不对称RT-PCR结合芯片技术鉴别4种禽病的初步研究

本研究结合非对称RT-PCR和基因芯片两种技术,构建可同时区分AIV的H5、H7、H9血凝素亚型和N1、N2神经氨酸酶亚型以及鸡传染性支气管炎病、新城疫病、鸡传染性法氏囊病的基因芯片。分别T／A克隆部分禽流感病毒的M基因,H5、H7、H9亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因,鸡传染性支气管炎病毒np基因、新城疫病np基因、鸡传染性法氏囊A基因,并构建重组质粒;以重组质粒为模板,用PCR方法扩增制备探针,纯化后点于氨基修饰的载玻片上,制备基因芯片;常规方法从待检样品中提取RNA,用Cy3标记引物进行RT-PCR,将荧光素引入PCR产物中;并对扩增条件进行优化。研究发现检测探针可特异性的与相应的标记样品进行杂交,呈现较强的杂交信号;该方法可以准确进行4种主要禽病的鉴别诊断和禽流感主要流行亚型鉴定,对感染样品和现地样品检测结果与RT．PCR、鸡胚接种有较高一致性,符合率分别为100％和96％。结果显示该方法可用于同步鉴别禽流感、鸡传染性支气管炎、新城疫、鸡传染性法氏囊病,以及现地主要流行的禽流感亚型,是一种有效的新方法。     

应用基因芯片技术检测禽4种主要疫病的研究Ⅱ.检测基因芯片的构建及制备

本试验进行了NDV—IBV—AIV—IBDV检测基因芯片的构建及制备。以构建的重组质粒为模板，用PCR方法扩增制备靶基因，异丙醇沉淀法进行纯化，制备的靶基因质量浓度可达161．88～1218．36mg／L。将靶基因以点样缓冲液稀释至100mg／L，以芯片点样仪SpotArray24将靶基因点制在氨基化基片上，样点中心间距450／Lm，样点直径220／Lm。点样基片经室温干燥2h、水合处理10s、紫外线交联25min和0．2％SDS洗涤5min等系列处理后，成功制备出检测基因芯片。试验以PCR扩增标记制备检验探针，对制备的检测芯片进行质量检验。结果表明，制备的NDV—IBV—AIV—IBDV检测基因芯片质量好，可对NDV、IBV、AIV和IBDV进行检测。     

伪狂犬病病毒、猪细小病毒和流行性乙型脑炎病毒检测基因芯片的制备

对伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）和流行性乙型脑炎病毒（JEV）检测基因芯片的制备及该芯片的检测技术进行了研究。选定靶基因最佳点样质量浓度为200 mg/L,用基因芯片点样仪将其点制在氨基化基片上,经干燥、水合、紫外线交联和洗涤后,成功制备了PRV-PPV-JEV检测基因芯片。以CY3荧光素标记的dCTP经PCR扩增制备探针,对芯片的质量进行了评价。结果表明,制备的芯片质量好,探针最佳使用质量浓度为3 000μg/L,芯片系统检测灵敏度可达3μg/L。该芯片可同时检测PRV、PPV和JEV,其灵敏度高、特异性强,芯片可重复使用,室温下至少可保存4个月。     

猪流感病毒分型基因芯片的建立和初步应用

根据流感病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）亚型基因序列间的差异性,分别设计H1、H3、H9、N1和N2的特异分型引物,并根据M基因设计A型流感病毒的通用引物。RT-PCR扩增猪流感病毒各亚型HA、NA和M基因的特异片段,克隆至pMD18-T构建重组质粒,制备探针。将各探针按一定的阵列点加到硝酸纤维素膜上,制成基因芯片。并对217份不同地区的样品进行检测。结果表明：该芯片可以同时检测待检样品中5种亚型A型流感病毒,并显示了较高的灵敏度和特异性,灵敏度比PCR高1个稀释度,比病毒分离高2个稀释度。该方法的建立为猪流感的检测及猪流感病毒各亚型在猪群中的流行病学调查提供了一种快速、灵敏和高通量的手段。     

H5N1禽流感病毒核酸多重RT-PCR检测方法的建立

根据禽流感病毒的基质蛋白(M)基因序列和H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因、神经氨酸酶(NA)基因设计并合成了三对特异性引物,用于建立H5N1禽流感病毒核酸的RT-PCR分型鉴定方法。试验证明,建立的多重PCR方法可以将H5N1与H6N2、H9N2有效区分。该方法具有较好的灵敏度和特异性,适合在基层动物防疫和监督部门进行H5N1禽流感病毒核酸的检测。     

CSFV-PRRSV-JEV联合共检基因芯片的研制与初步应用

对猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)联合共检基因芯片的初步应用进行了研究。选用夹缝针,BaiOR点样缓冲液,确定靶基因质量浓度为200mg/L,各样点中心间距300μm,样点直径100μm,在相对湿度为50%~60%、8~30℃条件下用晶芯?SmartArrayerTM48点样仪在氨基化基片上接触式点样,成功制备了CSFV-PRRSV-JEV检测基因芯片。将标记后的探针基因与PRRSV-CSFV-JEV基因芯片经预杂交、杂交、洗涤干燥后,用晶芯?LuxScanTM10K微阵列芯片扫描仪扫描观察结果。结果表明:制备的芯片特异性强,检测灵敏度可达0.295μg/L,4℃条件下可保存120d;用制备的芯片对临床67份疑似繁殖障碍性疾病的病料进行检测,与RT-PCR检测结果符合率均在94%以上,为猪繁殖障碍性疾病的检测提供了理想的检测方法。     

基因芯片方法检测6种动物源性人兽共患病病原

为了建立可同时检测H5亚型禽流感病毒、狂犬病病毒、猪链球菌2型、炭疽芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157的基因芯片检测方法,本实验根据GenBank中上述6种病原的基因序列,设计并合成了特异性的引物和探针.采用点样法制备杂交芯片,将上述病原扩增产物混合后与芯片杂交.杂交结果显示,针对本试验中6种人兽共患传染病所设计的寡核苷酸探针可特异性识别靶基因,与其他常见病原体之间没有交叉反应.检测的灵敏度在1.38×10-5pg/μL～151 pg/μL之间.将建立的基因芯片检测方法对临床样品进行检测,结果与荧光PCR方法一致.     

云南2株H4N6亚型禽流感病毒株的分离与鉴定

采集家禽喉气管作为检测样品,用甲型流感病毒M基因检测引物进行RT-PCR检测,确定样品为甲型流感病毒感染。用已建立的PCR法检测H5、H9亚型及新城疫结果为阴性。在9日龄鸡胚中进行病毒分离培养,收集48 h后死亡鸡胚尿囊液进行血凝和血凝抑制试验,有血凝效价但不能被H5、H7、H9和新城疫阳性血清抑制。为进一步确定病毒的亚型,用甲型流感病毒血凝素基因通用引物进行RT-PCR扩增、克隆及测序,将测得的HA基因序列与血凝素亚型标准序列进行比对,同源性为34.9%～87.3%,与H4亚型的同源性为87.3%;设计神经氨酸酶基因测序引物,将所测序列与神经氨酸酶亚型标准序列进行比对,同源性为47.7%～90.8%,与N6亚型的同源性高达90.8%。通过进行HA和NA基因序列比对,可以确定试验所分离到的2株甲型流感毒株为H4N6亚型禽流感病毒。     

猪传染性胃肠炎病毒检测基因芯片的构建

采用PCR扩增制备TGEV的靶基因并进行纯化,对基因芯片的最佳靶基因点样质量浓度、探针质量浓度、杂交温度、杂交时间进行筛选,选择构建检测芯片的最适靶基因,进行基因芯片探针最佳标记方法试验.结果表明,质粒PCR扩增和采用异丙醇沉淀纯化的靶基因质量好,基因芯片最佳靶基因点样质量浓度为200mg/L,最佳探针质量浓度为3 000 μg/L,预杂交时间为1 h,杂交时间为3～6 h,杂交温度为48℃,以S、S3、sM、M、N、ORF7、POL等7个靶基因为构建TGEV检测芯片的最适靶基因,确定了多重PCR扩增标记TGEV探钟的最佳体系,Cy3-dCTP标记浓度为2.5 μmol/L,构建的TGEV检测芯片与标记的混合探针杂交效果好.     

如何做好禽流感的防控工作

<正>1病原及传播途径禽流感是由正黏病毒科流感病毒属的A型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病。禽流感病毒依据其外膜血凝素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性不同,目前分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9),其中感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H7N7和H9N2,而以H5N1的感染最为严重。     

几种主要禽疫病诊断基因芯片的制备及初步应用

进行了几种主要禽疫病诊断基因芯片制备及其初步应用研究。试验分别设计和克隆鉴定了NDV、IBV、AIV和IBDV的靶基因重组质粒。以克隆的靶基因重组质粒为模板。分别进行PCR扩增制备靶基因并纯化，以基因芯片点样仪将制备的靶基因点制在氨基化的基片上，经干燥、水合、紫外线交联和洗涤后，成功制备了NDV-IBV-AIV-IBDV诊断基因芯片。试验应用CY3荧光标记制备的探针进行芯片的检验，结果表明制备的NDV-IBV-AIV-IBDV诊断基因芯片质量好，可对NDV、IBV、AIV和IBDV进行诊断检测，具有检测灵敏性好，特异性高和芯片可重复检测的优点。试验对30个临床样品进行初步应用检测，结果表明该诊断基因芯片技术与RT—PCR检测技术检出率基本一致，并具有同步诊断检测多种疫病的优点。     

应用cDNA微阵列芯片技术筛选猪蛔虫性别差异表达基因的研究

采用cDNA微阵列芯片技术，从所构建的猪蛔虫雌、雄成虫cDNA消减文库分别挑取1044和1119个克隆，PCR扩增其插入片段，经纯化后点样于预先处理好的基片上（双点杂交），制备成cDNA微阵列芯片。将分别标记荧光素Cy3-dUTP和Cy5-dUTP的雌虫和雄虫cDNA探针，与制备好的cDNA芯片杂交（平行进行反标杂交试验）。根据每个点杂交后的Ratio值，筛选出双点杂交和正反标中都同时具有表达差异的基因克隆共1559个。将表达差异最明显的前831个克隆进行测序，获得720个有效序列，经生物信息学分析发现，雄虫特异表达的主要精于蛋白和雌虫特异表达的卵巢信息蛋白的基因序列多数与新杆属线虫存在同源性，有31个可能是新的ESTs。性别差异表达基因及其相关生物信息的获得为下一步研究基因功能奠定了基础。     

H7N9亚型禽流感病毒三重PCR检测方法的建立

In order to develop a rapid and simultaneous assay for H7N9 subtype avian influenza virus （AIV）, three pairs of specific primers were designed according to the conserved sequences of the hemagglutinin (HA) gene of H7 subtype AIV, the neuramidinase (NA) gene of N9 subtype AIV, and the matix (M) gene of all subtypes AIV. The reaction conditions were optimized, and the specificity and sensitivity of this method were evaluated to develop a triplex PCR assay. It was shown that H7N9 subtype AIV could be amplified into three specific bands by this triplex PCR, the lengths of these bands were 330 (H7 AIV), 207 (N9 AIV) and 632 bp (all AIV), respectively. Samples containing H7 or N9 subtype AIV could be amplified into two specific bands, which were 330 and 632, 207 and 632 bp, respectively. Samples containing other subtypes AIV could be amplified into a 632 bp specific band. No specific band was amplified from other avian pathogenic virus. Sensitivity test results showed that as low as 10³ copies/μL H7N9 subtype AIV could be detected. This triplex PCR could simultaneously diagnose H7N9 subtype AIV, single H7 subtype AIV, single N9 subtype AIV and other subtype AIV in one tube. This assay was a rapid, specific and sensitive method for the detection of H7N9 subtype AIV. It could be applied in rapid diagnosis for clinical samples, and also provided a technical support to prevent and control H7N9 subtype AIV.     

陕北地区鸡禽流感免疫监测及免疫方案研究

H5及H9型禽流感是目前养禽业主要防疫的两种流感病毒亚型,为调查陕西省神木县两种亚型流感病毒的防疫情况,本研究在2011年∽2012年间从神木多家种鸡场、商品鸡场及散养户采集血样,测HI效价,评价禽流感的免疫效果.结果表明：2011年在普遍采用单价疫苗免疫的情况下,H5抗体合格率较低,最好免疫效果合格率为82.40％,最差免疫效果合格率只有67.7％,而H9抗体合格率100％;2012年推广H5和H9二联疫苗免疫,H5抗体合格率达100％,而H9抗体合格率有所下降,为H5和H9禽流感免疫提供了临床参考依据,同时也为二联疫苗的使用提供参考.     

Avian influenza virus subtypes inside and outside the live bird markets, 1993-2000: a spatial and temporal relationship

Between 1993 and 2000, gallinaceous birds, waterfowl, and environmental specimens from the live bird markets (LBMs) of the northeastern United States and non-LBM premises were tested for the presence of avian influenza virus (AIV), pathogenic properties of AIV subtypes, especially of hemagglutinin (H) subtypes H5 and H7, and a possible association between LBM and non-LBM infections. Ten H subtypes of AIV were isolated from the LBM specimens: H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H9, H10, and H11. During this period, the 10 subtypes also were isolated from birds in non-LBM premises. In the LBMs, subtypes H2, H3, H4, H6, H7, and H11 were present for 5-8 yr despite efforts to clean and disinfect the premises. The H5 or H7 subtypes present during the same year in both LBMs and non-LBMs within a state or in contiguous states were (subtype/year): H5N2/1993, 1999, and H7N2/1994-99. The AIV subtypes including the H5 and H7 that were evaluated for pathogenicity in chickens were low pathogenic. The deduced amino acid sequence at the H cleavage site of H5 and H7 subtypes was consistent with those of low pathogenic AIV. Although the H5N2 and H7N2 subtypes remained low pathogenic, they did undergo mutations and acquired an additional basic amino acid at the H cleavage site; however, the minimum number of basic amino acids in correct sequence (B-X-B-R, where B = basic amino acid, X = need not be basic amino acid, and R = arginine) required for high pathogenicity was lacking. A low pathogenic H5 or H7 subtype may become highly pathogenic by acquiring additional basic amino acids at the H cleavage site. The LBMs have been and will likely continue to be a source of AIV for commercial poultry.     

An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian influenza virus subtypes H5 and H7 antibodies

Background

Avian influenza virus (AIV) subtypes H5 and H7 attracts particular attention because of the risk of their potential pathogenicity in poultry. The haemagglutination inhibition (HI) test is widely used as subtype specific test for serological diagnostics despite the laborious nature of this method. However, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) are being explored as an alternative test method.H5 and H7 specific monoclonal antibodies were experimentally raised and used in the development of inhibition ELISAs for detection of serological response specifically directed against AIV subtypes H5 and H7. The ELISAs were evaluated with polyclonal chicken anti-AIV antibodies against AIV subtypes: H1N2, H5N2, H5N7, H7N1, H7N7, H9N9, H10N4 and H16N3.

Results

Both the H5 and H7 ELISA proved to have a high sensitivity and specificity and the ELISAs detected H5 and H7 antibodies earlier during experimental infection than the HI test did. The reproducibility of the ELISA’s performed at different times was high with Pearson correlation coefficients of 0.96-0.98.

Conclusions

The ELISAs are a potential alternative to the HI test for screening of large amounts of avian sera, although only experimental sera were tested in this study.     

供港猪群流感病毒的分离鉴定及流行病学调查

为了对供港猪群中的猪流感流行情况进行分析,从华南地区供港猪群中用无菌棉拭子采集鼻腔粘液样品,采用鸡胚接种方法,从供港猪群中分离出了2株不同亚型的猪流感病毒株,经国家流感中心鉴定分别为H1N1和H3N2亚型。本研究设计了猪流感常见亚型的HA和NA分型特异性引物,建立了猪流感型特异性RT-PCR检测方法;对分离鉴定的2株猪流感病毒和禽流感H5N1 HI检测抗原进行了RT-PCR检测,并对其部分HA和NA基因进行克隆测序分析。对供港猪群的血清检测结果表明:供港猪群中H1N1和H3N2亚型抗体阳性率分别为26.87%、38.26%,禽流感H5N1和H9N2亚型抗体阳性率均为0%。     

禽流感病毒H9N2亚型三重PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)并同时区分出H9、N2亚型的方法,本试验根据基因库中H9亚型AIV的HA基因、N2亚型AIV的NA基因及AIV的M基因序列,分别设计了3对针对这3种基因保守序列的引物,建立了AIV H9N2亚型的三重PCR检测方法。应用该方法对H9N2亚型AIV模板进行PCR扩增,可得到3条与试验设计相符的目的条带,分别为313 bp (HA基因)、451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9亚型的N2亚型AIV模板进行扩增,出现2条特异性扩增条带,即451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9、N2亚型AIV模板进行扩增则只出现一条目的条带,即667 bp(M基因);对其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性试验结果显示此三重PCR方法最低检出限为10^-2 ng/μL。应用所建立的三重PCR方法对120份临床病料进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致。各项试验结果均表明,该方法对于禽流感病毒尤其是H9、N2亚型禽流感病毒的检测具有快捷、特异、灵敏的特点。     

H5亚型和N6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、简便的H5亚型、N6亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,根据GenBank中H5亚型、N6亚型AIV的HA和NA基因保守序列,分别设计了2对特异性引物,通过优化条件,建立了H5亚型和N6亚型AIV二重RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法对H5N6亚型AIV特异性扩增出418bp和251bp目的片段,对H5Ny(y≠6)亚型AIV扩增出418bp目的片段,对HxN6(x≠5)亚型AIV扩增出251bp目的片段,对其他亚型和常见的禽病病原体均未扩增出目的片段;敏感性结果显示,该方法对H5亚型和N6亚型最低检测限为1.59×10-5ng/μL。本研究建立的H5亚型和N6亚型AIV检测方法,具有特异性强,灵敏度高的特点,为H5亚型和N6亚型AIV临床检测以及防控提供了有效方法。