用探针杂交法检测鸡毒支原体和滑液囊支原体

根据鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)的16SrRNA基因序列，设计并合成了探针MG和MS共同目的基因，跨幅为580bP的一对引物。用这对引物对2个标准的MG和1个标准的Ms菌株DNA模板进行聚合酶锭反应(PcR)，结果得到了预期大小约580bP的PcR产物。回收纯化琼脂糖电泳凝肢中的MG扩增产物克隆至T载体中，DIG随机引物法合成核酸探针，斑点杂交试验对MG和MS均呈阳性，检测灵敏度分别为2ng和3ng，其它对照菌(毒)株为阴性。     

副鸡嗜血杆菌16 S rDNA PCR检测方法的建立

根据副鸡嗜血杆菌的16 S rDNA基因序列设计一对特异性引物XZIC1和XZIC2,对6株副鸡嗜血杆菌进行PCR扩增。结果显示,该对引物对6株副鸡嗜血杆菌均扩增出与预期大小相一致的282bp片段,而对鸡毒支原体、禽巴氏杆菌、鸡传染性支气管炎病毒、鸡新城疫病毒、大肠埃希菌、鸡白痢沙门菌、禽流感病毒(H9)、鸡喉气管炎病毒及葡萄球菌等9种病原体的扩增结果均为阴性。该PCR敏感性结果表明,本方法可以检测到10pg的副鸡嗜血杆菌DNA模板。采用引物XZIC1和XZIC2,对分别用副鸡嗜血杆菌ctcc253、ctcc255、ctcc257、ctcc269株感染SPF鸡的临床病料DNA进行PCR扩增,均可扩增出单一的282bp的片段。     

利用巢式PCR快速鉴定牛传染性鼻气管炎

为了快速检测牛传染性鼻气管炎,采用SDS-蛋白酶K法,提取病毒模板DNA。根据IBRV gB基因序列设计了1对特异引物,在其上下游引物的内侧又分别设计了1对引物,以这4条引物对IBRV模板进行扩增。结果成功扩增出预期目的片段,建立了巢式PCR检测方法。敏感性、特异性等检测试验结果表明该方法能特异检测IBR病毒。本方法具有快速、灵敏、特异的优点,适用于在牛及其遗传物质的进出口检疫中进行牛传染性鼻气管炎快速病原鉴定。     

用反转录聚合酶链反应检测禽呼肠孤病毒的研究

本文报告了建立反转录聚合酶链反应（ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ）检测禽呼肠孤病毒（ Ａ Ｒ Ｖ）的方法,根据禽呼肠孤病毒 Ｓ１１３３ 毒株 Ｓ１ 基因序列,设计合成两对引物,用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 技术对 ６ 株禽呼肠孤病毒国际标准株进进行了检测。结果两对引物对 ６ 株 Ａ Ｒ Ｖ 均可扩增出与预期大小相符 ５３２ｂｐ 和 ４３５ｂｐ 的 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 产物,而对其它 ６ 种禽病病原核酸的扩增结果均为阴性;该 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 可以检测出 １ｐｇ 的 Ａ Ｒ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 模板。     

鸭病毒性肝炎病毒、禽流感病毒和新城疫病毒三重PCR诊断方法的建立及应用

根据GenBank中已登录的鸭病毒性肝炎病毒（DHV）、禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒（NDV）的基因序列,设计了3对特异性引物,建立了DHV、AIV和NDV的多重PCR鉴别诊断技术,并对体系进行了优化和特异性、敏感性试验。结果表明,该体系所扩增的3种病毒基因片段大小分别为174bp（DHV）、264bp（AIV）和362bp（NDV）,且特异性、敏感性良好,能够分别检出1pg AIV、10pg DHV和10pg NDV的病毒RNA。对鸭临床样品的检测结果表明,该方法与病毒分离鉴定符合率90%以上,可用于临床样品的快速检测。     

应用巢式POR方法检测牛支原体肺炎

根据Genbank发表的牛支原体全基因序列,设计2对特异性引物,建立了诊断牛支原体肺炎的巢式PCR方法,第一轮引物P1、P2扩增片段长度为1912bp,第二轮引物P3、P4扩增片段长度为422bp：该方法特异性试验未扩增出丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体特异性条带;敏感性试验证明扩增DNA最低含量达到10—7Hg／mL,是单一PCR的10^3倍;用该方法对阳性病料进行检测,均扩增出特异性片段。该体系的成功构建,可以为牛支原体肺炎的活体检测,和流行病学调查提供技术支持。     

应用巢式PCR方法检测牛支原体肺炎

根据Genbank发表的牛支原体全基因序列,设计2对特异性引物,建立了诊断牛支原体肺炎的巢式PCR方法,第一轮引物P1、P2扩增片段长度为1912bp,第二轮引物P3、P4扩增片段长度为422bp:该方法特异性试验未扩增出丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体特异性条带;敏感性试验证明扩增DNA最低含量达到10-7μg/mL,是单一PCR的103倍;用该方法对阳性病料进行检测,均扩增出特异性片段。该体系的成功构建,可以为牛支原体肺炎的活体检测,和流行病学调查提供技术支持。     

鹅细小病毒和番鸭细小病毒双重PCR检测方法的建立

根据GenBank上登录的鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)基因序列,分别设计合成针对GPV非结构蛋白(NS)和MDPV NS2-VP1基因片段的2对引物GPV U/L和MDPV U/L,将GPV和MDPV提取核酸混合后作为模板,优化PCR反应条件,建立了能同时检测这2种病毒的双重PCR。特异性试验结果显示,引物GPV U/L仅特异性扩增出GPV-GZ1和GPV-GZ2株730bp核酸片段,引物MDPVU/L仅特异性扩增出MDPV的624bp核酸片段,双重PCR扩增出长度分别为730bp和624bp的2条特异性片段,而扩增鸭瘟病毒(DPV)和鹅副黏病毒(GPMV)的核酸扩增结果均为阴性。敏感性试验结果显示,双重PCR能同时检测到14.4pg的GPV核酸和28.8pg的MDPV核酸。结果表明,建立的双重PCR可用于GPV和MDPV的鉴别诊断和联合检测。     

禽白血病病毒B、E和J亚群基因芯片检测方法的建立

目的基于多重PCR技术,建立禽白血病病毒(ALV)的B、E、J亚群的基因芯片分型和检测方法。方法根据NCBI已收录的ALV三个亚群的参考毒株cDNA序列,在各亚群特异性基因突变区两端选取其保守区域,设计合成三个亚群的通用上游引物1条,以及B、E亚群的通用下游引物和J亚群下游引物各1条,将上述引物用Cy3标记,建立多重PCR体系;参考靶序列内部的三个亚群各自的保守区域,选择亚群之间基因突变位点多的区域,设计合成5条寡核苷酸探针,制作寡核苷酸探针基因检测芯片;以寄主细胞DF-1中提取传代ALV的cDNA,以及合成NCBI收录的各亚群参考毒株的cDNA序列作为检测模板;利用Cy3标记的PCR扩增产物,与基因芯片进行杂交反应,扫描结果。结果芯片准确检测并分型三个亚群的参考毒株,其检测灵敏度能够达到102个基因拷贝,且与禽类常见的四种病毒均无交叉反应。结论本研究结果证明,基因芯片技术是一种ALV的B、E和J亚群进行检测和分型的有效方法,且具有较高的特异性和灵敏度,为今后在临床应用中快速鉴别诊断ALV等免疫抑制病提供可行性。     

日本脑炎病毒套式RT-PCR方法的建立与初步应用

根据GenBank上登录的日本脑炎病毒(JEV)E基因序列,设计内外2对引物.以JEV疫苗株为模板,建立了检测猪JEV的套式RT-PCR方法.应用该方法对JEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为228 bp的目的片段;检出JEV-RNA的灵敏度约为0.3 pg.表明所建立的套式RT-PCR方法对JEV的检测敏感性高、特异性强.     

牛腺病毒7型PCR检测方法的建立

根据GenBank中牛腺病毒7型(BAdV-7)的蛋白酶基因序列,设计一对特异性的引物,扩增该序列中775 bp的片段,建立了BAdV-7的PCR检测方法.以Fukuroi株BAdV-7 DNA为模板进行特异性和敏感性试验,结果显示,该方法检测BAdV-7 DNA最小检测量为1ng;与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛冠状病毒(BCV)、牛轮状病毒(BRV)、牛呼吸道舍胞体病毒(BRSV)和鸡产蛋下降综合征病毒(EDSV)无交叉反应.方法为BAdV-7感染的临床诊断和流行病学调查奠定了基础.     

鸡传染支气管炎病毒H52、H120和M41株的PCR鉴别方法研究

根据GenBank发表的序列,对鸡传染性支气管炎病毒（IBV）H52、H120和M41株全基因组序列进行比较,设计并合成了两对特异性引物,其中一对引物能以M41株为模板,特异性扩增出1791bp的目的片断,从而特异鉴定IBVM41株;另一对引物能以H52株和H120株为模板,特异性扩增1700bp的目的片断,再用限制性内切酶NaeI对PCR产物进行酶切,H120株能够被切成1000bp和700bp两个片段,而H52株的PCR产物不存在该酶切位点,从而能区分H52株和H120株。本研究建立的PCR方法和技术具有快速、简单、特异性强等优点,可用于IBVH52、H120和M41株活疫苗的分子鉴别。     

Microarray-based detection and typing of foot-and-mouth disease virus

Foot-and-mouth disease virus (FMDV) is the most economically important veterinary pathogen because of its highly infectious nature and the devastating effects the virus has on the livestock industry. Rapid diagnostic methods are needed for detection and typing of FMDV serotypes and differentiation from other viruses causing vesicular diseases. We developed a microarray-based test that uses a FMD DNA chip containing 155 oligonucleotide probes, 35-45 base pair (bp) long, virus-common and serotype-specific, designed from the VP3-VP1-2A region of the genome. A set of two forward primers and one reverse primer were also designed to allow amplification of approximately 1100 bp of target sequences from this region. The amplified target was labelled with Alexa-Fluor 546 dye and applied to the FMD DNA chip. A total of 23 different FMDV strains representing all seven serotypes were detected and typed by the FMD DNA chip. Microarray technology offers a unique capability to identify multiple pathogens in a single chip.     

西尼罗病毒套式RT-PCR检测方法的建立

从GenBank上调取西尼罗病毒的基因序列,经过分析,设计并合成2套套式RT-PCR引物,分别对西尼罗病毒灭活苗进行扩增,结果扩增出与目的片段大小一致的条带,将其克隆入pMD18-T-Vector中,进行序列测定,证实为WNV的基因。建立了套式RT-PCR检测方法,经各反应条件的优化后,发现2套nest-PCR引物能分别扩增出85个拷贝和62个拷贝的双链DNA,对乙型脑炎病毒、黄热病毒等11种病毒核酸进行扩增,发现具有良好的特异性,显示建立套式RT-PCR具有高效、快速、特异、灵敏的特点,可用于口岸WNV的检测和监测。     

禽流感病毒与鸡细小病毒二重PCR检测方法的建立

为建立一种能同时鉴别诊断禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）和鸡细小病毒（chicken parvovirus,ChPV）的检测方法,本研究根据GenBank中AIV的M基因和ChPV的NS基因保守序列,分别设计并筛选出两对特异性引物,用于AIV和ChPV的检测。通过优化反应条件,建立了AIV和ChPV二重PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异好,能同时检测AIV和ChPV,对其他常见的禽病病原体均未反应;该法对AIV和ChPV的检测下限均为100 fg;对159份临床样品检测结果与PCR阳性产物测序结果一致。本研究建立的AIV和ChPV二重PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高的特点,对AIV和ChPV的防制具有重要意义。     

一步法RT-PCR检测禽呼肠孤病毒的研究

根据已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）S1133株S1基因序列，设计合成了一对扩增跨幅为532bp的引物。这对引物对ARV标准株，分离株以及人工感染SPF鸡跗关节组织抽提的核酸进行一步法RT-PCR扩增，即将反转录和PCR反应在一个PCR反应管中一次性完成。结果该方法对ARV4个标准株和5个分离株的扩增均获得了与预期大小一致的RT-PCR产物，而对照样品的扩增全为阴性；该方法最低可检测到0.16ng的ARV RNA，还可以直接从感染鸡关节组织抽提的核酸中检测到ARV RNA，表明该一步法RT-PCR对于ARV的检测是可行的。     

禽流感病毒和新城疫病毒二联RT-PCR检测方法的建立

参照国内外已发表的禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)的基因序列及其相关的RT-PCR检测方法,根据禽流感病毒M蛋白基因和新城疫病毒NP基因各设计一套特异性通用引物,扩增目的带分别为600bp和340 bp。通过对相关病毒检测,建立了AIV和NDV通用型二联RT-PCR检测方法。该方法具有快速、敏感、特异等优点,可为AIV和NDV的检测、流行病学调查及疫苗使用等奠定基础。     

Development of a Duplex PCR Assay for Detection of Avian Influenza Virus and Chicken Parvovirus

In order to establish a method to simultaneously detect avian influenza virus (AIV) and chicken parvovirus (ChPV),two pairs of specific primers were designed according to the sequences of AIV M gene and ChPV NS gene in GenBank. The duplex PCR assay was established by optimizing the reaction conditions.The tests showed that this method had high specificity, could simultaneously detect AIV and ChPV and no specific band was amplified for other subtypes avian pathogenic virus. The sensitivity result showed that the lower detection limit of this method was 100 fg. The results of 159 clinical samples were consistent with the sequencing results of PCR positive product. The double PCR methods for detection of AIV and ChPV established in this study had the characteristics of good specificity and high sensitivity, which was of great significance to the prevention control of AIV and ChPV.     

7种猪场常见高致死病原GeXP检测方法的建立

本研究旨在建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、坏死梭杆菌(Fn)和副猪嗜血杆菌(Hps)7种猪场常见高致死性流行病原的多重PCR检测方法。利用7种病原体的保守序列设计7对特异性引物,同时合成了Cy-5标记的通用引物。将通用引物分别连接到特异性引物的5′端形成7对特异性嵌合引物。优化反应条件,分别使用7组嵌合引物和通用引物混合,扩增7种病原的混合cDNA/DNA,验证其单重PCR的特异性。利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,混合7种嵌合引物和通用引物,扩增单一病原的cDNA/DNA,验证其多重PCR特异性;将其他常见猪病病原的基因组作为干扰的阳性标本,利用7对混合嵌合引物和通用引物进行多重PCR分析,扩增加入了阳性标本的混合模板,验证其多重PCR的抗干扰能力。利用重组质粒和体外转录的RNA进行梯度稀释,确定GeXP多重检测体系的灵敏度。结果表明,7种不同引物分别进行GeXP单重及多重检测,均能检测出特异性目的片段的信号,无明显的干扰片段信号出现;GeXP多重检测抗干扰试验结果显示,在混入3种干扰病原模板后,依然可同时特异性检测出7种病原;GeXP多重检测灵敏度分析显示,在10~3拷贝/μL浓度条件下能检测到7种不同基因的特异性结果。本研究建立的同时检测7种猪场常见高致死性流行病原的GeXP检测方法具有高通量、高特异性和高灵敏度的特点,为快速诊断猪流行性疾病的交叉感染和混合感染提供了新型的检测方法。     

H5、H9亚型禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断禽流感,根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成2对特异性引物,利用这2对引物对H5、H9亚型禽流感病毒的HA基因片段进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这2对引物能特异性地扩增出H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490bp和686bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。