广西猪增生性肠炎的PCR诊断

猪增生性肠炎(porcine proliferative enteropathy,PPE),又称猪回肠炎,是由胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis,LI)引起的接触性传染病[1].1931年首次报道,目前已经呈全球性流行,亚洲地区如台湾、日本、韩国等近年来也发现猪增生性肠炎;     

猪圆环病毒2型核酸疫苗的小鼠免疫保护试验

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)核酸疫苗在小鼠攻毒试验中的免疫保护效果,以PCV-2 GXWZ-1株为模板,扩增出ORF2基因及其截短基因8个片段(A(ORF2)、B(51-100aa)、C(101-150aa)、D(181-235aa)、E(151-200aa)、F(51-150aa)、G(101-235aa)、H(51-235aa)),将其插入到pcDNA3.0载体中,构建出真核表达质粒,并将其转染至PK-15细胞,用间接免疫荧光试验检测其瞬时表达情况。将试验小鼠随机分成9组,其中免疫组7组,阴阳性对照各1组,将纯化的真核表达质粒对小鼠进行组合免疫;二免后,用经处理过的PCV-2 GXWZ-2株阳性病料悬液腹腔注射免疫组和非免疫对照组小鼠,阴性对照组用生理盐水腹腔注射;其后进行体重记录、病理切片制作及PCR检测。结果表明:共有6个真核表达质粒成功在PK-15细胞中表达。在攻毒后的3周内,阳性对照组小鼠PCR诊断均为阳性;免疫组中,部分组小鼠在攻毒后第1周或在第2周为阳性,到第3周时各免疫组小鼠全部为阴性;阴性对照组始终为阴性。免疫组在病理保护学方面明显优于非免疫对照组,非免疫对照组的体重增长速率略低于免疫组和阴性对照组。由此可见猪圆环病毒2型核酸疫苗在小鼠攻毒试验中有明显的保护作用。     

猪胞内劳森氏菌GXNN株4个抗原性候选基因抗原性分析

参考GenBank上已发表的胞内劳森氏菌相关蛋白序列，设计了4对引物，分别扩增了4个抗原性候选基因（3个外膜蛋白基因和1个表面脂蛋白基因），并将4个抗原性候选基因构建好原核表达载体后进行原核表达、SDS—PAGE电泳和Western blotting分析。SDS—PAGE电泳检测初步确定重组融合蛋白pET32a—L10902、pET32a—L11022能够进行表达，分别得到53、37kDa的条带；Western blotting分析则初步确定pET32a—L11022具有抗原性。研究结果首次验证胞内劳森氏菌外膜蛋白基因是否具有抗原性，为诊断试剂盒及基因工程疫苗的研制提供理论基础。     

猪流感病毒的分离及NA基因的遗传进化分析

通过鸡胚接种分离到3株猪流感病毒,经HI、RT-PCR鉴定,其中GXHZ株为H1N2亚型毒株,GXLZ、GXXY株为H3N2亚型毒株,并对分离株进行EID50测定及GXHZ株的猪体攻毒试验。所扩增分离到3株SIV病毒NA基因与A/Sw/Hainan/1/2005(H1N2)的核苷酸和氨基酸序列同源性最高。3株SIV分离株的NA基因在氨基端胞浆尾区均由K6→R6,在非极性跨膜区均由V20→M20。系统发育分析表明本试验所分离的3个SIV毒株与H1N2亚型毒株亲缘性最相近,且来源于猪源H1N2亚型流感病毒。从时间上也发现,3个分离株的NA基因与1996年以后获得的H3N2毒株亲缘关系很近,都隶属于一个亚分支。     

猪流感病毒的分离及NA基因的遗传进化分析

通过鸡胚接种分离到3株猪流感病毒，经HI、RT-PCR鉴定，其中GXHZ株为H1N2亚型毒株，GXLZ、GXXY株为H3N2亚型毒株，并对分离株进行EID50测定及GXHZ株的猪体攻毒试验。所扩增分离到3株SIV病毒NA基因与A/Sw/Hainan/1/2005(H1N2)的核苷酸和氨基酸序列同源性最高。3株SIV分离株的NA基因在氨基端胞浆尾区均由K6→R6，在非极性跨膜区均由V20→M20。系统发育分析表明本试验所分离的3个SIV毒株与H1N2亚型毒株亲缘性最相近，且来源于猪源H1N2亚型流感病毒。从时间上也发现，3个分离株的NA基因与1996年以后获得的H3N2毒株亲缘关系很近，都隶属于一个亚分支。     

日本脑炎病毒套式RT-PCR方法的建立与初步应用

根据GenBank上登录的日本脑炎病毒(JEV)E基因序列,设计内外2对引物.以JEV疫苗株为模板,建立了检测猪JEV的套式RT-PCR方法.应用该方法对JEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为228 bp的目的片段;检出JEV-RNA的灵敏度约为0.3 pg.表明所建立的套式RT-PCR方法对JEV的检测敏感性高、特异性强.     

广西猪乙型脑炎病毒的分离及初步鉴定

【目的】了解广西猪乙型脑炎（JE）地方流行毒株特点,为有效防控广西猪JE奠定基础。【方法】对从广西各地猪场采集疑似JE病例猪的脑组织、流产胎儿、死胎、木乃伊胎、公猪精液、猪舍蚊子等靶组织样品进行猪乙型脑炎病毒（JEV）检测,并选择部分阳性样品进行JEV分离鉴定及病毒E基因遗传进化分析。【结果】在采集的465份JE疑似病料样品中,有72份为JEV阳性;通过接种BHK-21细胞、乳鼠及SPF鸡胚,分离获得两株JEV地方分离毒株,分别命名为GP株和LC株;遗传进化分析显示,GP株和LC株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.9%和99.8%;两株分离株与疫苗毒株SA14-14-2的核苷酸同源性分别为99.7%和99.9%,氨基酸同源性分别为99.4%和99.6%,且均属G III型JEV。【结论】广西受检猪群存在较严重的JEV感染,应引起重视并加强防控。     

广西猪戊型肝炎血清流行病学调查

为了解广西各地猪群戊型肝炎（HE）的感染状况及其流行特点，采用双抗原夹心ELISA检测来自广西11个市34个猪场及南宁市某屠宰场猪血清中的抗HEV抗体，并比较分析不同地区、不同年龄段猪抗HEV抗体阳性率的差异。结果表明，所检测的34个猪场均为抗HEV抗体阳性猪场；537份血清中有448份呈阳性，阳性率为83．4％；其中2月龄以内、3-4月龄和5月龄以上猪的抗体阳性率分别为74．0％、47．0％和95．5％，差异显著（P〈0．05）；广西各地区猪群抗HEV抗体阳性率均在70．0％以上，差异不显著（P〉0．05）。可见，广西猪群普遍存在HEV感染，且母源抗体消失后，猪群抗HEV抗体阳性率随着年龄增长而升高。     

胞内劳森菌人工感染猪的病理学观察

将猪源胞内劳森菌GXNN株在兔体传代,用感染兔肠道黏膜及内容物攻毒试验猪,成功复制出猪增生性肠炎,病猪表现为生长缓慢,腹泻,攻毒后12 d~17 d体温升高,肠系膜淋巴结肿大,回肠黏膜皱褶增厚等;病理组织学观察可见回肠有丰富的集合淋巴小结,回肠腺窝杯状细胞消失,部分腺窝上皮细胞增生,淋巴结内的淋巴小结数目增多。     

猪增生性肠炎模型的建立及其病理学研究

为了复制猪增生性肠炎病的模型并进行病理学观察,试验将临床检测胞内劳森菌为阴性的6～7周龄非免疫健康仔猪6头随机分为攻毒组(4头)与对照组(2头),攻毒组口服接种猪源胞内劳森菌GXNN株30 mL/头·次,对照组口服接种无菌稀释液30 mL/头·次.感染后分别于21天和56天剖杀感染组仔猪2头和对照组仔猪1头,观察病理变化并采集病变组织器官.结果表明:感染猪临床上出现短暂的体温升高、轻度腹泻等症状,粪便中检出胞内劳森菌.剖检可见腹股沟淋巴结及肠系膜淋巴结呈灰白色肿胀,肠系膜小血管扩张、充血;回肠黏膜褶皱呈脑回状;肝脏出现局部轻度淤血.组织病理学主要表现为猪回肠、结肠集合淋巴小结增多、增大,腺窝内杯状细胞消失,部分腺窝不成熟的上皮细胞增生,腺窝之间的周围组织有嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润;肝脏的窦状隙有局灶性出血,其他组织器官病变不明显.经过免疫组化和原位杂交试验可见回肠、结肠的腺窝内和腺上皮细胞的胞浆内有染成棕黄色或蓝紫色的菌体.