鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其疫苗的研究进展

传染性法氏囊病病毒(IBDV)是鸡传染性法氏囊病(IBD)的病原。近年来IBDV变异毒株和超强毒株的流行,严重威胁着世界养鸡业的发展,传统疫苗已不能控制IBDV的流行,迫切需要研制新型疫苗。IBDV VP2蛋白是重要的结构蛋白,能诱导机体产生中和抗体,因此,利用VP2蛋白制备IBDV重组疫苗成为国内外研究的热点。综述了IBDV VP2蛋白的作用及在不同表达系统中用VP2蛋白制备疫苗的研究进展,以期为IBDV新型疫苗的开发提供参考。     

鸡传染性法氏囊病病毒Gt株感染性分子克隆的构建

 【目的】建立高效鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）拯救平台，为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】在IBDV Gt株全基因组中引入分子标签（A节段：EcoR V酶切位点；B节段：PstI酶切位点）。在基因组两端分别引入锤头状核酶结构（HamRz）和丁肝病毒核酶结构（HdvRz)。将带有分子标签和核酶结构的IBDV基因组插入载体pCAGGS的β肌动蛋白启动子下游，构建IBDV感染性克隆pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT，LipofectamineTM2000介导共转染DFI细胞，进行病毒拯救研究。 【结果】 构建的IBDV感染性克隆可在DFI、Vero/E6、Vero/P12等3种细胞上高效拯救出病毒。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的IBDV，且存在分子标签。拯救毒在CEF上能产生特有的砂砾状CPE，且TCID50与亲本毒差异不显著，具有相似的生物学特征。【结论】构建的RNA聚合酶ⅢBDV拯救系统高效、稳定、简便、经济，且具有良好的细胞普适性。     

传染性法氏囊炎病毒部分VP2基因的克隆与原核表达

传染性法氏囊炎病毒(IBDV)是侵害雏鸡和青年鸡的重要病原,病毒VP2蛋白是主要保护性抗原。为研究不同毒株VP2基因的变异及其抗原表位特点,作者克隆、表达和鉴定了VP2基因。首先应用SPF鸡胚接种和鸡胚成纤维细胞培养法复制病毒,并以自行设计的1对引物,从中扩增出987 bp的VP2片段并进行鉴定。测序结果表明,国内不同毒株VP2高变区序列同源性达99%以上。将其部分片段插入载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒,转入大肠杆菌后用IPTG诱导表达。经检测,在SDS-PAGE中可见大小为44 400的融合蛋白。     

传染性法氏囊病病毒的PCR引物设计与Internet检索分析

研究了传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）Ａ片断的ｃＤＮＡ的结构,并使用ＰｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎ引物设计软件,在ＶＰ５和ＶＰ２的重叠基因区设计了一对引物,各种ＩＢＤＶ毒株在此部位有非常高的同源性,在对引物进行Ｉｎｔｅｒｎｅｔ检索中得到了证实。经过对４种ＩＢＤＶ的疫苗标准毒株,１种野毒株,１例病鸡标本试检测,验证引物设计符合要求,具有良好的适应性和较高的灵敏度。     

鸡传染性法氏囊病病毒河南分离株HeYD VP2基因高变区基因克隆及序列分析

为初步确定新分离的鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)河南株HeYD的毒力,根据GenBank数据库中已报道的IBDV基因组序列,设计合成了1对VP2基因高变区特异性引物,应用RT-PCR方法对分离自河南省某发病鸡场的IBDV野毒株HeYD的VP2基因高变区进行了基因克隆及序列分析,并与其他参考毒株高变区进行了序列比对,序列...     

Analysis of the function of D279N mutation of VP2 of infectious bursal disease virus

Infectious bursal disease virus(IBDV)is responsible for the highly contagious infectious bursal disease of chickens.Further understanding the gene-function is necessary to design the tailored vaccine.The amino acid residue 279,located on strand P_F of VP2,is one of the three residues that have been reported to be involved in cell-tropism but with some inconsistency.In this study,to further clarify the amino acids involved in the cell tropism of IBDV,a series of mutations about residue 279were introduced into the VP2 of vv IBDV Gx strain.With the reverse genetic system,we found single mutation of D279N,double mutations of D279N/A284T or Q253H/D279N were not enough to adapt IBDV to chicken embryo fibroblast(CEF)cell.To evaluate whether residue 279 could influence the replication and virulence of IBDV,the virus r Gx HT-279 with three mutations(Q253H/D279N/A284T)was rescued and evaluated.Results showed that the mutation of residue 279 in VP2had no efficient effects on both the replication efficiency in vitro and the virulence to SPF chickens of IBDV.In summary,the results demonstrated that residue 279 of VP2 did not contribute efficiently to cell tropism,replication efficiency,and virulence of IBDV at least in some strains.These findings provided further information for understanding the gene function of IBDV.     

Characteristics of Monoclonal Antibody Against Infectious Bursal Disease Virus

Thirteen strains of monoclonal antibodies(McAbs) against infections bursal disease virus(IBDV) were obtained by using hydridoma technique and their characteristics were studied by double immunodiffusion,enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),virus neutralization test(VNT) and Western-blotting assay (WBA).The result showed that nine of the thirteen McAbs belonged to IgG class and four of them belonged to IgM class.No crossreactions were detected betwween the McAbs and Newscastle disease virus (NDV),infectious bronchitis virus(IBV) and Marek‘s disease virus(MDV).All of McAbs were positively specific reactive with IBDV and five of them can neutralize viral infectivity.Their recognized epitopes of the neutralizing McAbs were all presented on VP2 of the IBDV.     

抗传染性法氏囊病病毒单克隆抗体特性的研究

试验采用琼脂免疫双扩散 ,酶联免疫吸附试验 ( EL ISA) ,病毒中和试验和 Western-blotting试验对 13株单克隆抗体 ( Monoclonal Antibody,Mc Ab)的特性进行了研究。试验结果表明 ,其中 9株 Mc Abs为 Ig G类 ,4株为 Ig M类 ;这些 Mc Abs仅与抗传染性法氏囊病病毒( Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)发生特异结合 ,而与新城疫病毒 ( Newcastle DiseaseVirus,NDV)、传染性支气管炎病毒 ( Infectious Bronchitis Virus,IBV)和马立克氏病病毒 ( Marek'sDisease Virus,MDV)均不发生交叉反应 ,有 5株 Mc Abs具有中和 IBDV的活性 ,这 5株有中和活性的 Mc Abs识别的抗原位点在 IBDV的 VP2 上     

传染性法氏囊病病毒河南分离株（HN04）A片段cDNA的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,以传染性法氏囊病毒河南分离株(HN04)基因组RNA为模板,扩增并克隆IBDV HN04株基因组A片段cDNA。测序结果表明:克隆的A片段全长3260个核苷酸,包括2个部分重叠的开放阅读框(ORFl和ORF2)及两端的非编码区。ORFl和ORF2分别编码含有1012个氨基酸的结构蛋白(VP2-4-3)及含有145个氨基酸的VP5。IBDV HN04株基因组A片段核苷酸序列与来自GenBank IBDV血清Ⅰ型毒株核苷酸序列的同源性高达94.9%～99.4%,血清Ⅱ型毒株核苷酸序列同源性为83.8%。对IBDV HN04株的A片段核苷酸及其推导氨基酸进行序列分析,结果显示HN04株与国内外IBDV数株弱毒株的同源性在99.0%以上。     

家蚕生物反应器表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白的免疫原性研究

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)浙江分离株JD1的多聚蛋白(VP2/4/3)基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,重组载体与杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕细胞后,将获得的重组病毒BacPAK-A感染家蚕5龄起幼虫进行虫体内表达.用感染后第5日的蚕血淋巴作抗原制备油佐剂苗免疫14日龄非免疫鸡,安全性试验表明,接种1倍和5倍免疫剂量的试验鸡在临床反应和剖检中均无异常变化;在免疫-攻毒试验中设杆状病毒表达的IBDV VP2蛋白和正常蚕血淋巴免疫对照组,并于28日龄加强免疫,25 d后用IBDV强毒BC6/85攻击.通过临床保护率、病理保护率及血清学试验表明,基于多聚蛋白制备的疫苗更成功地诱导了体液免疫应答,比VP2蛋白对IBDV强毒的攻击具有更高的保护力,更适于作为IBD基因工程亚单位疫苗的抗原成分.     

传染性囊病病毒VP5及非编码区基因的序列分析

以反转录 -聚合酶链反应 (RT PCR)方法从传染性囊病病毒 (IBDV)CJ80 1、LX、HK46基因组中扩增出VP5及 5’端非编码区基因序列 ,然后克隆到质粒pBssk中 ,用于序列测定和分析 .报道了IBDVCJ80 1、LX毒株的VP5及 5’端非编码区基因序列 .结果表明 :IBDVVP5及 5’端非编码区基因序列是高度保守的 .一般毒株VP5由 145个氨基酸组成 ,只有 1个亲水区 .vvIBDV、变异株VP5由 149个氨基酸组成 ,有 2个亲水区 ,这可能与毒力变化有关     

传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆、序列分析及原核表达

克隆、序列分析及原核表达鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因。根据GenBank已登录的IB-DV VP2基因序列,设计合成一对VP2基因特异性引物,应用RT-PCR技术从陕西省某鸡场分离的IBDV毒株中克隆VP2基因并进行序列分析。再将VP2基因亚克隆于原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-32a-VP2,经鉴定正确后转化大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE检测。成功克隆IBDVYL毒株VP2全基因序列,核苷酸和氨基酸序列分析表明,YL株为IBDV超强毒株。经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,在宿主菌BL21中成功表达约为53 ku的VP2蛋白。IBDV VP2基因克隆表达成功,为IBDV的分子生物学特性研究提供资料,其表达产物为进一步制备抗IBDV单克隆抗体奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒河北分离株(HB-bp)基因组A节段全长cDNA的克隆和序列分析

采用RT-PCR技术,以传染性法氏囊病病毒河北分离株(HB-bp)基因组RNA为模板,扩增并克隆了IBDVHB-bp株基因组A节段全长cDNA。结果表明:克隆的A节段全长共3142个核苷酸,包括5′、3′端非编码区(NCRs)和2个部分重叠的开放阅读框(ORF1和ORF2),与其它血清Ⅰ型毒株相比,HB-bp株在核苷酸水平上有32～146个核苷酸的差异,同源性为95 4%～98 8%;在氨基酸水平上有5～35个氨基酸的替代,同源性为96 9%～99 5%,与血清Ⅱ型毒株同源性为89 8%～90 8%。与其他超强毒株的同源性最高,具有超强毒株的特征性氨基酸,因此HB-bp株为中国的一个超强毒株。     

IBDV超强毒株和弱毒株VP2基因同义密码子使用偏爱性研究

应用RT-PCR方法扩增并克隆了分离自河南省的30株IBDV超强毒和9株弱毒株VP2基因cDNA序列,研究IBDV超强毒和弱毒株的VP2高变区基因不同位点同义密码子的使用情况。结果表明,超强毒株和弱毒株除特定位点的特征性氨基酸不同外,在同义密码子的使用上也有明显的偏爱性。这预示着同义密码子的使用与VP2基因表达及其表达产物的空间结构有关,进而可能影响到IBDV的毒力。     

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建

利用反转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR) ,扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒 (vv IBDV) HZ株 VP2基因 ,并对 VP2基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析 ,同时将VP2基因与真核表达载体 pc DNA3相连接。结果克隆到 VP2基因全序列长 1 356bp,分析表明 HZ株与欧洲超强毒株 UK661高度相似 ,同时将 VP2基因正向插入 pc DNA3的 CMV启动子下游 ,得到了 VP2基因的真核表达质粒。为 IBDV分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础     

IBDV地方野毒株(XX株)VP2基因高变区的克隆与序列分析

参考GenBank发表的传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组序列,设计并合成了1对特异扩增IBDVVP2基因高变区的引物。应用RT-PCR法,对分离于新乡地区典型发病鸡群的IBDV(XX株)进行了VP2基因高变区的克隆与序列分析,并和相关毒株进行了比较。结果表明,XX株与超强毒株UK661,OKYM高度相似,核苷酸同源性分别为98.73%,99.15%,氨基酸同源性都为100%,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

Pathogenic Antigenic and Molecular Characterization of the Very Virulent Strain(Gx) of Infectious Bursal Disease Virus Isolated in China

The very virulent infectious bursal disease virus (vvIBDV) strain Gx was isolated from a poutl-try farm in Guangxi Province, China, during 1996. The mortality in the infected flock was 80% and occurred5 days after immunization with serotype I IBD vaccine. The results of antigen-capture ELISA (AC-ELISA),pathogenicity testing, cloning and sequence analysis of the VP2 gene showed that the deduced amino acid se-quence of strain Gx VP2 was the same as vvIBDV UK661, which is considered as a reference strain for Europe-an vvIBDVs. The antigenicity of the Gx strain was the same as an European vvIBDV strain 849. The EID50 of Gx virus was 10-8. 25/0. 2 ml, and the mortality was 64 % when 4 week-old SPF chickens were challenged atdosage of 2 × 103 EID50. We have demonstrated that the IBDV strain Gx isolated in China is vvlBDV according to European standards.     

一株鸡传染性法氏囊病病毒基因组测序及其分子特征

[目的]测定一株鸡传染性法氏囊病病毒基因组序列及其分子特征。[方法]分离出一株具有特殊分子特征的鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）超强毒株（vvIBDV）HLJ-0504,并对其基因组进行了克隆和测序。[结果]序列分析显示,HLJ-0504的基因组A节段属于超强毒株,而其B节段则来源于另外一个独特的祖先。动物实验表明,HLJ-0504对SPF雏鸡的致病率和致死率分别为100%和86.7%。[结论]具有独特基因组B节段的vvIBDV仍在我国流行,我国IBDV的进化特征存在多样性。IBDV的毒力不是由基因组的A或B单独决定的。     

乌鸡传染性法氏囊病毒的分离鉴定与分子生物学特性研究

从一群精神不振、拉白色稀粪便为特征的乌鸡中分离到 1株病毒。经血清学试验、鸡胚接种试验、动物回归试验等鉴定为法氏囊病毒。该病毒与鸡法氏囊病毒的血清型无明显差异。根据IBDV的VP2基因序列设计了一对特异性引物 ,应用RT -PCR法从中扩增出了一条0 .72kb的VP2基因高变区片段。序列分析表明 ,片段长 0 .72kb ,编码 2 4 0个氨基酸 ,与其他毒株的VP2基因序列比较分析 ,该毒株符合IBDV超强毒的特征。虽然有 4处氨基酸发生了变化 ,但没有引起其抗原性的改变