棉花SSR多重PCR技术的初步研究和利用

简单重复序列(simple sequences repeat,SSR)具有数量丰富、高度多态、共显性等优点,是一种极具实用价值的标记,目前已成为研究种质资源遗传多样性、基因组作图的首选标记.SSR多重PCR扩增法可同时完成多个标记检测,具有高效、经济、快捷的特点,并保持了单一SSR引物扩增的高度敏感性和准确性.本文选取6对SSR引物,配成三组SSR两重PCR反应,并设置五种不同反应体系以探索PCR反应体系对其影响,以单一引物PCR扩增为对照,对用于构建亚洲棉(Gossypium arboreum)遗传图谱所用的亲本、F1及F2群体单株的DNA模板进行多重PCR探索、分析;另外,在扩增产物的电泳检测时,结合银染技术,试验了单一引物PCR扩增产物在同一泳道同时上样和先后分时上样的两重检测的方法,以期对这种方法进行多态性位点检测的效果进行评价.结果表明,即使采用与单一引物PCR相同的反应体系,两重PCR扩增也可获得与之相同的多态性产物;而两重检测法的结果亦显示出与相应的单引物检测到的相应的多态性位点,能准确反映单引物所能达到的检测效果,因而为SSR的多重PCR和扩增后多重检测的技术在高效的遗传图谱构建工作中进一步应用提供实验依据.     

陆地棉开放花蕾品系E-81的遗传鉴定

从 90年代开始 ,我国先后从海岛棉 ( Gossypi-um barbadense L.)与陆地棉 ( G.hirsutum L.)杂种后代中发现了开放花蕾变异株 ,并开展了用于杂交种种子生产的研究。遗传学研究证明这些品系的开放花蕾性状受 1对隐性基因所控制 (肖杰华 1 991 ;张天真 1 992 ;纪家华等 1 992 ) ,它们的产生是由于具有不同的单节显性基因的海岛棉和陆地棉杂交后 ,由于基因重组所产生的 (张天真1 992 )。湖南省棉花研究所把隐性无腺体基因gl2 gl3 导入到开放花蕾品系 ,培育出无腺体指示性状标记的开放花蕾品系 E- 81用于制种 (李育强等 1 996 ) ,而 E- 81品系…     

棉纤维发育相关基因时空表达与纤维品质的关联分析

以14个纤维品质差异的棉花品种(或品系)为材料,研究10个纤维发育相关基因时空表达变化与纤维品质的关系,为阐明棉纤维发育相关基因与纤维品质形成关系提供理论基础。利用实时荧光定量PCR技术检测10个基因在14个供试品种(或品系)不同纤维发育时期的相对表达量,结果表明,虽然遗传背景完全不同,但它们具有某些共同表达特征。GhExp1、GhCIPK1、GhSus1、GhSusA1和GhPL这5个基因都是在纤维伸长期优势表达;GhACT1、GhRacA和GhRacB是在纤维伸长前期和次生壁加厚期高表达;而GhCelA1和GhcelA3是在纤维伸长后期和次生壁加厚期优势表达。这些基因表达谱与纤维品质关联分析显示,GhRacA在23DPA高表达且表达量与纤维品质显著正相关,其余基因在低表达时其表达量与纤维品质呈显著性相关,而在高表达时其表达量与纤维品质无相关性。GhExp1在20DPA的表达量与纤维比强度和整齐度呈显著负相关,与伸长率呈极显著正相关;GhPL在23DPA的表达量与纤维长度呈显著负相关;GhRacA在5DPA和23DPA的表达量均与伸长率呈极显著正相关;GhRacB在10DPA的表达量与长度和整齐度呈显著负相关;GhCelA1基因在5DPA的表达量与纤维长度呈显著正相关,与马克隆值呈显著负相关,在10DPA的表达量与马克隆值呈显著正相关,与伸长率达到极显著正相关,与比强度呈显著负相关,与长度和整齐度呈极显著负相关;GhCIPK1、GhACT1、GhSus1、GhSusA1和GhCelA3 这5个基因在纤维发育各时期的表达量与纤维品质各指标未检测到相关性。     

陆地棉抗黄萎病、纤维品质和产量等农艺性状的QTL定位

用一个高抗黄萎病的陆地棉品系5026和一个高感黄萎病的陆地棉品种李8为材料,构建一个RIL群体.用5 300对SSR引物筛选亲本多态,获得115个多态位点并进行标记间连锁分析,构建了一张包括20个连锁群全长560.1 cM的陆地棉品种间分子标记遗传图谱.RIL家系分两份:一份种于病圃,在苗期和成株期分别考查各家系的发病情况;一份种于大田,调查各家系的产量和纤维品质相关性状.用复合区间作图法对抗病、产量和纤维品质等性状进行QTL定位:在苗期检测到了3个抗病QTL,成株期检测到了1个抗病QTL,解释的变异系数范围是7.4%～11.8%;检测到2个纤维长度、2个纤维强度、1个纤维细度、1个整齐度、1个短纤维指数和2个纤维伸长率等9个与纤维品质相关性状的QTL,解释的变异范围是6.7%～15.7%;检测到了2个皮棉产量、1个籽棉产量、2个单株果枝数、1个单株铃数、2个铃重、1个籽指、1个衣分和1个衣指等11个产量构成因素的QTL,解释的变异方差范围是4.1%～10.6%,这些结果为棉花抗病育种同时兼顾产量和品质育种提供了非常有用的信息.     

转Bt+Sck基因双价抗虫棉的抗虫性及遗传分析

对通过花粉管通道注射获得的转Bt Sck双价基因抗虫棉纯系312-5T2和332-2T2进行了生物抗虫性测定,转基因纯系对棉铃虫的抗性显著高于非抗虫对照苏棉16和抗虫对照品种sGK321,与抗虫对照R19抗虫性相当.遗传分析表明,转Bt Sck双价基因抗虫棉的抗性基因符合一对显性基因的分离规律.对转Bt Sck双价基因抗虫棉与R19及sGK321的杂交F1进行了抗虫性测定,所有的F1植株都表现出与转Bt Sck基因纯系亲本一致的抗虫性.转Bt Sck双价基因抗虫棉纯系312-5T2和332-2T2等位性测验证明:312-5T2与R19、sGK321的抗虫基因整合位点不连锁,表现为15∶1的自由组合比例;而332-2T2与R19中抗虫基因的整合位点表现连锁,与sGK321的抗虫基因表现自由组合.这为培育新的双价抗虫棉品种(系)提供了优良的育种材料.     

陆地棉三体的诱发,鉴定,研究和利用：IV.第19染色体三体的发现及鉴定

本文首次报道了一个新的陆地棉三体（Ｆｔｒ－６）的发现，并对其形态，减数分裂中期Ｉ染色体构型进行了研究，同时，通过其与一套易位系杂交Ｆ１花粉母期细胞染色体构型的细胞学检测，证明Ｆｔｒ－６可能是第１９染色体的三体。     

花粉管通道法转基因抗虫棉外源基因的整合方式

对花粉管通道法培育的转Bt基因抗虫棉GK19、GK22、1016、1018、1022、1025、GK5、GKsu12和SGK1进行Southern杂交分析。结果表明,目的基因能够完整整合到基因组里,HindⅢ酶切位点有可能发生甲基化或丢失。除1018以外的上述8个抗虫棉的分析结果还表明,载体骨架没有整合到棉花基因组中。     

用于区别不同棉花品种基因组特征的微卫星位点筛选

保守性强、重复性好、多态性高的微卫星位点可被有效用于构建作物DNA条形码。选取目前生产上主要推广种植、代表不同来源系统的12个棉花品种作为微卫星位点筛选材料,参考我室构建的四倍体栽培棉种种间高密度遗传图谱信息,从376对覆盖全基因组的SSR引物中,筛选出51对引物可扩增出带型清晰且多态性高的微卫星位点。这些引物在12个供试品种中共产生155个等位位点,每对引物揭示的等位基因位点在2~7之间,平均值为3.04。参照微卫星位点的染色体定位和多态信息,在每条染色体上选择一个多态性相对高的SSR位点,其相应的26对SSR引物被推荐为构建棉花品种DNA条形码的一套首选引物,并初步应用于12个品种的DNA条形码编制。其余25对引物作为候选引物。使用该套引物扩增出的微卫星位点可用于大量棉花品种DNA条形码构建,为棉花品种真实性和纯度的分子鉴定奠定基础。     

棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立

以棉花幼嫩子叶为外植体材料,分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素,以棉花叶肉原生质体为受体,建立稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。技术体系包括,选择自然生长12 d的棉花幼嫩子叶为外植体材料,混合1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol L^–1甘露醇、20 mmol L^–1 KCl、20 mmol L^–1 MES、0.1 mol L^–1 CaCl₂和1.0 g L^–1 BSA等酶液,在28℃黑暗条件下振荡酶解8 h,可游离出浓度达1.0×10⁶ m L^–1以上的纯净棉花叶肉原生质体。利用该方法将棉花锌指蛋白基因GhZFP2整合到pJIT166-GFP质粒载体,构建了GhZFP2:GFP融合载体,采用40% PEG(4000)介导转化,获得高转化率的棉花叶肉原生质体。对目标基因瞬时表达产物检测表明,GhZFP2蛋白清晰定位在细胞核上。     

陆地棉背景下海岛棉第18染色体片段置换系的培育及相关农艺性状QTL定位

Sub18是以陆地棉遗传标准系TM-1为背景, 含海岛棉3-79第18染色体的置换系材料。本研究以TM-1为受体亲本, 置换系Sub18为供体亲本, 借助分子标记辅助选择技术培育了一套以TM-1为背景, 含海岛棉3-79第18染色体不同长度片段的置换系。这套置换系由45个株系构成, 共78个置换片段。其中27个株系导入单片段, 占总株系的60%; 9个株系导入2个片段, 占20%; 9个株系导入3个及以上片段, 占20%。导入片段总长度为467.6 cM, 约为该染色体遗传长度的4倍, 每个株系内被替换的染色体片段长度不完全相同, 平均遗传长度为5.99 cM, 最短的为0.9 cM, 最长的20.35 cM。其中13个株系表现开放花蕾性状, 涉及的最短导入片段长5.05 cM。对TM-1、Sub18以及培育的45个导入系进行农艺性状调查和QTL联合定位分析, 鉴定出纤维强度(qFS-C18-1)、整齐度(qFU-C18-1)、马克隆值(qFMi-C18-1)、成熟度(qFMa-C18-1)、皮棉重(qLW-C18-1)、籽指 (qSI-C18-1)和衣分 (qLP-C18-1) 7个加性QTL和5个上位性效应QTL。研究结果为进一步精细定位目标QTL、克隆QTL以及重要性状分子设计育种奠定了基础。