鸡传染性腔上囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

为了深入研究鸡传染性腔上囊病病毒（IBDV）VP2基因的结构和功能,利用Bac-to-Bac系统研制出含有VP2基因的重组杆状病毒rBac-VP2,将rBac-VP2感染Sf9细胞,并用抗IBDV VP2特异性单克隆抗体经间接免疫荧光试验检测,证实感染重组病毒Sf9细胞能高效表达IBDV VP2基因产物;Western-blotting分析结果表明,VP2基因表达产物的分子质量约为40 ku.     

传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆与原核表达

根据GenBank已登录的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP5基因序列,设计合成了一对VP5基因特异性引物,应用RT-PCR技术从IBDV标准毒株中扩增得到VP5基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-1-VP5,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,IBDV VP5基因在大肠埃希菌BL21中得到了正确表达,所表达的融合蛋白与IBDV阳性血清具有特异性抗原抗体反应。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因真核细胞表达载体的构建及免疫应用研究

应用DNA重组技术将含有IBDV保护性抗原VP2质粒,以EcoRI、xhoI酶切,将酶切得到的VP2基因移入到载体poDNA3CMV启动子下游,得到含有IBDV VP2基因的真核表达载体poD-VP2基因疫苗.pcDVP2体外转染细胞能正确表达目的蛋白.免疫雏鸡后20 d,在体内可检测到特异性抗体.     

传染性法氏囊病病毒VP2基因真核细胞表达载体的构建及免疫应用研究

应用DNA重组技术将含有IBDV保护性抗原VP2质粒，以EcoRI、xhoI酶切，将酶切得到的VP2基因移入到载体pcDNA3CMV启动子下游，得到含有IBDV VP2基因的真核表达载体pcD-VP2基因疫苗。pcDVP2体外转染细胞能正确表达目的的蛋白，免疫雏鸡后20d，在体内可检测到特异性抗体。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP5的原核表达、多抗制备及初步应用

传染性法氏囊病（infectious bursal disease virus,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）引起的一种主要危害雏鸡的急性传染病。在IBDV编码的5个蛋白中,VP5是IBDV唯一可以缺失基因的蛋白。本研究克隆了IBDV优势流行毒株的VP5蛋白编码基因,利用原核表达系统表达了VP5蛋白,通过免疫BALB/c小鼠制备VP5多抗,并对多抗进行了鉴定和检测不同IBDV毒株的应用。结果显示,IBDV优势流行毒株的VP5蛋白实现了可溶性表达,分子质量约为17 kDa;制备的VP5多抗特异性良好,ELISA效价可达1:64 000;VP5多抗可通过IFA和Western Blot检测识别IBDV rHLJ0504-HT株,不识别VP5基因缺失株。结果表明：试验成功表达了IBDV优势流行毒株的VP5蛋白,并制备了VP5多抗;VP5多抗可对IBDV及其VP5编码基因缺失毒株进行鉴别检测。本研究对于IBDV检测方法的建立以及VP5编码基因功能的进一步研究提供了物质基础。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因在家蚕中的表达

传染性法氏囊病病毒（IBDV）能引起以淋巴细胞衰竭为特征的抑制性疾病。IBDV的主要结构蛋白VP2蛋白是主要的宿主保护性抗原，在VP2上的点突变是造成IBDV抗原漂变的主要原因。为研究VP2作为IBDV亚单位疫苗的潜力，本实验将IBDV JD1株的VP2基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，将重组载体pBacPAK-VP2与病毒Bm-Bac-PAK6的线性化DNA共转染家蚕培养细胞，获得重组病毒BacPAK-VP2。DIG点杂交表明重组病毒基因组中含有VP2基因。重组病毒感染家蚕5龄幼虫后，用ELISA、SDS－PAGE和Western blotting检测蚕血淋巴中重组VP2蛋白的相对表达量及免疫反应性。结果表明重组VP2蛋白具有免疫反应性，感染后5－6d在蚕血淋巴中的表达量最高。     

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒洛阳分离株VPP2基因的原核表达及鉴定

根据GenBank公布的鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列,设计合成1对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vv IBDV)洛阳分离株LY1的VP2基因并进行克隆,构建重组质粒p MD18-T-VP2,然后连接至原核表达载体p ET32a,将阳性质粒转化至感受态细胞Rosetta中进行诱导表达。SDS-PAGE结果显示VP2基因在大肠杆菌Rosetta细胞中实现融合表达,蛋白大小约66 ku,且主要存在于细胞上清中,Western blot试验证实表达的VP2蛋白具有较好的反应原性。研究结果可为IBDV的诊断抗原及基因工程疫苗研究奠定基础。     

利用杆状病毒表达系统表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白

从GenBank下载传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列,根据昆虫细胞偏爱密码子对IBDV VP2基因进行密码子优化,化学合成优化后的VP2基因序列,然后构建杆状病毒表达载体pTri Ex-4-VP2,构建成功的重组杆状病毒pTri Ex-4-VP2转染sf9细胞,制备病毒原种,采用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定VP2的免疫原性。结果显示:细胞感染Bac-VP2后,其细胞裂解蛋白在58 ku附近有1个条带,且该条带与IBD阳性血清发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示VP2基因能在Sf9细胞中表达;动物攻毒保护试验中,2次免疫重组VP2蛋白后能诱导14日龄SPF鸡产生对IBDV强毒攻击,保护率为60%。本研究为进一步研究IBDV VP2基因工程疫苗提供了物质基础。     

传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白VP2、VP1和VP2-VP1串联基因的原核表达及其初步应用

为获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)特异性抗体检测用抗原VP2、VP1及VP2-VP1蛋白,分别设计引物扩增IBDV野毒株NN1172的VP2和VP1基因,并扩增VP2和VP1基因中抗原性和亲水性较好的重要区域,通过PCR扩增基因串联方法对截短的VP2和截短的VP1基因进行串联,首次获得VP2-VP1串联基因,并对VP2、VP1和VP2-VP1串联基因进行了原核表达和鉴定。结果成功构建了原核表达载体pET-VP2、pET-VP1和pET-VP2-VP1;诱导表达条件显示,3个重组质粒分别转入BL21菌株后经0.05 mmol/L IPTG诱导表达,分别得到分子量为69、114和63 kDa的VP2、VP1和VP2-VP1重组蛋白,且均以包涵体形式表达,3个重组蛋白分别于诱导后5、3和6 h时表达量最多。Western blot结果显示,表达的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白与鸡抗IBDV阳性血清均具有良好的反应原性。以纯化的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白作为包被抗原对传染性支气管炎病毒(IBV)、呼肠孤病毒(ReoV)、禽白血病病毒(ALV)和新城疫病毒(NDV)4种阳性血清检测均为阴性,表明所获得的纯化蛋白具有高度的特异性;对免疫了IBD灭活疫苗,IBD基因工程疫苗和IBD弱毒疫苗的商业鸡群进行抗体检测,结果均能显示疫苗免疫后机体抗体水平的变化趋势。本研究表明利用该原核表达系统所表达的3个蛋白均具有良好的免疫反应活性,为IBDV特异性抗体的检测和新型亚单位疫苗的研发奠定基础。     

表面展示传染性法氏囊病病毒VP2蛋白细菌样颗粒的构建与鉴定

为构建表面展示传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)VP2蛋白的细菌样颗粒(bacterium-like particies, BLPs),试验分别克隆VP2基因和乳酸乳球菌肽聚糖锚钩蛋白(protein anchor, PA)基因片段,通过融合PCR技术构建VP2-PA融合基因,利用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统构建重组杆状病毒rBV-VP2-PA,将表达产物与裸露BLPs共孵育,在PA的介导下,构建表面展示IBDV VP2蛋白的细菌样颗粒(BLPs-VP2);依次采用透射电镜观察、SDS-PAGE、Western-blot、间接免疫荧光对BLPs-VP2进行鉴定。结果表明：VP2蛋白获得成功表达并展示于BLPs表面,可与IBDV阳性血清发生特异性结合,1 U(2.5×10⁹颗粒)BLPs最大可负载约107μg VP2-PA融合蛋白。说明构建的IBDV VP2蛋白BLPs可用于传染性法氏囊病(IBD)新型亚单位疫苗的研发。     

鸡传染性法氏囊病病毒BC6/85株VP2基因的原核表达、纯化及鉴定

为获得可用于鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体检测的重组抗原VP2蛋白,根据GenBank中发表的IBDV VP2序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV经典标准攻毒株(BC6/85株)的VP2基因,插入质粒pET-32a中构建重组表达质粒pET-32a-VP2,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western-blot检测表明具有良好的反应原性。本研究为下步建立IBDV抗体的间接ELISA方法及新型疫苗的研制奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析

从辽宁省某鸡场分离到一株传染性法氏囊病病毒(IBDV)。以该毒株基因组核酸为模板,应用RT-PCR扩增得到VP2基因,构建表达质粒pET28a-VP2,再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析在48ku处出现特异性蛋白条带;经Western blot分析VP2蛋白可以与IBDV阳性血清发生特异性反应。用VP2蛋白制备的油乳剂疫苗免疫接种SPF鸡,2周后体内可以检测到特异性抗体。证明VP2蛋白具有重要的应用价值,为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒VP2/VP0基因在重组鸡痘病毒中的表达

以鸡痘病毒复制非必需区ＴＫ基因为侧翼,在牛痘病毒Ａ型包涵体晚期启动子（ＡＴＩ）与１６个串联的突变型早期痘苗病毒ｐ７．５启动子组成的复合启动子的下游,分别插入编码传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）结构蛋白ＶＰ２和ＶＰ２－４－３（ＶＰ０）的基因片段后,进行了同源重组和蓝斑筛选,获得２株重组病毒ｖＵＴＡＬａｃＶＰ２－７和ｖＵＴＡＬａｃＶＰ０－１０。经ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表明,重组病毒ｖＵＴＡＬａｃＶＰ２－７能表达ＶＰ２,ｖＵＴＡＬａｃＶＰ０－１０能表达ＶＰ２和ＶＰ３,ＶＰ２和ＶＰ３的Ｍｒ分别为４１０００和３２０００。     

传染性法氏囊病病毒超强毒HZ株和XN株VP2基因的克隆和序列比较

根据已发表的５２／７０株ＩＢＤＶ基因组序列,设计并合成了一对特异扩增ＩＢＤＶ ＶＰ２基因的引物。以陕西地区分离的ＩＢＤＶ野毒ＸＮ株,ＨＺ株为材料,以其基因组为模板利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出了１．５ｋｂ的ｃＤＮＡ产物,将ＶＰ２基因克隆于ＰＵＣ１１９质粒上,得到重组ＰＵＣ１１９质粒。     

甘草酸二钾抗鸡传染性法氏囊病毒机制初步研究

建立体外CEF培养模型,分为空白细胞对照组、甘草酸二钾（DG）组（药物组）、IBDV组（阴性对照组）和利巴韦林组（阳性药物对照组）,利用间接免疫荧光技术和荧光定量PCR技术以及蛋白质免疫印迹技术检测DG对IBDV VP1基因和蛋白表达的影响.结果表明,在IBDV复制过程的分子机制中,DG对IBDV VP1基因、蛋白表达有显的抑制作用,是DG发挥抗IBDV功效的主要机制之一.     

传染性法氏囊病病毒VP2与C3d串联基因重组表达质粒的构建及其免疫功能研究

为提高传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因核酸疫苗的免疫效力,本研究根据已发表的鸡源补体C3d序列,设计并合成在5’端添加编码连接肽(Gly4Ser)2序列的C3d基因。用同尾酶BglⅡ和BamHⅠ构建含有3拷贝C3d与VP2基因融合的重组表达质粒pcDNA-VP2-3C3d。用脂质体法转染BHK21细胞,48 h后,westernblot分析表明,表达的重组蛋白为162 ku;间接免疫荧光试验检测转染细胞中具有特异性荧光。用pcDNA-VP2-3C3d与前期构建的pcDNA-VP2分别免疫2周龄SPF鸡,二免14 d后,间接ELISA法检测IBDV抗体效价,pcDNA-VP2-3C3d组抗体水平显著高于pcDNA-VP2组;MTT法检测鸡脾淋巴细胞增殖活性,pcDNA-VP2-3C3d组免疫诱导的特异性淋巴细胞增殖活性显著高于pcDNA-VP2组(p<0.05)。本研究表明C3d可以增强VP2基因免疫诱导的IBDV特异性体液和细胞免疫应答。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP3蛋白的原核表达及其B细胞抗原表位鉴定

为鉴定鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP3蛋白中的B细胞抗原表位,本研究将IBDV的VP3基因亚克隆于pET-28a中,构建了表达重组质粒pETVP3,经IPTG诱导在E.coli BL21(DE3)中表达了重组蛋白(rVP3).Western blot鉴定表明,rVP3能被IBDV抗血清特异性识别.同时,根据IBDV VP3的氨基酸序列,合成覆盖VP3全序列的重叠多肽,并与载体蛋白BSA藕联制备多肽人工结合抗原.Peptide-ELISA和Dot-ELISA检测结果表明VP3中有2个线性表位可以被已制备的单克隆抗体(MAb)识别,即~(728)PRDWDRLPYLNL~(739)和~(982)PKPKPKPNAPTQ~(993);Dot-ELISA结果显示,在VP3中还存在另外4个线性多克隆抗体识别位点:~(818)SLANAPQAGSKSQRA~(831),~(851)QREKD TIUSKKMETMGIYFATP~(872),~(876)ALNGHRGPSPGQLKYWQNTREI~(897)和~(961)QMKDLLLTAMEMK~(973).这些抗原表位的鉴定为开发IBD表位疫苗奠定了基础.     

传染性法氏囊病病毒JS株VP2基因真核表达载体的构建及其应用

应用RT-PCR方法从鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)JS株中扩增出VP2基因,并克隆入T-easy载体。序列测定分析结果表明IBDVJS株的VP2基因与国际标准强毒株的核苷酸序列同源性达98%,氨基酸序列同源性达99%以上。随后将VP2基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1/zeo( ),构建成功真核表达质粒pcD-VP2,pcD-VP2体外转染COS-1细胞,能在COS-1细胞中表达。利用pcD-VP2质粒进行动物实验,结果表明雏鸡免疫14d后在体内可检测到特异性抗体,pcD-VP2的真核表达质粒二次免疫诱导鸡产生对IBDV强毒攻击的保护率为67%,这一结果提示VP2基因具有重要开发应用价值。     

表达传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护性研究

以脂质体转染技术构建了表达鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）ＶＰ２基因的重组鸡痘病毒ＦＰＶ－ＶＰ２，该病毒在鸡胚成纤维细胞及鸡体内均能稳定产生子代病毒，经翅皮下５×１０５ＰＦＵ／羽免疫１日龄ＳＰＦ鸡，免疫后４周以１００ＬＤ５０／羽ＩＢＤＶ超强毒株Ｇ株攻毒，获得了５／６的保护，但不能有效预防临床发病及法氏囊受损萎缩。实验结果证明了ＶＰ２是ＩＢＤＶ的宿主保护性抗原，提示Ｔ细胞介导的免疫可能在ＩＢＤＶ的免疫中起着较为重要的作用。本研究为ＩＢＤＶ重组病毒疫苗研制进行了有益探索。