优化TAIL-PCR方法克隆棉花抗逆相关转录因子编码基因

ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子属于碱性亮氨酸类蛋白,在依赖ABA的逆境信号传导途径中起重要的作用。本研究结合该类转录因子的结构特点,利用3′RACE技术和优化的TAIL-PCR技术成功获得棉花中三个该家族成员编码基因。进一步验证结果表明两步PCR成功获得基因完整的ORF、3′UTR以及部分5′UTR序列。本研究所获基因为棉花抗逆基因工程提供了候选基因源,优化后的TAIL-PCR技术为克隆棉花中目的基因提供了一种简便高效的方法。     

3个陆地棉球蛋白基因启动子的克隆与功能初步分析

为克隆陆地棉来源的种子特异性启动子,根据雷蒙德氏棉测序结果,设计针对GhαGLOA、GhβGLOA和GhβGLOB基因编码区上游约1.5 kb序列的引物,分别以陆地棉总DNA为模板克隆了3条序列。构建了含有编码区上游序列驱动GUS的表达载体,经农杆菌介导转化野生型拟南芥。转基因拟南芥种子的GUS活性荧光检测结果表明,所克隆序列具有启动子功能,其中GhαGLOA启动子的转录活性极显著高于其他2个启动子。在转基因拟南芥成体植株的多个器官中,仅可检出痕量的GUS活性,认为所克隆启动子为种子特异性启动子。     

中国转基因棉花研发应用二十年

转基因技术是指利用重组DNA原理,将优良目的基因整合到靶标生物基因组中,并使靶标生物得以表达目的性状的技术。这一技术克服了生物有性杂交的限制,使物种间基因交流的范围无限扩大,既可以从原核生物到真核生物,也可以从单细胞生物到多细胞生物,还可以从低等生物到高等生物,反之亦然。因此,这项技术自发明以来,即广泛应用于农业、林业、医学等领域,为其研究开辟了一个全新的时代。转基因植物是以农杆菌等为媒介,将来源于动物、植物或微生物等其他生物甚至人工合成的外源基因转入基因组中,使之稳定遗传并赋予其靶标性状,如抗病、抗虫、抗逆、高产、优质等的植物。以1972年构建第一个重组DNA分子为契机,1983年首次获得转基因烟草为起点,植物转基因技术在近30年的时间内发展迅猛,至今已有200多种植物已成功获得转基因株系,40多种数千例转基因植株进入田间试验。根据国际农业生物技术应用咨询服务中心（ISAAA）统计,全球转基因植物的种植面积由1996年的260万hm2已经迅速增到2014年的1.815亿hm2,累计种植面积大约比中国国土总面积还多80%。在全球转基因植物研发和应用迅猛发展的同时,中国也先后批准了7种转基因植物的生产应用,其中,抗虫棉是唯一大规模应用的转基因农作物。从1994年中国研制成功国产单价抗虫棉（GK）,以及1995年美国保铃棉进入中国至今,抗虫棉已经在中国推广应用了近20年的时间。文章介绍了这20多年来,中国科学家在抗虫、抗旱耐盐碱、抗除草剂、抗病以及纤维品质改良等性状方面所取得的转基因棉花研究进展;在农杆菌介导、基因枪轰击、花粉管通道介导、茎尖或芽尖转化、农杆菌液浸染和纳米载体花粉介导等不同转化技术上所进行的探索;同时,介绍了中国转基因植物的安全性评价状况,并从抗虫棉品种审定、发展趋势和产业化状况几个方面,介绍了转基因抗虫棉在中国的应用,最后对未来转基因棉花研究方向进行展望。     

陆地棉胞质雄性不育系与保持系线粒体基因组RFLP分析

【目的】研究棉花细胞质雄性不育（CMS）系与保持系线粒体基因组的差异,为克隆棉花CMS基因奠定基础。【方法】以atpA, atp6, atp9, ccmB, ccmC, ccmFN1, cob, coxI, coxII, coxIII, matR, nad1bc, nad2, nad4, nad5, nad6, nad7c, nad9, rpl5, rrn18等20个线粒体基因保守序列为探针,利用Southern blot方法对棉花细胞质雄性不育系、保持系线粒体基因组进行RFLP分析。【结果】发现atpA、atp9、ccmB、nad1bc、nad6、nad7c、rrn18等基因在棉花不育系和保持系间存在明显RFLP多态性,其中atpA的差异最明显。【结论】atpA是棉花CMS系和保持系线粒体基因组间的一个明显差异位点。CMS系比保持系缺失一个rrn18拷贝。     

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因植物表达载体的构建及瞬时表达

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体具有特异性诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性的特点,被认为是肿瘤凋亡疗法较有希望的候选药物。植物生物反应器在药用蛋白质生产方面具备较大优势。构建了可溶性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的植物表达载体,进行本氏烟(Nicotiana benthamiana)瞬时表达,并对目的蛋白的体外活性进行检测。结果显示,本氏烟叶片中目的蛋白平均表达量为68.60 pg/mg TSP;在浓度为200 pg/m L时,对NCI-H460细胞株的抑制率为28.75%。研究表明,经密码子优化的编码基因能够在受体植物中表达出有活性的目的蛋白,为开展目的基因的稳定转化工作奠定了基础。     

二穗短柄草BdTOR基因的克隆及功能分析

在酵母、植物、动物和人类中,TOR是一个进化保守的重要调节因子,它通过整合营养和能量信号促进细胞增殖和生长。从二穗短柄草中克隆得到全长7 401 bp的Bd TOR基因,编码2 466个氨基酸残基,预测其具有HEAT重复域、FAT域、FRB域、激酶域、FATC域等保守结构域。实时定量PCR表明Bd TOR在二穗短柄草组织器官中相对表达量由高到低依次为幼穗幼苗根叶茎;Bd TOR及其激酶域的瞬时表达表明其定位于拟南芥原生质体的细胞核和细胞质,并在细胞质中区域化分布;Bd TOR具有促进根、叶生长,增加生物量,提高生长速率的功能;过表达Bd TOR可以回补雷帕霉素对Sc FKBP12过表达株系BP12的抑制;在雷帕霉素处理下Bd TOR能够与Sc FKBP12互作。     

高效双价(Bt+cpti)表达载体的构建及其表达分析

以已有的中间载体和表达载体为基础,对Bt、cpti基因进行了修饰。在cpti基因的5′端增加了大豆胰蛋白酶抑制剂SKTI信号肽序列,在3′端增加了内质网滞留信号肽KDEL序列,然后在Bt基因的5′端增加了叶绿体靶向肽序列,构建了带有信号肽的双价表达载体PGBIC(K).B.4A和不含信号肽的对照载体PGBIC.B.4A。通过农杆菌介导的喷花法转化陆地棉Y18,Southern杂交结果显示,外源基因已经整合到了受体植物基因组中;ELISA结果显示,所获得的5株阳性株蛋白表达量分别提高了1~8倍不等。在杀虫实验中,修饰的双价载体的转基因植株1/4-1由于蛋白表达量的积累而显示了较高的棉铃虫抗性。为获得更高抗性的双价转基因抗虫棉提供了一种新的方法,并为基因工程中提高外源蛋白积累量的研究。     

玉米单倍体诱导系Stock 6的改良研究

本试验采用3组完全随机设计,对Stock 6及其7个改良系的单倍体诱导率进行研究,探索五大种质类群和5种不同杂交模式的选系基础材料对诱导率的影响。结果表明:GS 13的诱导率最高,GS 37次之,诱导率显著高于Stock 6,是改良成功的诱导系,在玉米DH育种中具有很高的利用价值。在五大种质类群中,Reid群的单倍体发生率显著高于其它类群;在5种杂交模式的基础选系材料中塘四平头×塘四平头模式的单倍体发生率最高。在玉米DH育种中,应选择遗传基础适宜的材料进行杂交诱导选系。     

多启动子驱动苘麻epsps优化基因植物表达载体的构建及其转化

转基因抗草甘膦作物是商业化最广泛的转基因作物之一,但是棉花的雄蕊对草甘膦敏感,在四叶期后喷施草甘膦会造成抗草甘膦棉花雄性败育,不能正常授粉,最终导致产量降低。为降低草甘膦对棉花育性的不良影响,有针对性的构建了棉花生殖器官优势表达的arf1启动子、棉花草甘膦高效诱导表达的ag2启动子和组成型启动子CaMV35S驱动苘麻epsps优化基因的串联三表达盒植物表达载体,采用农杆菌喷花法将其转入棉花,对T0代喷施草甘膦筛选获得8株对草甘膦有较强抗性并且生殖发育正常的植株;PCR和RT PCR分析表明外源基因已整合至棉花基因组并正确表达。为探索用不同类型启动子驱动相同基因以扩大外源基因在植物中的表达范围和培育具有自主知识产权的抗草甘膦转基因棉花打下基础。     

牧草表观遗传学研究进展

表观遗传是指在DNA序列不变的情况下基因表达发生变化的现象。表观遗传现象与外界环境条件的变化紧密相关,它参与植物的生长发育、胁迫响应、衰老死亡等重要生命过程并在其中起到了关键作用。表观遗传学作为一门新兴学科在近20年间得到了快速发展,成为当前动植物和医学领域的研究热点。目前植物表观遗传学的相关研究主要集中在DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA甲基化、染色质重塑和非编码RNA修饰等方面,并取得了许多重要成果。然而,相对于模式植物拟南芥和其他主要作物而言,牧草的表观遗传学研究仍处于起步阶段。因此,开展牧草表观遗传学研究对我国草牧业的可持续发展具有重要意义。本研究对表观遗传学的概念、研究方法、研究内容(包括DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA甲基化、染色质重塑和非编码RNA修饰等)及牧草表观遗传学相关研究进行了全面总结和综述,并对表观遗传在草牧业中的发展前景进行了展望。