谷氨酸脱羧酶和谷氨酸脱氢酶基因的串联表达及其对GABA产量影响

为构建一株无外源L-谷氨酸(L-Glu)条件下可直接转化葡萄糖生产γ-氨基丁酸(GABA)的安全基因工程菌,将植物乳杆菌GABA合成途径的关键酶——谷氨酸脱羧酶基因gadB与L-Glu合成途径中的关键酶谷氨酸脱氢酶基因gdh进行串联表达,导入产谷氨酸菌株谷氨酸棒杆菌SF016中,检测其对L-Glu及GABA产量的影响。经摇瓶发酵40h重组菌SF016-pgg谷氨酸脱羧酶的酶活达0.63mol·min~(-1)·g~(-1),而谷氨酸脱氢酶的酶活达0.131mol·min~(-1)·g~(-1),比原始菌株提高了约2.0倍。重组菌SF016-pgg以葡萄糖为碳源,通过40h发酵罐发酵可积累产生23.12g·L~(-1)的GABA,说明串联表达gadB和gdh基因有效实现重组菌在以葡萄糖为单一碳源、无外源L-Glu存在的培养基中直接发酵生产GABA。该生产方式的成本明显降低,且产品的安全性高,可用于食品、饲料或医药等行业。     

发酵乳杆菌JN-2的分离鉴定及其发酵培养基优化

采用改良MRS固体培养基,利用稀释平板涂布法从健康奶牛新鲜粪便中分离筛选到一株肠道乳酸菌,经16S rDNA鉴定为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum),并暂命名为发酵乳杆菌JN-2。为提高发酵乳杆菌JN-2的生物量,首先单因素试验设计对碳源、氮源、微量元素的种类进行了优化,并进一步利用正交设计确定了最佳发酵培养基配方:葡萄糖30 g/L、酵母浸粉40 g/L、硫酸镁0.25 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、乙酸钠5 g/L、吐温-80 1 mL/L。在该优化发酵培养基下,发酵乳杆菌JN-2的菌体生物量吸光光度值达到1.79。     

重组大肠杆菌发酵表达菊酯类 农药降解酶培养基优化

通过单因素及正交试验,研究了碳源、有机氮源、无机氮源对重组大肠杆菌Eschericha.coli BL21(DE3)/ pET-28a-est825 菌体生长及产酶的影响,进而优化了产酶培养基,确定最佳培养基组成为院甘油20 g/L,酵母粉20 g/L,硫酸铵5 g/L,NaCl 5 g/L,Na2HPO4窑12H2O 10.7 g/L,KH2PO4 2.7 g/L,硫酸卡那霉素50 滋g/L,pH 7.0。采用此培养基 发酵所得发酵液酶活力较优化前提高了86%。     

一株高产γ-氨基丁酸短乳杆菌的筛选、鉴定及发酵优化

为了筛选高转化γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)乳酸菌新菌株,本研究以谷氨酸钠为底物,以110株分离自传统发酵食品和鸡肠道中的乳杆菌为研究对象,利用薄层层析和Berthlot比色法进行筛选,结果表明菌株S6-4为GABA高产菌株,产量为1.98 g/L。该菌株经API CHL 50生化系统和16S rDNA序列分析鉴定为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。同时对影响菌株S6-4转化GABA能力的各因素进行初步优化,最终确定:MRS培养基中以牛肉膏和酵母浸粉作为氮源,按1 mg/L(w/v)添加Vit B6和Vit C作为促生长因子,培养基初始pH为6.5,27℃条件下培养36 h,菌株S6-4转化GABA的产量达到4.05g/L,提高了105%。     

rhtB基因过表达苏氨酸工程菌发酵过程的优化控制

[目的]构建了负责运输苏氨酸至胞外的转运蛋白的关键基因rhtB过表达的苏氨酸发酵菌M122,考察不同的碳源、氮源及pH对该重组菌产L-苏氨酸的影响。[方法]选用不同的碳、氮源对L-苏氨酸生产菌株的发酵过程进行分析,对发酵培养基的碳、氮源及pH进行优化。[结果]定向改造后苏氨酸发酵菌对营养物质的利用效率增加,使用蔗糖作为碳源发酵时,摇床培养L-苏氨酸产量为28.1 g/L;以（NH4）2SO4或酵母粉作为氮源发酵时,L-苏氨酸产量分别为27.8和28.2 g/L,均优于使用其他氮源时苏氨酸的产量。对发酵的最适pH研究表明,中性条件下更有利于菌体的生长和L-苏氨酸的产生。[结论]确定了苏氨酸发酵菌M122的最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为（NH4）2SO4或酵母粉,最适pH为7.0。     

rhtB基因过表达苏氨酸工程菌发酵过程的优化控制(英文)

[目的]构建了负责运输苏氨酸至胞外的转运蛋白的关键基因rhtB过表达的苏氨酸发酵菌M122,考察不同的碳源、氮源及pH对该重组菌产L-苏氨酸的影响。[方法]选用不同的碳、氮源对L-苏氨酸生产菌株的发酵过程进行分析,对发酵培养基的碳、氮源及pH进行优化。[结果]定向改造后苏氨酸发酵菌对营养物质的利用效率增加,使用蔗糖作为碳源发酵时,摇床培养L-苏氨酸产量为28.1g/L;以(NH4)2SO4或酵母粉作为氮源发酵时,L-苏氨酸产量分别为27.8和28.2g/L,均优于使用其他氮源时苏氨酸的产量。对发酵的最适pH研究表明,中性条件下更有利于菌体的生长和L-苏氨酸的产生。[结论]确定了苏氨酸发酵菌M122的最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为(NH4)2SO4或酵母粉,最适pH为7.0。     

裂褶菌高产菌丝体发酵培养基的优化

【目的】探明裂褶菌高产菌丝体液体发酵培养基配方,为其菌丝体的批量生产及活性产物的开发提供依据。【方法】采用单因素及正交试验方法,通过摇瓶培养优化裂褶菌高产菌丝体发酵培养基中的碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉)、氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、土豆浸粉、大豆蛋白胨)及生长因子(维生素B₁、L-谷氨酸、α-萘乙酸、油酸、吲哚丁酸)。【结果】筛选出最优碳源(蔗糖)、氮源(牛肉膏)、生长因子(L-谷氨酸)进行正交试验的3个浓度水平(30 g/L、40 g/L和50 g/L,6 g/L、8 g/L和10 g/L,1.5 mg/L、2 mg/L和2.5 mg/L),各因子菌丝体的产量分别为16.10～19.56 g/L,13.26～14.53 g/L,9.40～9.78 g/L;裂褶菌高产菌丝体发酵培养基的优化配方为蔗糖50 g/L+牛肉膏8 g/L+L-谷氨酸2 mg/L+MgSO₄·7H₂O 1 g/L+KH₂PO₄ 2 g/L,pH 6.0。在此条件下裂褶菌菌丝体产量达21.51...     

利用重组枯草芽孢杆菌生产γ-氨基丁酸的研究

[目的]构建一株高产L-谷氨酸脱羧酶的重组枯芽孢杆菌B.subtilis 168/p HT01-gad A-pdx H。[方法]以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为宿主细胞,将大肠杆菌脱羧酶基因(gad A)与其辅酶磷酸吡哆醛的再生基因(pdx H)在质粒p HT01上串联表达,构建一株高产L-谷氨酸脱羧酶的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis 168/p HT01-gad A-pdx H。[结果]带有pdx H基因的重组菌B.subtilis 168/p HT01-gad A-pdx H催化谷氨酸生成γ-氨基丁酸(GABA)的效率明显高于B.subtilis 168/p HT01-gad A。催化反应24 h时,生成的GABA浓度达252 g/L,较对照菌株提高了61 g/L。进一步对重组菌B.subtilis 168/p HT01-gad A-pdx H全细胞转化谷氨酸生成GABA的条件进行了优化,其最优条件:转化缓冲液为p H 5.0的0.1 mol/L Tris-HCl,转化温度40℃,激活剂为5 mmol/L Ca~(2+)与5 mmol/L Mg~(2+)。在上述最优条件下,催化24 h生成的GABA浓度达327 g/L。[结论]所获得的重组菌转化效率较高,具有一定的工业化应用前景。     

基于响应曲面法优化桑黄黄酮发酵条件

桑黄是一种珍贵的药用真菌,通过响应面分析法对桑黄的发酵培养基进行优化,进而提高该菌株黄酮类活性物质的产量。利用不同碳源、不同氮源对桑黄进行液体发酵,测定胞内黄酮产量,筛选出最佳种类的碳源和氮源。进一步通过单因素试验考察不同浓度碳、氮源及培养基初始pH值对胞内黄酮产量的影响。利用响应面分析法对桑黄黄酮发酵培养基进行优化,获得黄酮产量最高的培养基组合。结果表明,桑黄产黄酮的最佳碳源是麦芽糖,最佳氮源是酵母提取物。优化后黄酮发酵培养基中的麦芽糖浓度为46.5 g/L,酵母提取物浓度为6.0 g/L,培养基初始pH值为4.32,优化后培养基黄酮产量达到(65.3±2.5) mg/L。获得了桑黄黄酮发酵的最佳培养基,为进一步研究桑黄黄酮生物合成调控以及提高桑黄黄酮含量奠定了基础。     

云芝产漆酶发酵条件的正交试验筛选

利用正交试验设计对影响云芝(Trametes versicolor)菌株HS-03产漆酶的7种单因素发酵条件进行系统优化.结果表明,培养基中碳源和氮源用量、培养基初始pH值、培养基体积等因子对该云芝漆酶产量均有明显的影响,云芝HS-03摇瓶产漆酶的最佳发酵条件为:葡萄糖7.5 g/L,酵母浸出液6 g/L,培养基初始pH值4.5,培养基初始体积70 mL(250 mL三角瓶).同时培养基中含有2 mL/L Tween-80、2 mL/L愈创木酚、终浓度为0.5 mmol/L的Cu2+.     

高产γ-氨基丁酸乳酸菌菌株的筛选及诱变育种研究

以乳酸菌作为出发菌株,将其接入豆浆(大豆?水=1?8)进行发酵,根据发酵过程中γ-氨基丁酸(GABA)产量,筛选出GABA的高产乳酸菌菌株,然后利用紫外线对高产菌株进行诱变处理,筛选得到稳定高产GABA突变菌株.结果表明,保加利亚乳杆菌L2为高产GABA乳酸菌菌株,GABA产量达到1.066 g·L-1.对L2进行紫外诱变处理的最佳照射时间为50 s,在此照射时间下,获得高产GABA突变菌株L2-4,其在含有1% L-谷氨酸的改良MRS培养基和豆浆中的GABA产量分别为4.235和1.394 g·L-1,比原菌株的GABA产量分别提高了25.63%和30.77%     

富含γ-氨基丁酸酸奶的研制

从实验室保藏的可用于酸奶制品的菌种出发,筛选出2株可以在牛奶中发酵谷氨酸生成GABA的菌株嗜热链球菌gm-12和嗜酸乳杆菌gm-11,并对菌种添加比例进行优化,当其添加比例为1:5时产GABA的量达到最高为5.62 g/L。并且根据不同产品的需要优化了其发酵条件,当制备酸奶制品时采用24 h发酵,此时谷氨酸钠最佳添加量为1.5 g/L,GABA的产量为1.33 g/L;当制备酸奶饮品时采用72 h发酵,此时谷氨酸钠最佳添加量为6.0 g/L,此时GABA的产量为4.78 g/L,并且由该条件生产的酸奶产品评价良好。为富含GABA酸奶产品的开发奠定了基础。     

固定化唾液链球菌的酶学性质研究

以海藻酸钙为载体包埋唾液链球菌嗜热亚种Y-2的菌体细胞,对固定化细胞催化合成γ-氨基丁酸进行了较详细的研究。研究结果表明:固定化细胞谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)反应的最适温度为40℃,同时具有良好的温度稳定性。固定化细胞酶活最适反应pH为3.8。细胞经固定化后pH稳定性明显增加,GAD酶活回收率普遍高于游离细胞。0.1%Triton X-100具有较强的酶活促进作用。固定化细胞的GAD在酶促反应中并不存在底物抑制现象。在上述最优条件下进行菌体生产力测试,固定化细胞转化L-谷氨酸单钠盐11 h后,转化液γ-氨基丁酸的浓度达到了2.79 g/L。     

发芽粟谷中谷氨酸脱羧酶的主要酶学性质初探

[目的]探讨发芽粟谷[Setaria italica（L.）Beauv.]中谷氨酸脱羧酶（GAD）的主要酶学性质。[方法]以发芽粟谷为试材,研究发芽粟谷GAD的活性及其主要酶学性质。[结果]发芽粟谷GAD最适温度为40℃,其耐热性较差,32℃保温1 h后其酶活保持率为86.3%;发芽粟谷GAD最适pH值为5.5,在pH值5.0～5.5范围内酶活保持率在80.0%以上;发芽粟GAD对Glu的Km为22.36mmol/L,Vmax为2.28μmol/min;Ca2＋、Mg2＋、Li＋、PLP和VB6对发芽粟谷GAD活力具有促进作用,而Zn2＋、La3＋、Cu2＋起抑制作用,Mn2＋、Na＋、Fe2＋和EGTA则无显著影响。[结论]该研究可为利用发芽粟谷内源GAD富集GABA提供理论依据。     

L-乳酸生产菌干酪乳杆菌6028液体发酵条件的研究

[目的]寻求干酪乳杆菌6028发酵产酸的最佳条件。[方法]以干酪乳杆菌6028为试验菌种,经斜面培养基、筛选培养基、种子培养基、发酵培养基培养后进行液体发酵,研究碳源、氮源、硫酸镁、磷酸氢二钾、乙酸钠、发酵温度和发酵时间对干酪乳杆菌6028 L-乳酸产量的影响。[结果]当培养基中葡萄糖、氮源、无水乙酸钠、MgSO4.7H2O含量分别为14%、3.75%、0.5%、0.02%,发酵温度为34℃、发酵时间为96 h时,L-乳酸产量最高。在此条件下,L-乳酸的产量达到97.03 g/L。[结论]干酪乳杆菌6028的最佳培养基组成为:葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、无水乙酸钠、MgSO4.7H2O、MnSO4.7H2O、碳酸钙分别为140、15、15、7.5、5、0.2、0.05、100 g/L、吐温-80 1 ml、pH值6.8。最佳发酵时间和温度分别为96 h、34℃。     

南阳酵子中乳酸菌的分离鉴定及性能研究

采用MRS培养基纯培养的方法从南阳酵子中分离出6株乳酸菌,通过生理生化反应、形态学观察和16S rDNA测序进行鉴定,对分离菌株的生长性能、产酸性能、人工胃液的耐受性和耐胆盐性能进行研究。结果表明：从5个样品中分离到6株乳酸菌分别为发酵乳酸杆菌(Limosilactobacillus fermentum)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)和食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)。其中,I-8发酵乳酸杆菌(Limosilactobacillus fermentum)产酸性能、人工胃液耐受性和耐胆盐性能最高,具有一定的应用开发潜力。     

纤维床固定化酪丁酸梭菌发酵木薯渣水解液生产丁酸的研究

[目的]研究纤维床固定化酪丁酸梭菌发酵木薯渣水解液生产丁酸的可行性。[方法]以酪丁酸梭菌为生产菌株,初步优化了木薯渣的水解条件,并开展了纤维床固定化生物反应器半连续发酵木薯渣水解液生产丁酸的研究。[结果]加压条件下,稀酸水解木薯渣的总还原糖得率达到0.56 g/g。酪丁酸梭菌能有效利用葡萄糖、木糖进行单糖或混合糖发酵生产丁酸;固定化补料流加发酵有利于提高丁酸的产量和得率,降低副产物乙酸的产量和得率;以木薯渣水解液用于固定化批次发酵生产丁酸时,丁酸的产量和得率均较高,分别为(23.20±1.32)g/L和(0.44±0.01)g/g。[结论]木薯渣水解液对丁酸生产菌的生长和代谢没有明显的抑制作用,发酵各参数指标均能达到利用葡萄糖时的同等水平,可作为未来微生物发酵工业化生产丁酸的廉价原料来源。     

定向突变谷氨酸脱羧酶及其生物合成γ-氨基丁酸的研究

γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸,它由谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸脱羧生成,作为抑制性神经递质具有广泛的应用。天然的谷氨酸脱羧酶只在酸性环境时有活性,这与菌体的生长环境不一致,不利于一步发酵法生产GABA。针对该问题,对来自大肠杆菌AS1.505的谷氨酸脱羧酶(Gad B)进行定向突变,构建了3个表达载体p ET28a(+)-Gad B、p ET28a(+)-Gad Bm1和p ET28a(+)-Gad Bm2,研究了3株重组菌生物转化谷氨酸合成GABA的情况。结果显示,在中性缓冲液中转化72 h,DE3(p ET28a(+)-Gad Bm1)和DE3(p ET28a(+)-Gad Bm2)转化合成GABA分别是对照菌DE3(p ET28a(+)-Gad B)的3.2和4.6倍。在M9培养基中培养72 h,DE3(p ET28a(+)-Gad Bm1)和DE3(p ET28a(+)-Gad Bm2)分别合成4.32 g/L和4.65 g/L GABA,比对照菌分别提高了1.17和1.34倍。实验结果证明,定向突变的Gad B能在中性p H条件下有效催化谷氨酸脱羧合成GABA。     

低能离子修饰技术在L-乳酸菌诱变中的应用

采用离子修饰技术对一株产L-乳酸的米根霉菌P988进行诱变处理。结果表明,在离子注入能量为10 keV,剂量为50×2.6×1013ions/cm2时,诱变效果较好,从正变菌株中反复筛选,得到一株产酸量高的菌株PN2207,产酸量达110 g/L,比出发菌株提高了23%,经过连续传代试验,其遗传性状稳定;并对其发酵条件如碳氮源和CaCO3进行研究,在含糖150 g/L的摇瓶中发酵,其L-乳酸产量达110 g/L。     

产D-乳酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵工艺研究

[目的]筛选适合德氏乳杆菌保加利亚亚种的生长条件。[方法]以德氏乳杆菌保加利亚亚种为出发菌株,研究该菌株在不同条件下的生长情况。[结果]德氏乳杆菌保加利亚亚种最适生长温度为42℃,最适p H为6.5,最适发酵时间为72 h;代谢生成D-乳酸的适宜发酵条件为葡萄糖添加量7%、接种量10%、装液量125 m L/250 m L,在上述条件下发酵该菌种,D-乳酸产量达37.8 g/L。[结论]试验结果为德氏乳杆菌保加利亚亚种产D-乳酸条件摸索及生产应用提供了参考。