重组猪α干扰素理化性状及其体外抗病毒活性研究

[目的]研究重组猪α干扰素（rPoIFN-α）半成品理化性状并对其体外抗病毒活性进行测试与鉴定。[方法]用HEp-2/VSV体系对3批rPoIFN-α蛋白进行抗病毒活性检测,以重组人IFN-α为参比品,测定干扰素效价;用0.25%胰蛋白酶HCl以及鼠抗猪α干扰素单克隆抗体作用已知效价的rPoIFN-α半成品,并检测各批次抗病毒活性,对rPoIFN-α理化性状进行评价;在猪肾细胞株（PK-15）上检测rPoIFN-α对猪细小病毒（PPV）和猪伪狂犬病毒（PRV）的致细胞病变抑制效应,观察rPoIFN-α的体外抗病毒活性。[结果]HEp-2/VSV体系滴定rPoIFN-α半成品效价可达1.5×105IU/ml,比活性达1.1×106IU/mg;rPoIFN-α经0.25%胰蛋白酶37℃作用1h,效价残留率低于1%,经HCl（pH=2.0）处理72h效价残留率高达95%以上,经56℃处理30min效价残留率高于47%,经鼠抗猪α干扰素单克隆抗体37℃作用1h后效价残留率约为1%;体外抗病毒试验表明,用50和500IU/mlrPoIFN-α可分别抑制PRV和PPV对PK-15细胞株致细胞病变效应。[结论]rPoIFN-α具有IFN-α的基本理化性状,其在体外可分别抑制PRV、PPV对PK-15细胞株致细胞病变效应,但剂量有差别。     

两种细胞株滴定重组猪α干扰素效价的比较研究

采用水泡性口炎病毒（VSV）作为攻击病毒,以微量细胞病变抑制法对同批次不同浓度的8组重组猪α干扰素（rPoIFN-α）样品进行了效价检测,以中国药品生物制品检定所指定使用的标化重组人α干扰素为效价滴定的参比标准,对在牛肾细胞（MDBK）株和人喉癌上皮细胞（HEp-2）株所得结果进行比较,并对细胞与待测样品按＂一步法＂和先加细胞,待细胞长满单层再加待测样品的＂两步法＂所得的rPoIFN-α抗病毒效价进行比较。结果表明：MDBK细胞株与HEp-2细胞株对于rPoIFN-α抗病毒活性检测结果无显著性差异,均可用于rPoIFN-α抗病毒活性的检测,重组人α干扰素滴定系统可用于rPoIFN-α效价检测。两种加样方法所得结果基本相同,推荐使用＂一步法＂。     

重组猪α干扰素的酵母表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用

利用自动发酵罐高效分泌表达rPoIFN-α,经硫酸铵沉淀、Q Sepharose FF阴离子交换层析和Superdex200分子筛层析纯化重组猪α干扰素,用纯化的rPoIFN-α进行PRV体外抑制试验.结果表明:随着表达时间的延长,发酵表达液中rPoIFN-α含量增高,其中72h表达液中rPoIFN-α的含量可达0.52μg/μL,约占总蛋白量的57.50%,活性为1.00×106 U/μL.rPoIFN-α提纯液的浓度为7.02μg/μL,纯度为98.1%,活性高达1.00×109U/μL.纯化rPoIFN-α的PRV抑制作用和感染阻断作用的比活均为1.42×105 U/μg,对PRV增殖抑制作用的比活为1.42×103 U/μg.表明发酵表达的rPoIFN-α对伪狂犬病毒病具有良好的抑制活性,为进一步开展重组猪α干扰素临床试验提供依据.     

猪α干扰素表达蛋白ab的抗病毒效果研究

[目的]探索猪α干扰素表达蛋白ab的抗病毒效果。[方法]通过测定猪α干扰素(PoIFN-α)表达的融合蛋白ab对接种水泡性口炎病毒(VSV)的牛肾细胞(MDBK)保护作用的效价,来研究其抗病毒效果。通过中和试验,测定保护50%细胞不产生病变所需PoIFN-α表达的融合蛋白ab的稀释度。[结果]PoIFN-α表达的融合蛋白ab具有显著的抗病毒作用,稀释度1∶4.9的2.0μg/ml ab蛋白溶液即可保护50%细胞不产生细胞病变。[结论]猪重组α干扰素具有高活性、纯度高、无毒副作用、无药物残留等特点,其研制与开发对猪生产实践和疾病防治具有重要意义。     

猪干扰素α和γ在杆状病毒中共表达及对PRRSV抑制作用

[目的]制备复合型猪干扰素α和γ进行应用抗病毒研究.[方法]本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码猪干扰素α和γ成熟蛋白基因插入供体质粒pFastBacDual,分别置于PH和P10启动子控制下,引入蜂素信号肽(honeybee melittin signal peptide,HBM)基因取代猪干扰素α和γ原有信号肽基因以实现分泌型表达,并在C端分别融合6个组氨酸标签以利于纯化.将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒.重组杆状病毒感染昆虫细胞,鉴定重组蛋白的活性.[结果]通过问接免疫荧光、Western-blot证明猪干扰素α和γ重组蛋白在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中均获得表达,表达产物主要分布在培养上清中.通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性,结果表明:昆虫细胞上清的抗病毒效价达到3.24×10<'7>U·mL<'-1>.在Marc-145细胞,昆虫细胞上清经2<'-11>稀释能够抑制100个TCID<,50>的PRRSV的致细胞病变作用.[结论]应用杆状病毒表达系统实现猪干扰素α和γ在昆虫细胞上分泌共表达,重组蛋白在细胞上对PRRSV具有抑制作用.     

猪IFN-α在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

为了获得高效抗病毒活性的猪α-干扰素蛋白,采用PCR法扩增获得猪α-干扰素基因完整的开放阅读框(ORF),构建重组表达质粒pPICZαC-IFN,电击转化毕赤酵母感受态细胞X33.挑阳性菌落诱导表达,离心取上清,SDS-PAGE和Western-blotting分析,可见1条相对分子质量约19 400的清晰蛋白条带,与理论值相符,表明表达产物为猪α-干扰素.在Vero细胞上检测该干扰素抗VSV的活性为4.04×106IU/L.     

猪干扰素α在昆虫细胞中分泌表达及其抗病毒活性检测

 【目的】为获得重组猪干扰素α。【方法】本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪干扰素α基因插入供体质粒pFastBacⅠ多克隆位点,置于pH启动子控制下,昆虫可识别的蜂素信号肽（honeybee melittin signal peptide,HBM）取代猪干扰素α原有信号肽以实现分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。【结果】重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blot证明重组蛋白在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞（PK-15）上抑制水泡性口炎病毒（VSV）致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性,结果表明：昆虫细胞上清的抗病毒效价达到1.07×105 U?ml-1,昆虫细胞裂解液的抗病毒效价为3.15×104 U?ml-1。【结论】应用蜂素信号肽实现猪干扰素α在昆虫细胞上分泌表达,为临床上防治猪病毒性疫病奠定了基础。     

猪α干扰素的表达及在PAM细胞系中抗PRRSV活性检测

为研究猪α干扰素蛋白功能和了解猪α干扰素蛋白的抗病毒活性,扩增并测序了猪α干扰素基因(IFN-α),并克隆至原核表达载体pET-28a中,构建原核表达载体pET-IFN-α,将pET-IFN-α转化至BL21进行表达。Western-Blot结果表明,表达的蛋白具有很好的生物学活性。用细胞病变抑制法在PAM细胞系上进行抗病毒活性测定,结果表明,猪α干扰素有较为显著的抗PRRSV活性,其抗病毒活性效价约为1.13×106U/mg。     

重组鸭α-干扰素的抗病毒活性

本研究参考大肠杆菌密码子的偏好性,对GenBank中已经发表的鸭α-干扰素基因序列进行优化,人工合成后与原核表达载体pET30a-ELP连接,构建原核表达质粒pET30a-DuIFNα-ELP。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,IPTG诱导表达重组蛋白DuIFNα-ELP。根据类弹性蛋白多肽(ELP)具有温度敏感的可逆相变特性,通过重复可逆相变循环(ITC)纯化重组蛋白质;纯化的蛋白质主要以包涵体的形式存在,通过变性、复性处理后,采用细胞病变抑制法分别在MDCK/VSV和DEF/VSV中检测重组蛋白质的抗病毒活性。结果表明,合成的重组鸭α-干扰素基因能成功表达,重组蛋白DuIFNα-ELP分子质量约80 000,纯化后的重组蛋白质纯度约90%。通过抗病毒试验检测重组DuIFNα-ELP在MDCK/VSV系统中的抗病毒活性为1.0×10~6 U/ml,比活性为1.25×10~6 U/mg;在DEF/VSV系统中的抗病毒活性为1.0×10~7 U/ml,比活性为1.25×10~7 U/mg,比MDCK/VSV系统中活性高10个单位,验证了干扰素的抗病毒活性与受体细胞的应答可能存在一定关系。这一研究结果为鸭α-干扰素防治禽类病毒性疾病的探索奠定了基础。     

犬干扰素α1和胸腺肽α1融合蛋白在毕赤酵母GS115中的表达

为探索犬干扰素和胸腺肽融合蛋白的抗病毒活性,根据已知的基因序列,合成了犬干扰素(IFNα1)和胸腺肽(THYα1)的基因片段,通过一个连接肽将IFNα1和THYα1片段连接起来。将该基因克隆于pPIC9K载体中,构建重组质粒pPIC9K-IFNα1-THYα1,转化到感受态细胞毕赤酵母GS115受体菌中,30℃培养18h至菌体OD600nm值约为4时用甲醇诱导培养5d,使最终浓度维持1%,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定证实,获得高纯度的重组蛋白。以MDCK/VSV抗病毒检测系统对目的蛋白进行体外活性检测,结果显示该蛋白具有抗病毒活性。     

重组猪干扰素α的纯化工艺研究

[目的]研究重组猪干扰素α的纯化工艺,为进一步研究该蛋白的分子结构及rPoIFN-α标准品的制备奠定基础。[方法]将含重组菌E.coliBL21诱导表达后得到的粗制rPoIFN-α,分别用2种方案进行纯化。方案1,依次用GST亲和层析法、DEAE阴离子交换法及分子筛法层析三步法进行纯化;方案2,依次用GST亲和层析和分子筛法层析两步法进行纯化。纯化结果用SDS-PAGE及Western-blot进行纯度检测及鉴定。[结果]诱导表达后的表达产物经SDS-PAGE检测,发现在45Kd分子量处有目的条带,Western-blot检测有特异性条带。通过两步法纯化后的rPoIFN-α纯度达96%,蛋白得率为42.8%,三步纯化纯度为98.8%。[结论]两步法得到的蛋白纯度非常接近三步法,但与三步法相比工艺更为简单方便。     

重组猪α-干扰素的纯化及其抗病毒活性测定

分别采用PEG 6000沉淀法和Sephadex G-50凝胶色谱法纯化毕赤酵母分泌表达的重组猪α-干扰素(PoIFN-α)。正交试验结果显示:PEG 6000沉淀法最佳分离条件为pH 6.0、NaCl 0.2 mol/L、PEG 60000.1 g/mL,蛋白回收率约80%;纯化后蛋白效价为2.9×10~3 IU/mL,比活为1.04×10~3 IU/mg。通过Sephadex G-50凝胶色谱纯化,重组PolFN-α的回收率为60%左右,纯度达到90%;纯化后蛋白效价为8×10~3 IU/mL,比活为6.7×10~3 IU/mg。     

PPV感染PK-15细胞后对4种抗病毒细胞因子mRNA转录时相的影响

【目的】了解猪细小病毒(PPV)感染对抗病毒相关细胞因子mRNA转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】对PPV感染PK-15细胞的病变进行了显微观察,运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染PK-15细胞后,细胞病毒DNA含量及巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)、转化生长因子β1(TGF-β1)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)和MURR1等细胞因子mRNA相对表达量的变化。【结果】PPV可以快速诱导PK-15细胞产生细胞病变。感染后1 h即可检测到PPV DNA,随着时间的延长,PPV DNA含量逐渐增加,并于48 h时达到峰值,相对含量为1 800左右。MIP-1α和PGK1 mRNA的相对表达量在感染后2 h显著增加,之后下降;TGF-β1 mRNA的相对表达量在72 h时显著增加;MURR1 mRNA的相对表达量在24 h时显著增加,48 h后下降。【结论】PPV感染可引起PK-15细胞抗病毒因子mRNA表达水平升高。     

黄芪和板蓝根对猪细小病毒的体外抑制作用

【目的】探讨黄芪和板蓝根对猪细小病毒(PPV)的体外抑制作用。【方法】选用中草药黄芪、板蓝根作为抗病毒药物,利用细胞病变(CPE)抑制试验,测定黄芪与板蓝根单独使用及等体积合用,在PK-15单层细胞上对猪细小病毒的抑制作用。【结果】板蓝根单独使用时,体外试验对PPV有明显的抑制作用,对PPV的最小直接杀灭质量浓度为0.63 mg/mL,最小阻断质量浓度为0.31 mg/mL;黄芪单独使用时对PPV无明显的抑制作用;板蓝根与黄芪等体积合用时,对PPV的抑制作用显著增强,最小直接杀灭质量浓度提高为0.31 mg/mL,最小阻断质量浓度提高为0.038 mg/mL。【结论】黄芪与板蓝根联合使用抗病毒能力增强,且毒性较弱。     

猪ESD真核表达质粒的构建及其抑制口蹄疫病毒复制的研究

[目的]探究猪ESD蛋白的抗病毒功能,通过构建猪ESD真核表达质粒,研究其是否能够抑制口蹄疫病毒在PK-15细胞中的复制。[方法]从PK-15细胞中提取总RNA,反转录为c DNA,PCR扩增出猪的ESD基因,构建到pc DNATM3.1/Myc-His A真核表达载体上。通过Western blotting和实时定量PCR检测ESD蛋白的表达情况及其抗病毒功能。[结果]获得了猪ESD真核表达载体,转染后能够正常表达。FMDV感染PK-15细胞后,ESD转录水平显著上调;过表达ESD蛋白显著抑制FMDV的复制;下调表达ESD蛋白显著促进FMDV的复制。[结论]猪ESD蛋白能够抑制FMDV在PK-15细胞中的复制。     

多角体包裹型猪α干扰素在昆虫细胞中的表达

为了获得多角体包裹的重组猪α干扰素,应用Bac-to-Bac昆虫细胞杆状病毒表达系统,将多角体蛋白基因和编码成熟猪α干扰素的基因分别构建到p Fast Bac Dual载体的PH、P10启动子下,以多角体蛋白H1α-螺旋序列为信号肽。将构建质粒转化DH10BacTM感受态细胞进行同源重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染Sf9昆虫细胞获得重组病毒。通过间接免疫荧光、Western-Blot证明,多角体蛋白与猪α干扰素实现共表达,在信号肽引导下猪α干扰素被包埋进多角体;用微量细胞病变抑制法检测显示,多角体包裹的猪α干扰素有抗病毒活性,效价达到5亿U/mg以上。应用在昆虫细胞中表达的多角体包裹型猪α干扰素,在临床上为猪病毒性疾病的防治与治疗奠定了基础。     

绍兴鸭α-干扰素基因克隆、表达及活性测定

采用PCR法从绍兴鸭的肝组织基因组DNA中扩增出α-干扰素基因,插入pUC18载体,进行序列测定及分析;将成熟α-干扰素基因亚克隆到表达载体pET-28α( )中,并转化入大肠杆菌BL21进行表达;表达产物经复性后,进行抗病毒活性的测定.测序结果表明,该基因(sxDuIFN-α)由576个核苷酸组成,共编码191个氨基酸.该基因与GenBank公布的鸭α-干扰素基因(X84764,AB128861)的核苷酸序列同源性分别为99.3%和99.1%,氨基酸序列同源性均为97.9%.表达载体经IPTG诱导表达出相对分子量为20.7 kD的DuIFN-α.该产物经细胞病变抑制法测定,显示出具有明显的抗猪水泡性口炎病毒(VSV)及鸭瘟弱毒疫苗毒的活性.     

鸡α干扰素真核表达载体的改造及在毕赤酵母中的分泌表达

旨在利用毕赤酵母密码子的偏好性和遗传简并性,将鸡α干扰素优化基因片段cIFN-α2连入毕赤酵母表达载体pPIC9k,再经重叠延伸PCR方法去除重组质粒的5′端非翻译区多余的8个核苷酸GGATCCAA,使其与毕赤酵母AOX1(醇氧化酶)的5′端非翻译区的序列完全一致,构建并筛选重组毕赤酵母,并进行摇瓶诱导表达试验。将表达产物用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测,并用微量病变抑制法检测其抗病毒效价。抗病毒活性检测结果显示,天然基因、优化基因、质粒5′端非翻译区改造后的优化基因重组质粒表达产物的抗病毒效价分别为10~5、10~6、1.5×10~6 U/mL。鸡α干扰素基因优化后的抗病毒效价提高了10倍,对质粒5′端非翻译区进行进一步改造后,表达蛋白的抗病毒活性提高了50%,从而为鸡α干扰素的工业化生产奠定了基础。     

猪α干扰素在毕赤酵母中的高效表达和纯化

为了研制新型的猪用抗病毒制剂,开展了猪α干扰素（PoIFNα）在毕赤酵母中的表达和产物纯化研究。将PCR扩增的PoIFNα基因插入pPIC9k的SnaBⅠ和EcoRⅠ位点,构建了表达转移载体pPIC9k/PoIFNα;经酶切和测序鉴定,转移载体构建正确。pPIC9k/PoIFNα以限制性内切酶SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母GS115菌株,经抗性筛选获得4拷贝PoIFNα基因的重组菌株GS115/PoIFNα;重组菌株经BMMY培养基诱导后上清中有目的蛋白,表达量达136 mg/L。表达产物经过SP-Sepharose 阳离子交换层析,可以得到纯度较高的rPoIFNα,纯化产物在MDBK细胞上抑制VSV的活性高达2.27×108 U/mg。     

嵌合猪圆环病毒的构建

[目的]为了构建猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)的嵌合病毒,并为PCV2疫苗研究奠定基础.[方法]以PCV1基因组为骨架,将其衣壳基因替换为PCV2衣壳基因,来构建嵌合猪圆环病毒(PCV1-2)DNA克隆,将PCV1-2 DNA克隆转染PK-15细胞以获得拯救病毒PCV1-2,并测定PCV1-2在PK-15细胞中的增殖特性.[结果]酶切和序列测定显示成功构建出PCV1-2 DNA克隆;免疫荧光试验和PCR检测显示成功获得拯救病毒PCV1-2,其效价达到1060 TCIDs0/mL以上;一步生长曲线显示PCV1-2在PK-15细胞中的增殖特性与其亲本病毒近似.[结论]成功构建了1种具有较高体外增殖能力的嵌合猪圆环病毒.