使细胞滞留在S期或G2期,诱导细胞在基质成熟期分化,有利于细胞的钙化.     

过表达冷诱导RNA结合蛋白对BHK-21细胞增殖的影响

用常规细胞培养法连续传代培养Cirp过表达BHK-21细胞至第8代标记为BHK-21-Cirp△,通过HE染色和扫描电镜对细胞形态观察,用BHK-21-Cirp△和BHK-21-ShCirp分别与BHK-21-GFP进行细胞增殖速度的比较,并绘制96 h增殖曲线计算比生长速率,用流式细胞仪检测各试验细胞周期。HE染色和电镜观察均显示BHK-21-Cirp△与正常BHK-21细胞形态差异较大,在相同条件下24 h～96 h BHK-21-Cirp△活细胞数比BHK-21-GFP活细胞数高(P0.01),BHK-21-Cirp△平均比生长速率高于BHK-21-GFP,48 h～96 h内BHK-21-GFP和BHK-21-ShCirp的活细胞个数差异显著(P0.05),BHK-21-GFP的平均比生长速率高于BHK-21-ShCirp的平均比生长速率;BHK-21-Cirp△、BHK-21-GFP、BHK-21-ShCirp处于G0-1期的DNA含量(细胞数量比)依次为52.4%、55.3%和66.7%,处于S期的DNA含量依次为26.1%、24.7%和19.7%。CIRP对BHK-21细胞增殖起正向调节作用,CIRP的过表达可促进BHK-21细胞增殖,导致BHK-21细胞可能突变为肿瘤细胞,其敲低也能抑制BHK-21细胞的增殖。在其他试验条件相同情况下,CIRP能够促进BHK-21细胞提前进入S期,加快细胞周期进程,增加了BHK-21细胞增殖。     

水牛卵巢颗粒细胞的分离培养及凋亡测定

研究主要是通过比较水牛卵巢颗粒细胞在不同培养基中的生长状态,并对细胞的增殖、核型及凋亡情况进行检测,以了解水牛卵巢颗粒细胞体外生长特性,建立水牛卵巢颗粒细胞的体外培养体系。结果发现,分离获得的水牛卵巢颗粒细胞存活率约为60%;采用DMEM培养基,颗粒细胞的生长速度和生长状态优于TCM-199和DMEM/F12培养基;细胞培养24 h后开始零星增殖,3~5 d增殖速度达到高峰;第1、3、5、7代颗粒细胞正常核型比率差异不显著,均在85%以上;第1代颗粒细胞的凋亡率与第5代差异显著(P<0.05),与第7代差异极显著(P<0.01)。结果表明,DMEM培养基更适宜用于水牛颗粒细胞的体外培养;水牛颗粒细胞能稳定地进行传代培养,染色体的数目不会发生明显改变,但细胞凋亡率会随着培养代数的增加而明显升高。     

牛输卵管上皮细胞的纯化培养与生长特性研究

研究依据牛输卵管上皮细胞与成纤维细胞对EDTA/胰酶消化敏感性不同,分离纯化牛输卵管上皮细胞,并以其进行生长曲线和细胞凋亡趋势的研究。结果表明:荷斯坦奶牛输卵管上皮细胞在DMEM/F12培养基中生长旺盛,第3代细胞在2.5×104个细胞/孔的起始浓度下,生长周期明显,7 d左右可以达到100%汇合。第11代细胞达到100%汇合的时间较第3代细胞延长3 d左右,细胞出现滞长现象。用膜联蛋白V-FITC/PI双标记流式细胞术检测输卵管上皮细胞凋亡,发现输卵管上皮细胞在生长期细胞凋亡速度慢,在接触生长期中短期内饥饿培养对凋亡影响不大。9代以前细胞凋亡率每代增加约1%左右,但9代后凋亡率明显加快,在9代时为15.5%,11代时已经达到了20.7%,13代为26.4%。因为细胞凋亡时细胞的核质出现退化,提示以输卵管上皮细胞作为核移植供体材料或建立早期胚胎发育的共培养体系时,应该使用10代以前的细胞为宜。     

TSA处理供体细胞对组蛋白乙酰化和核重编程效果的影响

克隆胚胎基因组的不完全重编程是克隆动物成功率低的主要原因.试验中以第5代牛胎儿成纤维细胞作为供体核,以牛卵母细胞作为受体胞质进行体细胞核移植,用75 nmol·L-1曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)分别处理供体细胞6、12和24 h,通过核移植检测克隆胚胎发育率,并应用激光共聚焦显微镜技术和流式细胞术检测处理细胞和克隆囊胚组蛋白H3K18乙酰化水平和细胞周期.结果显示:随着TSA处理时间的延长,供体细胞组蛋白H3K18乙酰化水平不断提高;以75 nmot·L-1TSA处理供体细胞12 h的克隆胚的囊胚发育率显著高于未处理组(23.5%vs 15.7 %,P<0.05);供体细胞经TSA处理的克隆囊胚组蛋白H3K18乙酰化水平与未处理组相比差异不显著(P>0.5);处理组和对照组细胞G0/G1期和S期比例间存在显著差异(P<0.05).结论:TSA对核供体细胞的处理存在时间效应,75 nmol·L-1TSA处理12 h的牛胎儿成纤维细胞更易被卵母细胞重编程,显著提高了克隆胚的体外发育能力,初步证实TSA是通过提高供体细胞组蛋白乙酰化水平来促进供体细胞重编程的.     

绵羊卵丘/颗粒细胞周期时相同步化处理的流式细胞仪分析

体外培养绵羊卵丘/颗粒细胞,传2～3代后,分别经低温冷藏处理6h和血清饥饿培养3d,流式细胞仪检测分析异倍体细胞检出率和处理组与对照组的细胞周期时相百分比。本培养系统各组均未检出异倍体细胞;低温冷藏处理组、血清饥饿处理组与对照组处于G0/G1期时相细胞百分比分别为93.3%±2.1%、92.4%±1.02%和84.5%±2.27%。试验结果表明,低温冷藏处理与血清饥饿培养都能很好地使绵羊卵丘/颗粒细胞同步于G0/G1期。     

饲养层细胞的接种密度对分离培养胚胎干细胞的影响

建立有效的昆明白小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)饲养层培养体系,用于分离和培养小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)的研究.(1)取怀孕14.5 d昆明白小鼠胎儿分离成纤维细胞,利用体外培养体系分离传代,选取生长旺盛并且已纯化的P3代的MEF,经丝裂霉素处理后.用细胞计数板计算活细胞数,分别按1×104、1×106、1×108/mL密度接种,制备饲养层,观察不同密度饲养层的生长状况.(2)取怀孕4 d的昆明白小鼠囊胚,接种在不同密度饲养层上.观察不同密度饲养层上囊胚、ICM及ES细胞的克隆生长情况.结果显示:囊胚在密度为1 × 106/mL的饲养层上,贴壁率和ICM孵出率分别为(97.0±3.606)%和(96.3±2.887)%,显著高于其他2组;密度为1×104/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率高于密度为1×104/mL(差异极显著,P<0.01)和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率(差异显著,P<0.05);而1×104/mL饲养层和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率差异不显著(P>0.05).结果表明:以1×104/mL密度接种的MEF作为饲养层,最适合用于分离培养昆明白小鼠ES细胞,有利于囊胚的发育,ICM的增殖,促进ES细胞的增殖,并起到抑制其分化的作用.     

shRNA介导chTERT基因沉默抑制MDCC-MSB1细胞增殖

几乎所有类型的人类肿瘤都可以检测到端粒酶的活性,通过抑制端粒酶逆转录酶基因(TERT)表达降低端粒酶活性可能是进行抗肿瘤治疗的一个新靶点。本试验通过构建靶向端粒酶TERT基因的shRNA(Sh1,Sh2和Sh3)表达质粒载体转染MDCC-MSB1细胞抑制chTERT基因表达,从而降低端粒酶活性及细胞增殖。Real-time PCR结果显示,Sh1和Sh3在质粒载体转染细胞后48,72,96h显著抑制chTERT基因表达(P<0.05),且呈持续效果;TRAP法端粒酶活性分析显示,Sh1和Sh3在质粒转染细胞72h显著降低端粒酶活性;流式细胞分析显示,Sh3在转染后72h显著降低了S期细胞的比例(P<0.01),G2/M期细胞比例显著上升(P<0.01),G0/G1期细胞比例没有明显变化(P>0.05),抑制了MDCC-MSB1细胞的增殖。结果提示,shRNA通过抑制TERT基因表达可有效降低端粒酶活性,阻滞肿瘤细胞的增殖,为抗癌症治疗提供了新的备选方案及具有参考价值的基础科学数据。     

鸡Bcl-2基因的克隆及其对卵泡颗粒细胞凋亡的影响

将鸡的 Bcl- 2基因克隆到真核表达载体 JL V中 ,构建了重组质粒 JL VB。 0 .2μg/孔 JL VB重组质粒经脂质体介导转染卵泡颗粒细胞 ,应用流式细胞术等方法分析了转染 Bcl- 2基因后原代细胞和传代细胞的生长与凋亡情况。与对照组相比 ,转染后的传代细胞分裂速度较快 (P<0 .0 1) ,凋亡比率较低 ,G2 / M S期细胞比例极显著高于对照组 (P<0 .0 1)。这些结果表明 ,Bcl- 2基因具有促进细胞分裂、抑制细胞凋亡、延长细胞寿命的作用 ,这种作用是直接的。在转染时间为 12 h、DNA量为 0 .3μg/孔的条件下 ,较好的脂质体介导用量为 1.2 μL/孔。     

DDR1对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的调控作用

旨在通过干扰或过表达盘状蛋白结构域受体1（DDR1）基因,探讨其对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及周期的影响。本研究将DDR1基因小干扰RNA片段和过表达载体pcDNA3.1-DDR1转染奶牛乳腺上皮细胞,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中DDR1的干扰和过表达效果;利用CCK-8法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡（早凋、晚凋）的变化;利用qRT-PCR检测增殖与凋亡相关基因的表达情况。结果,在奶牛乳腺上皮细胞中干扰DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别下调94%和30%,而过表达DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别上调68.24和1.38倍;干扰DDR1极显著抑制细胞的增殖（P<0.01）,细胞早凋与晚凋比例极显著上升（P<0.01）;干扰组G1期细胞比例极显著上升（P<0.01）,S期细胞比例极显著下降（P<0.01）,G2期细胞比例显著下降（P<0.05）,提示细胞阻滞在G0/G1期。相反,过表达DDR1能显著促进细胞增殖（P<0.05）,显著抑制细胞晚期凋亡（P<0.05）,G1期细胞比例极显著下降（P<0.01）,S期细胞比例极显著上升（P<0.01）,促进细胞由G1期向S期的转换。qRT-PCR检测结果显示,干扰DDR1后显著上调BAX、Caspase9基因的表达（P<0.05）,极显著上调P53、FAS基因的表达（P<0.01）,且显著下调PCNA、CyclinB1基因的表达（P<0.05）;过表达DDR1后,分别显著和极显著下调Cytc与BAX基因的表达（P<0.05,P<0.01）,并极显著上调CyclinB1基因的表达（P<0.01）。综上可见,DDR1能够调控奶牛乳腺上皮细胞的增殖、凋亡和周期,可为阐明DDR1参与奶牛乳腺上皮细胞生长发育的分子机制提供参考。     

驴皮成纤维细胞的体外培养研究

试验旨在比较不同培养方法对驴皮成纤维细胞培养的效果,以便建立其体外高效快速的培养体系。采集6~7岁健康的新疆驴真皮组织,分别用组织块贴壁法和双酶消化法对驴皮成纤维细胞进行原代培养,并检测分析细胞的生长特点、生长速度、细胞周期与支原体污染等指标。结果显示,双酶消化法（0.25%胰酶处理1 h,再用0.5%胶原蛋白酶Ⅰ处理6 h）培养驴皮组织3 d后,成纤维细胞进入了对数增殖期,而组织块贴壁法则需要15 d;细胞周期经流式分析发现,处于G0/G1期与S+G2+M期的细胞均约为50%,其余5.17%细胞处于凋亡期,表明大多细胞处于分裂增殖的活跃期,细胞具有很强的活力;试验中培养的细胞均无支原体污染。综上,应用双酶消化法可快速、高效地建立驴皮成纤维细胞体外培养体系。     

山羊毛囊干细胞分离培养方法研究

分别采用组织块法和酶消化法分离培养山羊毛囊干细胞,并通过形态学观察、免疫组化染色以及克隆形成率来比较2种方法体外分离培养毛囊干细胞的效率。组织块法获得的细胞第1、3、7代K19阳性率分别为52.0%±1.62%6、8.4%±1.82%、72.0%±2.42%,integrin-β1分别为52.5%±2.12%、66.3%±1.98%、73.0%±2.16%,而消化法获得的细胞第1、3、7代K19阳性率分别为56.2%±3.12%、61.7%±1.17%、64.0%±3.02%,integrin-β1分别为56.0%±1.12%、63.0%±1.12%、68.0%±2.32%;组织块法获得的细胞第1、3、7代克隆形成率分别为18.4%±0.77%、31.3%±0.88%、44.7%±1.03%,而消化法获得细胞第1、3、7代克隆形成率为22.6%±2.30%、26.9%±0.86%、32.8%±1.05%;在同样培养条件下,组织块法获得的细胞可体外传19代,而消化法可传12代。结果表明两种方法均能分离得到毛囊干细胞并进行传代,但随着传代次数的增加,组织块法获得的细胞免疫组化染色阳性率、克隆形成率以及传代能力均显著高于酶消化法获得的细胞(P<0.01)。     

低浓度玉米赤霉烯酮对TM3细胞增殖及γH2AX焦点形成的影响

为探讨玉米赤霉烯酮(ZEA)的雄性生殖毒性及其机理,本试验研究了低质量浓度ZEA暴露对小鼠睾丸间质细胞株TM3细胞增殖及核内γH2AX荧光焦点产生的影响。以TM3细胞为材料,加入不同质量浓度的ZEA,设0,5,10,20μg/L ZEA染毒组,培养72h后,应用噻唑蓝比色法检测TM3细胞增殖活力,观察细胞周期分布及其调控蛋白Cyclin D1、CDK4表达情况,同时应用免疫荧光、蛋白免疫印迹法检测TM3细胞中γH2AX含量的变化。结果显示,染毒72h后,低质量浓度的ZEA对TM3细胞的生长具有明显的促进作用,检测细胞周期发现10μg/L ZEA染毒组G1/G0期细胞分布百分比显著下降(P<0.05),S期细胞分布百分比显著升高(P<0.05),20μg/L ZEA染毒组G1/G0期细胞分布百分比极显著下降(P<0.01),S期细胞分布百分比显著升高(P<0.05);通过免疫荧光发现,5μg/L ZEA染毒组中部分细胞开始出现1至2个荧光焦点,与对照组相比,10μg/L ZEA染毒组和20μg/L ZEA染毒组出现γH2AX荧光焦点的细胞数量明显增多,荧光焦点数呈极显著升高(P<0.01);同时通过蛋白免疫印迹法发现,ZEA能够促进γH2AX蛋白表达量的增加,对细胞周期调控相关蛋白Cyclin D1、CDK4的表达也有明显的促进作用。低质量浓度的ZEA有促进细胞增殖的作用,并可诱发TM3细胞的DNA双链断裂,呈剂量-效应关系。