慢病毒法生产转基因鸡的初步研究

[目的]探索利用慢病毒生产转基因鸡的适宜方法。[方法]以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建慢病毒载体,包装病毒后感染鸡早期受精卵,并检测不同注射操作和不同接种滴度对鸡胚存活率的影响,同时对接种病毒鸡胚的GFP表达情况进行检测。[结果]采用105、106和107IU/ml的慢病毒滴度,鸡胚孵化率分别为87%、72%和66.7%。以雏鸡血液基因组为模板PCR鉴定转基因阳性率为45.5%;冰冻切片技术发现GFP基因在鸡体内不同组织的表达强度差异显著,免疫系统内表达最强,生殖系统和肌肉组织中GFP基因无表达。[结论]试验初步筛选出较适宜的慢病毒感染滴度,该结果为研制蛋鸡生物反应器和转基因鸡抗病新品系奠定了基础。     

睾丸注射慢病毒生产转基因鸡的研究

【目的】采用睾丸注射慢病毒的方法生产转基因鸡以提高转基因效率,使转基因鸡的批量生产变得简单可行。【方法】用磷酸钙沉淀法包装慢病毒,对慢病毒包装体系中的质粒总量和HN Buffer的pH值进行优化,以包装出滴度较高的慢病毒;然后将慢病毒注射到受精鸡蛋的胚胎中验证其活性;最后,将慢病毒注射到8日龄公鸡的睾丸内,待其性成熟以后,将精液DNA呈阳性的公鸡与非转基因母鸡进行交配生产出转基因鸡。【结果】当90mm培养皿中质粒总量为50μg、HN Buffer的pH值为7.05时慢病毒的包装效率最高,在该条件下包装出的慢病毒滴度高达7.5×107 TU/mL;采用慢病毒胚胎注射途径成功地生产出增强绿色荧光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP)转基因鸡;采用慢病毒睾丸注射途径生产的转基因鸡后代中能检测到eGFP目的基因,但未检测到其相关的表达。【结论】慢病毒睾丸注射途径能够将外源基因整合到精原干细胞中,并遗传给后代。     

莪术油注射液鸡胚接种抗新城疫病毒的研究

[目的]探讨莪术油对新城疫病毒的抑制和杀灭作用。[方法]用鸡胚培养法和血凝试验,测定莪术油对鸡新城疫病毒增殖的抑制作用。[结果]莪术油对鸡胚无毒性作用;莪术油与病毒同时接种鸡胚,能完全抑制鸡新城疫病毒在鸡胚中的增殖。[结论]结果为莪术油在兽医临床上的应用提供了理论依据。     

鸡传染性支气管炎病毒HN99株的分离与鉴定

【目的】分离鸡传染性支气管炎病毒河南地方株,并对其进行鉴定。【方法】采用鸡胚盲传,观察病毒对鸡胚的致病作用;通过酶处理、病毒干扰试验、动物回归试验、理化试验等研究病毒的特性;利用电镜观察病毒的形态,应用RT-PCR方法扩增分离毒株的S1和N基因片段。【结果】病毒盲传至第2代后鸡胚出现死亡和侏儒胚,将病毒盲传至第8代时,病毒的毒力逐渐由104.0增强到107.2;经质量分数1%胰酶处理或用磷酸酯酶C处理的病毒液能够明显凝集质量分数1%鸡红细胞,血凝滴度分别在29和27左右;病毒能够干扰NDV在鸡胚中的增殖,单独接种分离毒株的尿囊液HA滴度平均为20,先接种HN99毒株再接种NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为23,同时接种HN99毒株和NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为28.5,单独接种NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为29;病毒可致SPF雏鸡发病,引起肾脏肿大、花斑肾、尿酸盐沉积等肾脏病变;该毒株对乙醚和氯仿敏感,耐酸不耐碱,对热敏感;病毒粒子直径90~105 nm;扩增到了分离毒株S1基因片段大小为1 739 bp(含前导序列),N基因全长为1 230 bp,通过与其他IBV毒株进行系统进化分析,证明分离毒株与其他毒株的亲缘关系较远。【结论】初步证实分离的病毒为肾型鸡传染性支气管炎病毒,命名为HN99株。     

慢病毒介导多短发卡RNA串联载体构建与体内外抗口蹄疫效果评估

【目的】探讨应用多短发卡RNA(shRNA)串联沉默口蹄疫病毒RNA复制的可行性.【方法】针对口蹄疫病毒(Foot and mouth disease,FMDV)非结构蛋白基因3B和3D保守区域设计合成3个shRNA的串联片段,并分别用3个不同序列的启动子引导,成功构建了3shRNA串联的慢病毒RNAi载体.利用慢病毒3质粒包装系统共转于293T细胞包装成慢病毒颗粒.利用包装的慢病毒处理细胞及乳鼠,并接种FMDV,观察FMDV抑制情况.【结果和结论】结果显示,慢病毒处理BHK-21获得的转基因细胞中检测shRNA表达;通过O型FMDV接种发现转基因细胞对口蹄疫病毒的复制有明显的抑制,其中在接种后24 h病毒拷贝量仅为普通细胞的1/3;O型FMDV毒株接种于抗口蹄疫慢病毒载体预处理过的3~5日龄乳鼠,在5 LD50滴度下全部乳鼠均存活,在20 LD50滴度下存活率也提高50%.构建的慢病毒介导多shRNA串联表达抗口蹄疫载体能提高BHK-21细胞和乳鼠对口蹄疫病毒的抵抗力,有效地避免了5 LD50滴度内乳鼠的死亡现象,具有抵抗口蹄疫病毒毒性的良好性能.     

植物病毒表达载体pCIYVV／CP／W的构建及GFP表达

[目的]研究了植物病毒表达载体pCIYVV／CP／W的构建及用pClYVV／CP／W表达绿色荧光蛋白（GFP）,为植物反应器生产有用蛋白、开发有效的植物病毒载体提供参考。[方法]用三叶草黄脉病毒侵染性全长cDNA克隆pCIYVV基因组的NIb／CP基因之间的一段多克隆位点和两侧含有病毒蛋白酶NIa切割识别序列的多聚脱氧核糖核苷酸接头,构建pCIYVV／CP／W载体,并将绿色荧光蛋白基因插入pCIYVV／CP／W中构建pCIYVV／CP／W／GFP载体,用反转录PCR对重组病毒克隆转录情况进行检测,并用Western杂交对重组病毒克隆表达的目的基因产物进行测定。[结果]pCIYVV／CP／W／GFP接种的蚕豆幼苗表现出与野生型CIYVV相同的症状,发病率达100％,表明重组病毒克隆pCIYVV／CP／W／GFP．有侵染性,外源基因的插入没有破坏载体pCIYVV／CP／W的开放阅读框;以感染叶总RNA为模板,对pCIYVV／CP／W／GFP表达GFP外源基因的稳定性进行了检测,从F0（重组病毒质粒最初转录出的病毒）一直检测到Fd子代病毒。检测结果表明,外源基因在L子代病毒基因组中稳定存在;以从感染叶中提取的总蛋白为抗原,以GFP抗体为第1抗体,以碱性磷酸酶标记抗体为第2抗体,用Western杂交对重组病毒克隆pCVYVV／CP／W／GFP表达外源蛋白进行了定性检测。从F0一直检测到F4子代病毒。检测结果表明,重组病毒克隆pCIYVV／CP／W／GFP至少到F4子代病毒能稳定表达GFP。     

鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定

[目的]从发病鸡群中分离出鸡传染性支气管炎病毒,并对其进行鉴定。[方法]从安徽某鸡场发病鸡群中分离出鸡传染性支气管炎病毒,采用鸡胚盲传,观察病毒对鸡胚的致病作用。通过动物回归试验,在SPF鸡上复制出支气管堵塞的症状,扩增分离毒株的S1基因片段,并与IBV疫苗毒株进行比较。[结果]对分离到的毒株进行HA检测,结果表明收获的尿囊液对鸡红细胞无凝集活性,说明分离到的病毒中无NDV、AIV等,但经1%胰酶处理则可凝集鸡红细胞,符合传染性支气管炎病毒的生物学特征。该毒株的第6代SPF鸡胚尿囊液通过滴鼻接种SPF鸡,可复制出与现场相似的临床症状,其发生了支气管堵塞的现象,初步证实分离的病毒为一株鸡传染性支气管炎病毒,命名为XZ株。[结论]该研究为鸡传染性支气管炎的防治提供了理论依据。     

鸭源新城疫病毒的分离与鉴定

[目的]分离并鉴定鸭源新城疫病毒。[方法]从安徽地区鸭病料中分离新城疫病毒,测定其鸡胚半数感染量(EID_(50))、鸡胚平均致死时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)。[结果]2株新城疫病毒均为强毒。通过RT-PCR技术对这2株鸭新城疫病毒的F基因进行序列测定与分析,结果发现F基因裂解位点为~(112)RRQKRF~(117),符合NDV强毒株裂解位点氨基酸序列。F基因遗传进化树分析发现,AH1株属于基因Ⅶ型,而AH2株属于基因Ⅵ型,来源于鸽源病毒。[结论]水禽新城疫病毒(NDV)的感染来源复杂,应避免将不同种类的家禽混合饲养。     

植物病毒表达载体pClYVV/CP/W的构建及GFP表达的研究

[目的]研究植物病毒表达载体pC1YVV/CP/W的构建及用pC1YVV/CP/W表达绿色荧光蛋白(GFP),为植物反应器生产有用蛋白、开发有效的植物病毒载体提供参考。[方法]用三叶草黄脉病毒侵染性全长cDNA克隆pC1YVV基因组的Mb/CP基因之间的一段多克隆位点和两侧含有病毒蛋白酶NIa切割识别序列的多聚脱氧核糖核苷酸接头,构建pC1YVV/CP/W载体,并将绿色荧光蛋白基因插入pC1YVV/CP/W中构建pC1YVV/CP/W/GFP载体,用反转录PCR对重组病毒克隆转录情况进行检测,并用Western杂交对重组病毒克隆表达的目的基因产物进行测定。[结果]pC1YVV/CP/W/GFP接种的蚕豆幼苗表现出与野生型C1YVV相同的症状,发病率达100%,表明重组病毒克隆pClYVV/CP/W/GFP有侵染性,外源基因的插入没有破坏载体pClYVV/CP/W的开放阅读框;外源基因在F_4子代病毒基因组中稳定存在;重组病毒克隆pC1YVV/CP/W/GFP至少到F_4子代病毒能稳定表达GFP。[结论]该研究结果为用植物表达有用蛋白提供了有用的植物病毒载体。     

ERO1α慢病毒过表达载体的构建及其在RAW264.7细胞中稳定表达

[目的]构建小鼠ERO1α基因慢病毒过表达载体,并筛选其在RAW264.7细胞中稳定表达。[方法]利用PCR方法扩增ERO1α基因的CDS区并测序;将目的片段亚克隆到慢病毒过表达载体pCD513B-1上,构建pCD513B-ERO1α慢病毒过表达载体;通过病毒包装产生慢病毒并转导RAW264.7细胞;转导后的细胞进行嘌呤霉素抗性筛选,获得稳定表达的细胞;利用RT-qPCR和Western blot方法检测ERO1α的表达效果。[结果]ERO1α慢病毒过表达载体构建成功,病毒滴度为5×10~6～10×10~6 TU/mL;慢病毒成功转导RAW264.7细胞并且稳定高表达。[结论]成功构建ERO1α慢病毒过表达载体,并在RAW264.7细胞中稳定高表达,为进一步研究ERO1α在免疫系统中的功能提供了技术支持。     

以pmf为筛选标记的水稻转基因研究

[目的]建立一种快速、高效的甘露糖安全筛选体系。[方法]以绿色荧光蛋白（GFP）编码基因为报告基因,用农杆菌介导的方法将磷酸甘露糖异构酶基因（pmi）转入水稻品种皖粳97,并对转化和筛选条件进行优化。[结果]受体品种皖粳97,在32oC光照条件下诱导愈伤的出愈率可达90．3％,且生长较快;培养基中甘露糖筛选压力以5∥L蔗糖＋15g／L甘露糖较为适宜,在该条件下筛选21d,进而分化成苗。转化频率可达20．6％。[结论]该研究确立的甘露糖筛选体系,能明显缩短筛选周期、提高转化效率,有利于转基因水稻的安全生产。     

胰蛋白酶浓度对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上增殖的影响

[目的]探讨不同胰蛋白酶浓度对低致病力禽流感病毒在MDCK细胞上增殖后的HA滴度。[方法]通过3株禽流感H9亚型病毒分别接种MDCK细胞单层,加入含有不同胰蛋白酶浓度的DMEM维持液,每隔24 h观察细胞病变,并测定上清液中的HA滴度。[结果]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,培养液上清液中的HA滴度最高,达到7 log2（1∶128）。当病毒的接种浓度为10-3和10-4时,MDCK细胞在96 h几乎全部病变,峰值出现在接种后的72～96 h。[结论]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,有利于H9亚型AIV病毒在MDCK细胞上增殖。     

兰花高频再生体系探究

[目的]为兰花转基因工程研究奠定基础。[方法]以大花蕙兰原球茎、小苗和春兰种子为材料,以MS为基本培养基,将原球茎切成薄片slice、小苗叶片切成小段进行诱导培养,用舍有GFP基因的农杆菌对春兰幼小原球茎进行转化,检测GFP,的瞬间表达。[结果]薄层切片较薄时,褐化和死亡率较高,但从切口处长出的原球茎多而圆;薄层切片较厚时,褐化和死亡率较低,但切口处无再生原球茎产生;对切片进行7d的暗处理可提高薄层的再生率,黑暗中再生的白色原球茎见光培养2～3d后即可转绿,并很快分化出小芽;叶片原球茎仅在叶片基部的居间分生组织处产生;小于1min的类原球茎为最佳转化受体,GFP的瞬间表达率可达60％。[结论]建立了兰花高频再生体系。     

NTE基因ShRNA慢病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建神经病靶酯酶(NTE)蛋白低表达的ShRNA重组慢病毒表达系统。【方法】依照ShRNA序列设计原则设计带酶切位点的NTE ShRNA序列,与表达载体pLL3.7连接构建NTE ShRNA重组表达质粒,转染DH5α菌观察重组表达状况,与pCVM-VSV-G包膜质粒和pCMV-dr8.2dvpr表达质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒。用病毒稀释法以绿色荧光蛋白(GFP)为标记,确定转染效率及病毒含量。【结果】经酶切及测序鉴定结果显示成功构建pLL3.7-NTE ShRNA慢病毒载体。重组慢病毒质粒与辅助质粒共转染293T细胞后获得高表达的细胞,共转染48h后,收集病毒液检测病毒滴度达4.5×10~4/mL。【结论】成功构建NTE ShRNA慢病毒重组表达系统。     

叶下珠抗新城疫病毒活性成分的筛选

[目的]筛选中草药叶下珠中的抗病毒活性成分,为开发治疗禽类病毒性疾病的新药提供条件。[方法]分别用75％乙醇（E）和纯净水（PF）煎煮叶下珠全草,再分别以石油醚（PE）、乙酸乙酯（EA）、正丁醇（BU）萃取其活性成分。将萃取物分别接种鸡胚成纤维细胞（CEF）,观察其对NDV病变的抑制作用;分别接种鸡胚,观察其对NDV血凝效价的影响;分别接种鸡,统计鸡群的死亡率,评价其免疫保护效果。[结果]E-PE、E-BU组萃取物均能明显抑制NDV在CEF细胞上的病变和显著抑制NDV在鸡胚内的增殖（P〈0.05）,以E-BU较好;E-PE、E-BU组的鸡只存活率均极显著高于利巴韦林对照组和生理盐水对照组（P〈0.01）,以E-PE组保护率较高。[结论]叶下珠水提取物效果较差;醇提取物E-PE组和E-BU组能有效抑制NDV病毒病变及其在鸡胚内增殖,对NDV的免疫保护效果较好。     

利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究

试验对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究。结果显示,采用4.0μg.mL-1脂质体转染试剂,1.6μg.mL-1质粒DNA,转染6 h可以获得最佳转染效果,转染效率达4.48%;GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%,GFP阳性胚胎率为48%。结果表明,脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞,获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能。     

转绿色荧光蛋白标记基因猪整合检测的研究

[目的]为转基因猪生产的整合效率、外源目的基因表达水平、目的基因在猪体内组织特异性表达分布等相关领域的进一步研究奠定基础。[方法]用显微注射法将GFP标记的转基因猪表达载体PM1导入湖北白猪和通湖猪1-细胞、2-细胞胚胎中,胚胎移植妊娠后生产仔猪,取耳或尾组织样提取基因组总DNA,用PCR法检测PM1在猪基因组中的整合情况。[结果]在所有生产的78头仔猪中,有6头猪用PCR检测为转PM1基因阳性猪,这6头猪在3次PCR扩增反应中都得到650 bp目的扩增片段。其他样品没有得到目的扩增片段的为阴性猪。[结论]载体PM1可以用于携带外源基因进行转基因猪生产。     

不同温度下蓝舌病病毒的毒价变化研究

[目的]为蓝舌病病毒的长期保存奠定基础。[方法]在70、-20、4和20℃下保存蓝舌病病毒1个月后,测定其毒价变化,研究不同温度对蓝舌病病毒毒价的影响。[结果]在室温和4℃下保存1个月后蓝舌病病毒毒价保持不变。在-70℃下保存1个月后蓝舌病病毒毒价从原来的5.5降至4.2。在-20℃下保存1个月蓝舌病病毒毒价变化最大,从原来的5.5降至2.8。[结论]长期保存时,应将蓝舌病病毒在-20℃下保存。