玉米PLATZ基因GRMZM2G006585启动子的克隆及表达分析

高转录活性籽粒特异性启动子可调控目的基因在植物籽粒中特异性、高水平表达。为发掘玉米籽粒特异性启动子，以公开发表的玉米表达谱芯片数据为切入点，筛选出籽粒优势表达基因GRMZM2G006585,克隆其编码区上游约2 000 bp的DNA序列，命名为PZm2G006585。利用在线网站New PLACE和PlantCARE对其进行启动子顺式作用元件分析，发现其含有E-box、P-box等多个籽粒特异性相关元件，初步认为所克隆编码区上游序列为玉米来源的籽粒特异性启动子。为验证其功能，构建该启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的表达载体并进行植物遗传转化。转基因水稻的GUS组织化学染色结果表明，该启动子驱动外源基因表达模式为籽粒特异、胚优势表达；转基因拟南芥单拷贝株系T₃种子中GUS活性检测结果显示，PZm2G006585驱动的GUS活性为909.52 nmol/(min·mg)。籽粒特异性启动子PZm2G006585的发掘和功能验证为驱动目标基因在玉米、水稻等单子叶植物籽粒中特异性表达提供了候选启动子资源。     

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。     

棉花种子特异表达的LEA启动子克隆及功能验证

以棉花品种新陆早33号为材料,克隆获得其胚胎发育晚期丰富蛋白LEA基因的种子特异性启动子。启动子序列全长为1228bp;作用元件分析表明该区域除了具有启动子核心调控序列外,还含有多个与组织特异性、激素、逆境等表达相关的顺式作用元件,如E-box、ABRE元件、A-box等。与已报道的棉花品种Coker 201的LEA基因D34的5'端上游调控序列1212bp相比,两者具有97%的一致性。拟南芥遗传转化的功能分析结果表明,所克隆的序列能驱动GUS基因在种子中特异表达,且GUS主要在转基因植物的种子发育后期表达;其表达强度要弱于组成型的CaMV35S启动子。研究结果不仅有助于进一步深入认识棉花LEA基因功能及其表达调控规律,也为植物遗传转化提供组织特异性的启动子。     

棉花种子特异表达α球蛋白A基因启动子的功能分析

研究植物种子特异启动子具有重要的理论和实际意义。本文研究了棉花α球蛋白A基因启动子,该启动子序列全长为1640 bp,作用元件分析表明该区域除了具有核心调控序列外,还含有多个与组织特异性相关的顺式作用元件。设计其5'端构建4个不同长度的缺失、融合GUS基因的表达载体,并通过蘸花法分别转化拟南芥。转基因拟南芥GUS表达分析结果表明,该启动子能驱动GUS基因在胚、露白的种子、子叶期的幼苗中表达,而二叶期的幼苗、根、茎、莲座叶、茎生叶和花苞组织则没有表达,说明棉花α球蛋白A基因启动子是一个种子特异性启动子。208 bp长度的启动子足以维持其种子特异表达功能,而且在启动子的-684和-208区域之间可能存在负调控元件或负调控区域。分析棉花α球蛋白A基因启动子是一个种子特异性启动子,其基本启动子区域不长于208 bp。     

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14启动子克隆与功能分析

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14受低磷诱导表达,其超表达显著提高植物有机磷利用效率,为进一步探究其调控机制,本研究以GmPAP14cDNA序列检索大豆参考基因组,获取基因上游启动子序列,设计引物克隆了中黄15 GmPAP14启动子序列。利用PLACE与PlantCARE预测启动子调控元件发现,该序列中含有增强子调控元件、组织特异表达元件,根特异表达元件、转录因子PHR1结合的PIBS元件等。构建了GmPAP14启动子3个5’端缺失片段融合GUS的植物表达载体PGmPAP14-2568-GUS、PGmPAP14-2238-GUS、PGmPAP14-1635-GUS,并通过Floraldip法获得转基因拟南芥。利用GUS染色和活性测定分析GmPAP14启动子不同片段表达活性发现,正常磷条件下各片段转基因拟南芥均在根尖表达,低磷条件下GUS染色可扩展到成熟区和根毛,另外转PGmPAP14-2238-GUS植株的GUS活性最高。这些结果为后续的基因调控研究奠定重要基础。     

大豆二酰甘油酰基转移酶基因GmDGAT1A启动子的克隆与功能分析

二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是催化三酰甘油生物合成的关键酶,在三酰甘油的合成和积累过程中具有重要调控作用。为了研究大豆DGAT基因表达调控的分子机制,以大豆品种科丰1号为材料,通过PCR方法对GmDGAT1A的启动子(promoter-GmDGAT1A,pGmDGATIA)进行克隆,并通过转化拟南芥和GUS组织定位研究其功能。结果表明:以大豆叶片DNA为模板,成功克隆到GmDGAT1A基因ATG上游2 192 bp启动子序列。序列分析表明,pGmDGAT1A除具有启动子所必需的TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有多个响应于光、赤霉素和脱落酸等顺式作用元件。以GUS为报告基因,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A,并转化野生型拟南芥获得转基因植株。对转基因拟南芥植株进行PCR检测,能扩增到2 192 bp目标条带,表明已获得含有pGmDGAT1A的转基因拟南芥阳性植株。GUS组织化学染色结果显示,转基因拟南芥幼苗的叶脉和根染色较深,但是主根和侧根的根尖部分未染色;成熟期转基因拟南芥植株的根、叶脉以及角果内的隔膜和珠柄染色较深,茎和发育的种子未染色,表明pGmDGAT1A驱动的GUS主要在转基因拟南芥的根、叶脉以及角果内的隔膜和珠柄中表达。综上,克隆的大豆GmDGAT1A启动子具有活性,能够驱动下游目标基因的表达,有望应用于转基因育种。     

大豆球蛋白G1启动子的克隆及表达活性分析

利用PCR的方法从大豆品种"吉豆2号"基因组DNA中克隆得到大豆球蛋白启动子G1p,长度约为686 bp,PLACE在线启动子预测工具分析表明:序列中含有多种典型的种子特异性表达元件。将克隆得到的G1p取代pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子,构建于G1p与GUS基因融合表达的载体pCAM-G1p,通过农杆菌介导的方法在大豆根、茎、叶和种子中进行瞬时表达分析结果显示,仅能在种子中检测到GUS活性,而在根、茎和叶其他组织中基本检测不到GUS活性。说明G1基因上游686 bp片段具有种子特异性启动子的功能,G1p是一个比较高效的种子特异性启动子。     

大豆CHI1基因启动子的克隆及功能初探

为了解大豆ClassⅠ几丁酶基因(Chitinase gene)对不同胁迫响应的分子机制。利用PCR技术克隆了大豆ClassⅠChitinase基因的启动子片段(Gm CHI1p),序列分析表明,扩增片段(1 641 bp)与Gen Bank中的已知序列同源性达99.8%,且含有多个胁迫响应调控元件。利用GUS基因上游无启动子的表达载体p CAMBIA1391Z,构建GmCHI1p与GUS基因融合的植物表达载体pCAM-Gm CHI1p,并通过农杆菌介导法导入烟草中。在转基因烟草愈伤组织中检测到GUS活性,表明该启动子具有启动活性。对转基因烟草中的GUS活性进行初步定性分析,结果表明,GmCHI1p可驱动GUS基因在转基因烟草的根部特异性表达,而且在伤害处理的叶片中检测到GUS的强烈表达,表现出明显的根组织特异性及伤害诱导性。这种伤害诱导仅在伤害组织部位及其附近高效表达而没有被长距离传递,预计该启动子在转基因抗虫分子育种中具有巨大的应用前景。     

蓝莓VcMYB启动子克隆及其功能初步分析

为探究VcMYB启动子在转录过程中如何发挥调控作用,利用FPNI-PCR法从蓝莓中克隆到调控原花青素合成相关的转录因子VcMYB的768 bp启动子序列。用PLACE和Plant CARE在线启动子预测工具分析了该启动子,结果表明其序列中存在启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box,还包含一系列的响应元件,如光响应元件、低温响应元件、防御与胁迫响应元件和茉莉酸甲酯响应元件等。为进一步分析该启动子的功能,构建了该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体VcMYBpro::GUS,并用农杆菌转化拟南芥。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色分析,结果表明该VcMYB启动子能驱动GUS基因在转基因拟南芥中表达,并且经脱落酸(ABA)、4℃低温、LED光照和持续光照处理后,转基因拟南芥中GUS的表达活性增强,推测该基因受ABA、低温和光的调控。     

白菜型油菜PABP5基因启动子的克隆及表达特性分析

本研究中利用基因组步移法从白菜型油菜中克隆到Poly(A)结合蛋白基因PABP5起始密码子上游长588 bp的一段序列,经软件分析预测表明,该序列具有典型的启动子结构,并且具有多个与花药特异性表达相关的顺式作用元件,如TATA box,CAAT box,AGAAA motif,AGGTCA motif,AAACCCTAA motif,GTGA motif等.为了研究该片段的表达特性,本文将克隆到的序列置换pPBI121中的CaMV35S启动子,驱动其下游的GUS基因,构建了植物表达载体,转化拟南芥,获得了转基因植株.组织化学染色表明,在PABP5启动子Ppabp5的驱动下,报告基因GUS在拟南芥的根尖、第一片真叶叶原基以及花药中特异表达.本研究为PABP5基因的进一步功能研究奠定了基础.     

棉花SUPERMAN类锌指蛋白基因GZFP的启动子及功能分析

GZFP是来源于陆地棉的一个SUPERMAN类锌指蛋白基因.为了进一步了解该基因功能,本研究通过染色体步移(Genome walking)获得其启动子区域,并构建该片段与GUS连接的重组载体pBI-pGZFP-5::GUS,通过花浸染法转化拟南芥.转基因植株的GUS染色结果表明GUS基因主要在根部以及花器官表达,而叶片...     

一个棉花纤维伸长期优势表达启动子pGhFLA1的克隆与鉴定

棉花纤维是研究单细胞生长发育的良好模式细胞,寻找在棉花纤维发育时期优势表达的启动子,对于棉花纤维发育的功能基因组研究非常重要。本试验对发掘到的一个在纤维伸长期优势表达基因GhFLA1的启动子进行克隆,并将该启动子融合GUS转化棉花和烟草。转基因棉花的GUS蛋白染色表明,在0~20 DPA(days post anthesis)的纤维中检测到GUS蛋白,同时在柱头、雄蕊、萼片、胚根、子叶和根中也检测到GUS蛋白,但在花瓣、叶片和苞叶中没有检测到。同时GUS定量检测结果显示,pGhFLA1驱动GUS蛋白积累的高峰是在20 DPA的纤维中,其驱动GUS表达的能力是Ca MV 35S::GUS的22倍。转基因烟草组织化学染色显示pGhFLA1可以驱动GUS在叶片及叶片的表皮毛中优势表达,同时在子房、柱头、花药、苞叶、花柄基部、花瓣、种子等生殖器官上也存在GUS蛋白。启动子pGhFLA1在棉花纤维和烟草叶片的表皮毛中优势表达,可用于棉花纤维功能基因组研究,在改良纤维品质育种中具有潜在的应用价值。     

棉花器官特异病原相关启动子的克隆与分析

通过Tail PCR分离了GHNBS基因的5'侧翼序列,PLACE分析表明其含有CAAT-box、TATA-box及乙烯、茉莉酸甲酯、脱落酸应答元件,病原菌诱发子反应元件W boxes、GT-1、MYB、MYBST1和MYB1LEPR等。同时,在这段序列上还存在一些根特异表达元件。包括2个as-1和1个EECCRCAH1在内的3个增强子元件也存在于这段序列的上游区域,它们可能增强GUS基因在转基因植物中的表达。将GHNBS基因的5′调控序列以不同缺失与GUS基因融合转化拟南芥,发现GUS基因主要在根、茎的韧皮部和叶脉中表达。PGN-1559和PGN-1117表现为器官特异性表达。而PGN-476不能特异表达,同时也不能在根部表达。SA,ABA,MeJA,Eth-ylene,枯萎病菌和细菌DC3000处理后GUS活性均有显著上升,说明GHNBS基因的5′调控序列含有相应的应答反应因子,是一个器官特异以及与病原相关的启动子。     

不同截短U3启动子在棉花中的功能分析

从海岛棉中克隆了2种GbU3-2P、GbU3-3P启动子,对它们进行2种长度截短,长度分别为436、245 bp和384、233 bp,同时构建了4个相应启动子驱动GUS的融合植物表达载体。利用农杆菌真空渗透转化法将4个GbU3Ps∷GUS-sg RNA-P1300植物表达载体分别转染棉花胚性愈伤组织。经GUS组织化学染色显示:克隆得到的2种截短大小的GbU3-2P和GbU3-3P启动子均能驱动GUS基因在棉花愈伤组织中表达,棉花愈伤组织被染成蓝色,但颜色深浅没有显著差异。本研究表明,同一GbU3启动子截短后,较短的启动子和较长的启动子具有相同的转录活性。这为构建棉花CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统提供了更多理想的启动子。     

棉花GhMADS29启动子克隆及表达分析

以实验室克隆的GhMADS29(GeneBank登录号:JQ682642)基因的cDNA序列Blast搜索雷蒙德氏棉的基因组序列,根据Blast结果设计引物,克隆到起始密码子上游-19位开始的1316 bp的序列;利用PlantCARE启动子在线分析软件预测其含有核心启动子元件TATA-box和CAAT-box,并含有光、温、赤霉素、水杨酸、生长素等的响应元件.通过替换pBI121载体上的CaMV35S启动子构建了GhMADS29启动子与GUS基因的融合表达载体并转化拟南芥,组织化学染色分析发现其在14d幼苗的根和叶中都有表达,在萼片、花瓣、雌蕊、果瓣中也表达,而在雄蕊和种子中不表达.综上所述,我们推测GhMADS29可能与各种开花途径有关,与萼片、花瓣、雌蕊等花器官的发育有关,还可能与果实是否开裂有关.     

中棉(Gossypium arboreum)光锈导基因Gacab启动子在转基因烟草中的功能缺失分析

分离了金华中棉(Gossypiun arboreum var. jinhua)光诱导基因cab 5'上游的调控序列1 009 bp,并对其功能进行了分析,证明获得的这一DNA片段具有驱动光诱导表达的功能。为了进一步分离具有最大转录活性的最小光诱导启动子,根据光诱导表达调控元件所在的位置,构建了Gacab P和197 bp、504 bp、779 bp的5'端缺失体,并将这些缺失体分别与gus (uid A)基因融合,构建植物表达载体。用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草。GUS组织化学分析表明,转基因烟草的T1代种子在光下培养时,只有Gacab P驱动gus基因在转基因烟草的叶片表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达;当转基因烟草的T1代种子在暗中萌发及培养时,Gacab P驱动gus基因在转基因烟草中无表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达。GUS定量分析表明,–504 ~ –1 bp的启动子缺失体启动活性最高,比CaMV35S启动子高0.6倍。上述结果表明只有全长的Gacab启动子具有光诱导和绿色组织特异表达特性,且–504 ~ –1 bp的启动子缺失体启动活性最高。     

柽柳GRAS转录因子基因启动子克隆和表达分析

克隆获得柽柳GRAS 转录因子基因启动子序列,并对其表达模式进行分析,从而初步探究GRAS转录因子基因的表达特征和功能。CTAB法提取刚毛柽柳基因组DNA,按照Genome Walking Kit 说明克隆GRAS 转录因子基因启动子序列,将克隆获得的GRAS 转录因子基因启动子序列定向替换pCAMB1301 载体上的35S启动子序列,构建融合表达载体,以驱动GUS 基因表达,瞬时侵染拟南芥后进行GUS 基因的染色。成功克隆获得刚毛柽柳936 bp 的GRAS 转录因子基因启动子序列。PLACE 和PlantCARE 数据库分析结果表明该启动子不仅包含启动子区的核心元件CAAT-box 和TATA-box,还含有多个与逆境应答有关的顺式调控元件。成功将GRAS 基因启动子序列定向置换pCAMBIA1301 的35S 启动子,构建重组载体PGRAS::GUS。瞬时转化拟南芥后GUS 染色,结果显示转基因拟南芥叶片被染色而根部着色较浅。初步表明克隆获得的GRAS 基因启动子具有启动子表达活性,其可能参与了柽柳的抗逆应答,为进一步分析该基因的抗逆功能和抗逆机制奠定了基础。     

Tissue-specificity of maize sucrose synthase gene promoters in maize tissues after particle bombardment

The reporter gene encoding β-glucuronidase (GUS) driven by either of the two maize sucrose synthase gene (Sh1 and Sus 1) promoters was introduced and expressed in various maize tissues via particle bombardment. Transient gene expression was examined by histochemical assays. It was found that the two SS promoters directed differential GUS expression. In the developing kernel, the Sh1 promoter was active only in the upper and central parts of the endosperm. In contrast, strong GUS activity controlled by the Sus1 promoter was detected in various types of cells, including the aleurone cells, the subaleurone endosperm cells, the scutellar cells of the embryo and the pericarp cells. Both promoters showed similar expression patterns in vegetative tissues. This revised version was published online in August 2006 with corrections to the Cover Date.