抗猪γ-干扰素单克隆抗体的制备和鉴定

将在大肠埃希氏菌中表达的重组猪γ-干扰素（rpIFN-γ）免疫8周龄BALB／c鼠3次后，取脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞按标准程序融合后，以间接ELISA和有限稀释法进行筛选，获得1株能稳定分泌抗猪IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该株单克隆抗体命名为B11株。经Western blot分析和间接ELISA检测，B11株能与商品化猪IFN-γ标准品产生特异性反应。间接免疫荧光检测显示B11株能与经PMA刺激的猪外周血单个核细胞产生特异性荧光。抗体亚型鉴定结果表明，B11株为IgG1型，且轻链为κ链。     

禽类IFN-γmRNA表达量检测方法的初步建立

为了建立检测IFN-γmRNA表达量的方法，设计2对用于IFN-γ和1对用于β-actin基因扩增的引物，建立可用于IFN-γmRNA表达量检测的技术。结果表明：用RT-PCR技术检测5组免疫鸡和1组对照鸡外周血单个核细胞发现，全病毒和含有全病毒的疫苗比单一肽段进行免疫IFN-γmRNA表达量要大的多，但与对照组没有明显差异。     

松辽黑猪、大白猪免疫指标和生产性能的比较研究

以松辽黑猪和大白猪为研究对象,在70日龄时采集血液测定白细胞总数、血清IgG、IL-12、IFN-γ含量及中性粒细胞NBT还原力等免疫指标,并测定了猪初生重、断奶重、下网重及180日龄重、180日龄背膘厚、眼肌面积等生产性能指标。结果表明,白细胞总数、中性粒细胞NBT还原力、外周血单个核细胞培养上清IL-12含量和单个核细胞培养上清IFN-γ含量在松辽黑猪和大白猪间差异不显著（P＞0.05）;松辽黑猪血清IgG含量显著高于大白猪（P＜0.05）,IL-12和IFN-γ含量极显著高于大白猪（P＜0.01）;松辽黑猪和大白猪初生重、断奶重、下网重、180日龄背膘厚差异不显著（P＞0.05）,大白猪180日龄体重极显著高于松辽黑猪（P＜0.01）。本试验结果为揭示中外猪种抗病力差异的免疫学机理提供了参考资料。     

黄芪多糖对PCV2阳性猪外周血免疫细胞及相关细胞因子的影响

检测外周血T淋巴细胞、嗜中性粒细胞、CD4+、CD8+细胞百分数及IL-2、IL-4和IFN-γ含量的变化,研究黄芪多糖(APS)对PCV2阳性猪免疫功能的调节作用。结果显示,APS能显著增加外周血T淋巴细胞、NBT阳性细胞、CD4+T细胞百分数及IL-2、IL-4、IFN-γ含量,显著降低CD8+T细胞百分数,推测APS通过上调CD4+细胞百分数、CD4+/CD8+及Th1反应恢复正常免疫机能。     

猪γ干扰素的体外表达及其多克隆抗血清的制备

从健康仔猪前腔静脉无菌采血,分离外周血单个核细胞,提取细胞总RNA,用猪γ干扰素(IFN-γ)基因特异性引物通过RT-PCR扩增猪IFN-γ的全长cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体中,再亚克隆到pUC18和表达载体pET-30a中,经测序发现其序列与GenBank报道的IFN-γ基因序列基本一致.将重组质粒pET-30a-IFN-γ转化大肠杆菌BL21,于37℃经IPTG诱导表达,IFN-γ基因获得表达,表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的39%.经SDS-PAGE及Westernblot分析表明,表达的融合蛋白分子量约为25 ku.将包涵体用8 mol/L脲变性,用ProBondTM Purification Systerm纯化,经透析复性,得到纯化的目的蛋白,含量可达0.3 mg/mL.将复性蛋白免疫新西兰白兔三次,制备了高滴度的猪IFN-γ抗血清.本实验表达和纯化了猪IFN-γ,并制备兔抗猪IFN-γ的抗血清,为下一阶段关于猪γ干扰素重组蛋白其应用奠定了基础.     

复合益生素对仔猪免疫功能的影响

为了解复合益生素(嗜酸乳杆菌+干酵母)对仔猪免疫功能的影响。选取60头日龄相同、体重相近的初产仔猪,分为复合益生素组(基础日粮+0.2 g/kg干酵母+0.4 g/kg嗜酸乳杆菌液)、嗜酸乳杆菌组(基础日粮+0.4 g/kg嗜酸乳杆菌液)、鱼肝油乳组(基础日粮+10 mL/kg鱼肝油乳)、基础对照组(基础日粮)4组,15头/组,用ELISA试剂盒检测不同日龄、不同组别仔猪外周血总IgG、IL-2、IL-5和IFN-γ的含量变化。结果显示,从15~55日龄添加复合益生素增加总IgG、IL-2、IL-5和IFN-γ的量分别为102.76％、62.63％、53.71％和33.45％,明显高于其它组。可见,复合益生素能够更好的增强仔猪的免疫功能。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4-F112株)诱导特异性IFN-γ~+T细胞反应的研究

为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)活疫苗(HuN4-F112株)诱导的特异性IFN-γ+T细胞反应与其保护作用的相关性,本研究将25头45日龄PRRSV阴性健康仔猪随机均分为5组,第1～3组分别于0 d、7 d、14 d免疫HuN4-F112疫苗(1头份/头,106.0TCID50),第4组为攻毒对照组,第1～4组于21 d用PRRSV强毒株HuN4-F5攻毒(3 mL/头,104.0TCID50),第5组为空白对照组。疫苗免疫后1周～2周产生部分保护,3周产生完全保护,第1～4组保护率分别为5/5、2/5、2/5和0/5。中和抗体检测显示免疫组免疫后7 d和14 d所有猪只均未检测到中和抗体,免疫后第21 d第1组4头猪检测到低效价(≤1∶8)的中和抗体。疫苗免疫后血清中IFN-γ含量略有升高,但变化不大,整体都处于较低的水平。采用酶联免疫斑点技术(ELISpot)检测PRRSV特异性IFN-γ+T细胞反应。免疫组免疫后7 d、14 d、21 d百万外周血单个核细胞中IFN-γ+T细胞频数分别为0±0、0±2、5±8,组间和组内统计分析显示差异不显著。结果表明在HuN4-F112株疫苗早期保护中,IFN-γ参与的特异性细胞免疫反应较弱,在早期免疫阶段难以发挥主要作用。本研究为了解PRRSV疫苗免疫保护机制提供参考,同时,也提示需要采用更多的指标和方法来评价该疫苗诱导的免疫反应。     

猪IL-2、IL-12p40和IFN-γ SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法的建立

针对猪Th1型细胞因子IL-2、IL-12p40、IFN-γ以及管家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IL-2、IL-12p40、IFN-γ及β-actin的SYBR Green Ⅰ real-ti mePCR方法。该方法线性关系好,标准曲线的相关系数均达到0.997以上;敏感性高,初始模板的检出下限均达到100拷贝/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3.5%。应用所建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染仔猪外周血单个核细胞中IL-2、IL-12p40和IFN-γ mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,所建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好。     

缙云麻鸭与绍兴鸭免疫器官与细胞免疫功能比较研究

选用1日龄健康绍兴鸭和缙云麻鸭公雏各50只,分别于10日龄和70日龄各任选8只检测胸腺、脾脏、法氏囊重量和指数、血清细胞因子（IL-2,IFN-γ）水平、外周血淋巴细胞ANAE阳性率与淋巴细胞转化率等指标。试验结果表明：①缙云麻鸭在10日龄时的免疫器官重量和指数以及10日龄和70日龄时的IFN-γ水平、T淋巴细胞ANAE阳性率和T淋巴细胞转化率均高于绍兴鸭;②绍兴鸭在70日龄时的免疫器官重量及10日龄和70日龄时的IL-2水平均高于缙云麻鸭;③70日龄的绍兴鸭与缙云麻鸭的免疫器官指数无明显差异（P〉0．1）。缙云麻鸭和绍兴鸭的免疫系统发育与细胞免疫功能均有一定差异。     

鸡脾脏中IFN-γ和IL-2的基因表达水平研究

为了解鸡在胚胎期以及出壳后的机体免疫状态,本研究采用SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR方法,检测鸡在胚胎时期和出壳后(1日龄～35日龄)脾脏中IFN-γ和IL-2mRNA表达水平,并研究鸡脾脏免疫功能的建立情况。研究发现:鸡脾脏中IFN-γ和IL-2的基因表达最早于13胚龄被检测到,随后迅速升高,分别于出壳后7日龄和10日龄达到峰值。出壳后,鸡脾脏中同一种细胞因子的基因表达水平显著高于胚胎时期。研究还表明:IFN-γ和IL-2的基因表达模型与出壳后鸡脾脏的发育以及T细胞的迁移定殖情况相一致。该研究对从分子水平,进一步了解鸡在胚胎时期和出壳后,脾脏免疫功能的建立情况具有重要意义。     

猪IFN-γ mRNA竞争性RT-PCR定量检测方法的建立

无菌分离的猪外周血单个核细胞（PBMC）,经ConA体外刺激培养15 h后提取细胞总RNA.以此总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增到了435 bp的IFN-γ基因.把扩增到的IFN-γ基因与pMD18-T载体连接,构建了pMD-IFN435重组质粒.用另一对引物对重组质粒pMD-IFN435内部进行PCR扩增,得到了257 bp（含PstⅠ酶切位点）的基因片段,将此基因片段连接到pMD18-T载体上构建了pMD-IFN257重组质粒.将pMD-IFN257双酶切（PstⅠ＋SalⅠ）后回收的目的片段与pMD-IFN435双酶切（PstⅠ＋SalⅠ）后回收的目的片段连接,得到了含有367bp目的片段的重组质粒pMD-IFN367,即内标准DNA模板.以定量后的pMD-IFN367与2倍梯度稀释的pMD-IFN435进行竞争PCR扩增,建立了能够准确、方便定量检测猪IFN-γmRNA的标准竞争曲线的线性回归方程（y=0.414x-1.864）.     

不同CSF免疫状态下猪PRRS易感性及IFN-γ分泌细胞应答

采用酶联免疫斑点检测技术（ELISpot）检测自然状态下猪外周血单核细胞（PBMC）中分泌IFN-γ的细胞数,并用带T细胞表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）特异性小分子多肽刺激培养的PBMC,观察IFN-γ的分泌变化。结果显示,猪瘟病毒（Classical fever virus,CSFV）抗体阳性组中感染PRRSV比率小于CSFV抗体阴性组。CSFV抗体阳性猪PBMC中IFN-γ分泌细胞数量均高于CS—FV抗体阴性组,CSFV抗体阴性且受PRRSV感染猪的PBMC对PRRSV多肽刺激不应答。结果表明,对CSFV疫苗应答好的猪对PRRSV感染有一定的抵抗,其细胞免疫处于活动状态,提示2种传染病的免疫应答机理有部分相关性。     

巴马小型猪主要细胞因子的克隆及序列分析

为了丰富广西巴马小型猪细胞因子生物学数据,本试验采取广西巴马小型猪的外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR扩增,将克隆出的与目的基因大小相符的片段回收,再与T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,将重组菌测序后提交NCBI,比较克隆序列与已知序列的同源性,并利用软件对克隆序列进行分析。结果表明,已克隆出的巴马小型猪细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α基因序列长度分别为338、377、380、402 bp,测序结果均与目的基因预期估计值吻合。序列分析结果发现与已知的家猪或野猪的相应基因同源性较高,IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α序列同源性分别为98.9%、99.5%、99.2%、100%。研究巴马小型猪细胞因子基因序列不仅丰富了生物学数据,而且为细胞因子的功能研究提供了依据,也为细胞因子的定量检测奠定了基础。     

猪IL-2、IL-12p40和IFN-γ SYBR Green I real-time PCR检测方法的建立

针对猪Th1型细胞因子IL-2、IL-12p40、IFN-γ以及管家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IL-2、IL-12p40、IFN-γ及β-actin的SYBR Green I real-time PCR方法。该方法线性关系好,标准曲线的相关系数均达到0.997以上;敏感性高,初始模板的检出下限均达到100拷贝/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3.5%。应用所建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染仔猪外周血单个核细胞中IL-2、IL-12p40和IFN-γ mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,所建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP1对猪体免疫抑制作用

为了研究高致病性PRRSVNSP1蛋白的免疫作用,本研究将高致病性PRRSVNSP1重组腺病毒（rAd—NSP1）接种体外培养的猪肺泡细胞（PAM）,用实时荧光定量PCR和ELISA方法分别检测IFN-γ和IL-10水平,结果为rAd—NSP1接种PAM细胞72h后可显著降低细胞上清中IFN-γ的水平,而IL-10的含量显著提高。将rAd—NSP1接种无PRRSV感染的30日龄商品仔猪,分别检测其外周血液淋巴细胞增殖作用和IFN-γ与IL-10的水平,结果显示,NSP1可显著减低淋巴细胞增殖和IFN-7的表达,同时诱导产生较强的IL-10反应。采用无PRRSV感染的30日龄商品仔猪免疫猪瘟疫苗后1周接种rAd—NSP1,结果猪瘟抗体的水平明显低于wtAd组（P〈0．05）,证明高致病性PRRSVNSP1蛋白具有免疫抑制作用。     

猪γ-干扰素基因真核重组表达质粒的构建

用RT—PCR方法从长白猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪γ-干扰素(IFN-γ)基因，经克隆测序表明与已发表序列同源性为100％。将目的基因插入表达载体pcDNA3．1( )，构建出真核重组表达载体IFN-γ-pcDNA。将重组质粒转染COS7细胞，检测转染细胞培养上清IFN-γ活性，结果表明转染上清对猪繁殖与呼吸综合征病毒有抑制作用。     

分泌抗山羊γ干扰素单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与鉴定

为筛选分泌山羊γ干扰素(IFN-γ)单克隆抗体的杂交瘤细胞,以原核表达的山羊rIFN-γ蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾脏细胞与SP2/0瘤细胞进行细胞融合,以间接ELISA方法筛选分泌山羊IFN-γ单克隆抗体杂交瘤细胞,采用山羊外周血淋巴细胞产生的IFN-γ包被酶标板对IFN-γ的特异性进行鉴定,用试纸条对IFN-γ单克隆抗体类别和亚型进行鉴定。结果获得了1株能特异性识别山羊IFN-γ的杂交瘤细胞3C,3C分泌的单克隆抗体能够特异性识别天然结构的山羊IFN-γ,单克隆抗体类别为IgG,轻链为κ型。     

IFN-γR和ER在大鼠下丘脑中的共存

为了探讨神经-免疫-内分泌网络中生物活性物质间相互调节和平衡的关系,本试验应用免疫组化双标记法对成年SD雌性大鼠下丘脑中IFN-γ受体（IFN-γR）和雌激素受体（ER）的共表达进行了研究。结果发现,IFN-γR和ER广泛存在于大鼠下丘脑中,其中在视前交叉上核、视前内侧核、室周核、交叉上核、下丘脑前核、下丘脑内侧核、下丘脑外侧核、乳头体前背侧核、乳头体前腹侧核等13个核团中存在大量的IFN-γR和ER双标记细胞,双标记细胞约占全部阳性标记细胞的60．9％;双标记细胞胞质呈黑褐色、胞核呈棕黄色;ER单标着色细胞以神经胶质细胞居多。研究结果表明,IFN-γ和雌激素可以分别以其各自受体为介质进行信号传递和信息整合,同时也通过在同一细胞中的相互作用而参与机体的神经-免疫-内分泌调节。     

鸡鼻相关淋巴组织中IFN-γ和IL-2mRNA表达水平的动态变化

本研究旨在观察鸡鼻黏膜相关淋巴组织（NALT）在不同日龄时细胞因子上干扰素（IFN-γ）和白细胞介素-2（IL-2）mRNA的表达水平,分析鸡NALT免疫功能的建立情况,试验以不同日龄海蓝白鸡鼻腔后部组织为研究对象,采用SYBRGreen1qRT—PCR方法,检测鸡在胚胎时期和出壳后初期鼻相关淋巴组织中IFN-γ和IL-2mRNA的表达水平。研究发现：NALT中于18胚龄检测到IFN-7和IL-2mRNA,随后表达水平逐渐升高,并于21日龄时达到峰值。此外,在4日龄时2种细胞因子与CD4＋细胞出现的时间相同,表明2种细胞因子由该免疫活性细胞所分泌。NALT在4日龄时开始具有-定的免疫功能,并随日龄增长逐渐增强,21日龄时达到成熟水平。     

猪γ-干扰素双顺反子表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

提取经 Con A诱导培养的猪外周血白细胞总 RNA,RT- PCR扩增出猪 IFN- γ基因并克隆到 p GEM- T- easy载体 ,测序结果表明 ,扩增片段为含有信号肽的猪 IFN-γ完整基因。亚克隆猪 IFN-γ成熟蛋白编码基因 ,并对其 5′段前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。通过引入 SD序列 ,成功构建了猪 IFN- γ原核双顺反子表达载体 p L CS-po IFN2 G,并实现了猪 IFN-γ在大肠杆菌中的高表达 ,约占菌体总蛋白的 5 6 .5 %。表达产物以包涵体形式存在 ,用含 7mol/L 盐酸胍的变性液溶解及含 0 .5 mol/L盐酸胍复性液复性处理 ,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后 ,细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪 IFN-γ具有较高干扰素活性